劉 敏 徐 杰 康 婷 段 偉 張 璐

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卵巢癌組織中VEGF及MVD表達(dá)及其臨床意義

劉 敏 徐 杰 康 婷 段 偉 張 璐

目的 分析微血管密度(MVD)以及卵巢上皮性腫瘤血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)與卵巢癌臨床病理因素的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。方法 選取手術(shù)切除的卵巢上皮性腫瘤標(biāo)本88例以及正常卵巢組織標(biāo)本35例，采用免疫組化染色方法檢測所有標(biāo)本中VEGF及MVD的表達(dá)情況，分析兩者相關(guān)性及與卵巢上皮性腫瘤臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果 VEGF在卵巢癌組織中的表達(dá)陽性率為92.0%及MVD平均值為(30.26±8.69)，顯著高于良性卵巢上皮性腫瘤組織VEGF的陽性表達(dá)率[52.6%，(11.52±3.46)](P<0.05)；而良性卵巢上皮性腫瘤組織中VEGF陽性表達(dá)率及MVD平均值均高于正常對照組(P<0.05)。VEGF陽性表達(dá)的卵巢癌組織中MVD平均值顯著高于VEGF陰性表達(dá)者，VEGF陽性表達(dá)與MVD平均值呈正相關(guān)(P<0.05)。卵巢癌組織中VEGF陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期及細(xì)胞分化程度存在明顯相關(guān)性(P<0.05)，而與腫瘤直徑、組織學(xué)類型以及患者年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)。MVD與腫瘤臨床病理特征無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 VEGF及MVD均能反映卵巢上皮性腫瘤的良惡性和惡性進(jìn)展程度，并可能成為卵巢癌臨床生物學(xué)治療的參考指標(biāo)。

卵巢上皮性腫瘤；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1069～1072)

近年來，大量實驗表明卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展過程(包括生長、侵襲及轉(zhuǎn)移等)受諸多因素影響，且復(fù)雜多步驟。有研究表明[1]，要是無新生血管，實體腫瘤即在2 mm內(nèi)。腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)新生血管生成是通過合成和分泌血管內(nèi)皮生長因子完成的，其作為高度特異性腫瘤血管發(fā)生過程中的主要正性調(diào)控因子，作用于特異性受體，使其發(fā)揮出生物學(xué)功能[2-3]，具有增加血管通透性產(chǎn)生腹水和促進(jìn)血管增生的作用。而微血管密度(microvessel density,MVD)與腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，是準(zhǔn)確衡量血管新生情況的重要參數(shù)。本研究通過免疫組化技術(shù)分析卵巢腫瘤中VEGF的表達(dá)情況及進(jìn)行MVD計數(shù)，探討兩者與腫瘤患者臨床病理特征(包括病理分級、臨床分期以及組織學(xué)類型)的關(guān)系，以及兩者作為診斷卵巢癌、指導(dǎo)治療及判斷癌癥預(yù)后中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院婦產(chǎn)科2012年1月至2014年12月期間手術(shù)治療卵巢上皮性腫瘤患者且具有完整臨床病理資料的卵巢腫瘤標(biāo)本88例以及正常卵巢組織標(biāo)本35例，所有標(biāo)本均經(jīng)手術(shù)及病理證實。其中卵巢惡性腫瘤50例，患者年齡25～70歲，平均49.7歲；按WHO1998年分類法分為漿液性癌19例，粘液性癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌7例，透明細(xì)胞癌8例。病理分級：G1級17例，G2級19例，G3級14例。按照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)(2004年)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期28例。良性卵巢腫瘤38例，患者年齡26～70歲，平均年齡50.3歲；其中漿液性囊腺瘤23例，粘液性囊腺瘤15例。正常對照35例，患者年齡25～72歲，平均年齡48.1歲，均為因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)同時切除卵巢的患者。3組患者在一般情況方面具有可比性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與方法

全部標(biāo)本均采用福爾馬林進(jìn)行固定，劑量為10%。而后使用酒精進(jìn)行脫水，以及石蠟包埋。然后進(jìn)行4～5 μm連續(xù)切片，最后用3%濃度的過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，加入一抗(鼠抗人CD34單克隆抗體或鼠抗人VEGF單克隆抗體) 37 ℃孵育1 h，二抗 37 ℃孵育20 min。免疫組織化學(xué)二步法染色，均按說明書進(jìn)行。每次試驗均設(shè)陰性對照，以PBS代替一抗染色，陽性對照參照公司提供的陽性片。SABC免疫組織化學(xué)二步法試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

VEGF陽性判讀：VEGF表達(dá)陽線呈棕黃色顆粒分布，定位于腫瘤細(xì)胞胞膜。選取最密集區(qū)的1000個腫瘤細(xì)胞，VEGF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)<10%為(-)，表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)在10%～50%為(+ )，>50%為(+ + )。

MVD結(jié)果判讀依照Weidner等[4]及Jackson等[5]研究所得的方法，在低倍鏡下掃視CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的整個組織切片，每例需選取腫瘤浸潤區(qū)域的五個微血管數(shù)量密集且內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰的視野，然后轉(zhuǎn)至高倍鏡計數(shù)染色的微血管數(shù)，并以其平均數(shù)作為MVD。腫瘤組織內(nèi)任何染成棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞叢或內(nèi)皮細(xì)胞均作為微血管計數(shù)。管腔大于8 個紅細(xì)胞大小、炎癥、肉芽、壞死區(qū)、帶有較厚肌層的血管及靜脈竇均不計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VEGF及MVD蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

VEGF表達(dá)于血管中及卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色細(xì)顆粒，陽性細(xì)胞分布具有明顯的異質(zhì)性，呈局灶性或彌漫性，其表達(dá)與卵巢癌患者年齡、腫瘤直徑及組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性(P>0.05)，但VEGF表達(dá)與其FIGO分期及病理分級顯著相關(guān)(P<0.05)，隨其病理分級及臨床分期升高，VEGF表達(dá)增強(qiáng)，低分化卵巢癌組織中VEGF表達(dá)水平明顯高于中高分化者，卵巢癌組織分化程度越低、FIGO分期越晚，即卵巢癌惡性程度越高；VEGF在卵巢癌組織中表達(dá)率為92.0%。上皮性卵巢癌組織中MVD值與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、病理分級以及FIGO臨床分期等無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

2.2 正常卵巢組織與上皮性卵巢腫瘤組織中VEGF及MVD蛋白表達(dá)比較

3組MVD平均值及VEGF表達(dá)陽性率均有顯著性差異，卵巢上皮性腫瘤中50例惡性腫瘤的MVD平均值為(30.26±8.69)，VEGF陽性表達(dá)率為92.0%，38例良性腫瘤的MVD平均值為(11.52±3.46)，VEGF陽性表達(dá)率為52.6%；35例正常對照卵巢組織MVD平均值為(4.37±1.1)，VEGF陽性表達(dá)率為0。惡性卵巢上皮性腫瘤的MVD平均值及VEGF陽性表達(dá)率均明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤 (t=12.55，P<0.001；χ2=17.85，P<0.001)。良性卵巢上皮性腫瘤的MVD平均值及VEGF陽性表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.69，P<0.001；χ2=25.37，P<0.001)。

2.3 上皮性卵巢癌組織中MVD與VEGF的相關(guān)性

VEGF陽性表達(dá)組MVD平均值為(30.26±8.69)，顯著高于VEGF表達(dá)陰性組(6.29±3.15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.44，P<0.001) 。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析，在上皮性惡性卵巢腫瘤組織中，MVD與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(γs=0.462，P<0.05)。

表1 VEGF及MVD蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

腫瘤血管新生是指既存血管網(wǎng)向腫瘤及腫瘤內(nèi)部形成新的毛細(xì)血管的過程，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，是腫瘤進(jìn)行代謝，完成增殖不可缺少的內(nèi)容[6]，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要表現(xiàn)。它甚至直接影響腫瘤的治療及預(yù)后，是腫瘤進(jìn)展的重要因素，影響腫瘤的生物學(xué)行為[7]。腫瘤轉(zhuǎn)移與血管新生緊密相關(guān)，新生血管壁其結(jié)構(gòu)缺乏完整性，一般薄弱，僅存一層內(nèi)皮細(xì)胞，且其基底膜薄弱或缺如且缺乏平滑肌，因此較成熟血管而言，前者更易被腫瘤血管穿透[8]。首先腫瘤細(xì)胞能沿本身具有組織侵襲性的新生血管所開啟的膠原裂隙侵襲周圍組織[9]。其次腫瘤細(xì)胞通過釋放膠原酶，誘導(dǎo)組織纖維蛋白生成，游離腫瘤細(xì)胞就通過這種形成的擴(kuò)散和遷移所必需的基質(zhì)遷移入血液，在較遠(yuǎn)部位形成轉(zhuǎn)移灶[10]。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管新生促進(jìn)因子，是1種相對分子質(zhì)量為30～45 ku的糖基化分泌性多肽因子，也是是1種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素。在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF通過旁分泌或自分泌機(jī)制，不僅作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性受體而誘導(dǎo)血管形成，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)作用[11]，間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，還能作用于腫瘤細(xì)胞上的受體，直接促進(jìn)腫瘤生長。目前已知的VEGF功能主要有：①增加小靜脈或微靜脈的通透性，利于蛋白質(zhì)大分子外滲形成纖維蛋白原，用以支持內(nèi)皮細(xì)胞生長。②促進(jìn)血管的內(nèi)皮細(xì)胞變形、增殖以及轉(zhuǎn)移，進(jìn)入膠原生成新的血管。③激活促凝血活性，形成血栓[12]。④促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞生長。VEGF發(fā)揮其內(nèi)皮相關(guān)功能是基于與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，不僅促進(jìn)血管生成，利于內(nèi)皮細(xì)胞移動，更便于腫瘤細(xì)胞脫落，擴(kuò)散進(jìn)入血管或臨近組織，實現(xiàn)腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，VEGF的高表達(dá)為腫瘤細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移提供條件，而微血管形成是腫瘤細(xì)胞獲得血管生長能力，誘導(dǎo)毛細(xì)血管生成而建立血液循環(huán)的過程。MVD也因此被認(rèn)為是能代表腫瘤血管生成的定量指標(biāo)，它與腫瘤的供氧及營養(yǎng)密切相關(guān)，很大程度上反映癌灶的浸潤及轉(zhuǎn)移能力。國內(nèi)外學(xué)者提出的腫瘤血管依賴性學(xué)說是認(rèn)為血管新生機(jī)制一旦觸發(fā)，無論在實體腫瘤細(xì)胞生長的血管形成前期或血管浸潤生長期，癌細(xì)胞的無限制生長態(tài)勢必將不可控制。目前應(yīng)用于定量研究人體MVD，針對血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原的第Ⅷ因子、CD31以及CD34等的單克隆抗體技術(shù)已非常成熟。

本研究結(jié)果顯示，VEGF在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中基本無表達(dá)，主要在卵巢腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。VEGF在正常卵巢組織中表達(dá)量少且MVD平均值相對較低，在上皮性卵巢癌中VEGF陽性表達(dá)及MVD陽性平均值較上皮性卵巢良性腫瘤顯著增高(P<0.05)，且VEGF陽性表達(dá)的上皮性卵巢惡性腫瘤中MVD陽性平均值顯著高于VEGF陰性表達(dá)者，隨著VEGF陽性表達(dá)的增強(qiáng)，癌灶中相應(yīng)的MVD陽性平均值增高，兩者呈典型正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。該結(jié)果提示，MVD與VEGF在上皮性卵巢癌的血管生成及癌灶浸潤轉(zhuǎn)移中具有內(nèi)在關(guān)系，MVD也因此成為判斷卵巢腫瘤良惡性、腫瘤進(jìn)展程度、癌癥預(yù)后的重要依據(jù)及判斷VEGF水平抗血管生成療法療效的重要工具。但研究發(fā)現(xiàn)MVD表達(dá)情況與上皮性卵巢癌組織學(xué)類型、臨床分期及腫瘤分化等無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果還提示細(xì)胞低分化的上皮性卵巢癌組織中VEGF陽性表達(dá)率高于細(xì)胞高分化者，Ⅰ～Ⅱ期上皮性卵巢癌組織中VEGF陽性表達(dá)率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期患者的癌灶組織，這說明VEGF陽性表達(dá)差異能成為腫瘤良惡性鑒別的基礎(chǔ)，測定卵巢組織中VEGF表達(dá)能指導(dǎo)臨床篩選高危卵巢上皮癌患者。研究另外還顯示腫瘤患者組織學(xué)類型與VEGF陽性表達(dá)率基本無相關(guān)性。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Significance of Vascular Endothelial Growth Factor Expression and Microvessel Density in Ovarian Cancer

LIUMin,XUJie,KANGTing,etal.AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yanan,716000

Objective To analyze the relationship between microvessel density (MVD) and the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ovarian epithelial tumors.Methods Expressions of VEGF and MVD were examined by immunohistochemical technique in ovarian tissue of benign(50 cases) and malignant(38 cases) epithelial ovarian tumor.The relationship with clinicopathologic factors were investigated.Results The positive rate of VEGF expression was 92.0% and MVD was 30.26±8.69 in malignant tumor,which was significantly higher than those of benign tumor (52.6%,11.52±3.46 respectively) (P<0.05).The average MVD was higher in the malignant cases with positive expression of VEGF than those without expression of VEGF (P<0.05).The expression of VEGF was positively related to the average MVD.The expression of VEGF and MVD were closely related to the tumor.There were significant associations between the VEGF expression and clinical stage and pathological grade (P<0.05),but not related with histological type(P>0.05).MVD was not related with clinicopathologic parameters.Conclusion VEGF and MVD can reflect the benign and malignant ovarian tumors and their progress,and may provide valuable markers for estimating the prognosis of the ovarian epithelial tumors.

Ovarian epithelial tumor;Vascular endothelial growth factor(VEGF);Microvessel density(MVD)

716000 延安大學(xué)附屬醫(yī)院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.008

R737.31

A

1001-5930(2017)07-1069-04

2016-08-08

2017-04-20)