劉瑞青 李醒亞 曹會(huì)存 李 輝 曹廣劭 劉建文 吳方明 劉玉巖 劉 健 陳利娟

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TTF-1和SPA表達(dá)對(duì)早期肺腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測及預(yù)后的判斷價(jià)值

劉瑞青 李醒亞 曹會(huì)存 李 輝 曹廣劭 劉建文 吳方明 劉玉巖 劉 健 陳利娟

目的 研究術(shù)后肺腺癌患者組織中TTF-1和SPA的蛋白表達(dá)對(duì)其復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值及預(yù)后的影響。方法

收集行手術(shù)切除的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者112例，采用免疫組化方法檢測組織中TTF-1以及SPA的表達(dá)。結(jié)果 68例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，TTF-1陽性和陰性表達(dá)患者中位DFS分別為41個(gè)月和9個(gè)月(P=0.013)，中位OS分別為65.0和23.0個(gè)月(P=0.037)，SPA陽性與陰性表達(dá)患者中位DFS分別為59.0個(gè)月和15.0個(gè)月 (P=0.018)，中位OS分別為68.0個(gè)月和35.0個(gè)月(P=0.058)。結(jié)論 早期肺腺癌術(shù)后組織中TTF-1和SPA的表達(dá)是其復(fù)發(fā)的有效預(yù)測指標(biāo)，TTF-1陽性表達(dá)預(yù)后更好。

肺腺癌；甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子；表面活性蛋白A；無疾病進(jìn)展生存期；生存期

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1048～1051)

甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(thyroid transcription factor-1,TTF-1)屬于核轉(zhuǎn)錄因子NKx-2家族成員，在甲狀腺、肺和前腦的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[1]，目前組織中TTF-1的表達(dá)多用于鑒別原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性肺癌，以及肺腺癌與肺鱗癌。多項(xiàng)研究證明TTF-1的陽性表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的有利的預(yù)后因子[2-3]。表面活性物質(zhì)A(surfactant protein-A,SPA)由磷脂和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，具有降低肺泡表面張力的作用[4]，其基因缺失與肺癌預(yù)后相關(guān)[5],我們前期研究顯示組織中TTF-1的表達(dá)能預(yù)測EGFR突變[6]，肺腺癌亞型與TTF-1的表達(dá)以及EGFR突變密切相關(guān)[7]。

NSCLC的發(fā)病率和死亡率逐年升高，盡管手術(shù)切除能有效提高早期肺癌患者的生存率，但術(shù)后復(fù)發(fā)仍是延長生存期的一大障礙。2012年我們對(duì)該批數(shù)據(jù)進(jìn)行術(shù)后2年的隨訪，復(fù)發(fā)人數(shù)不到一半，無法計(jì)算中位DFS以及OS，目前距離手術(shù)近6年時(shí)間，再次進(jìn)行隨訪，旨在討論組織中TTF-1、SPA的表達(dá)對(duì)肺腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值和預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2010年1月到2011年12月在河南省腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除治療的肺腺癌患者117例，其中5例不符合入選標(biāo)準(zhǔn)。其中男性61例，女性51例，中位年齡58(38～78)歲，非吸煙65例，吸煙47例，所有患者均按UICC(2009)第七版分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期53例，Ⅱ期27例，Ⅲ期32例，腫塊最大直徑中位值為4 cm(2～10 cm)，接受輔助治療64例，未接受輔助治療48例，輔助治療包括全身化療、局部放療以及生物治療等,復(fù)發(fā)后接受TKI靶向藥物治療20例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者取標(biāo)本前進(jìn)行化療或者放療等抗腫瘤治療，②術(shù)后短時(shí)間內(nèi)因?yàn)榉悄[瘤因素死亡，③術(shù)后病理分期為Ⅳ期患者，④術(shù)后病理證實(shí)為非腺癌。

1.1.1 蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(scorpions amplificiation refractory mutation system,scorpions ARMS)即時(shí)熒光PCR檢測組織中EGFR狀態(tài)的方法及判讀標(biāo)準(zhǔn) 石蠟組織切取4 μm 厚度的切片5張，提取DNA，檢測DNA的濃度和純度，然后擴(kuò)增(引物由廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司合成)，可檢測19(Del E746-A750和Del E746-A750)和21(L858R)外顯子3個(gè)位點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán);93 ℃ 25 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 20 s,26個(gè)循環(huán)；采用美國Stratagene 公司的Mx3000P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀收集信號(hào)。每次反應(yīng)都設(shè)置陽性及陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后即時(shí)PCR儀自動(dòng)以擴(kuò)增曲線的形式輸出結(jié)果。

1.1.2 免疫組化檢測組織中TTF-1和SPA表達(dá)的方法以及判讀標(biāo)準(zhǔn) 石蠟包埋組織塊進(jìn)行4 μm連續(xù)切片，脫蠟，高壓修復(fù)抗原(40 s)，自然冷卻，滴加1∶100稀釋的鼠抗人TTF-1單克隆抗體(8G7G3/1)或1∶75的鼠抗人SPA單克隆抗體(PE-10)，4 ℃過夜。室溫下恢復(fù)40 min，滴加即用型二抗(Kit-5020,MaxVision TM試劑盒(鼠/兔)，DAB(DAB-0031)顯色，經(jīng)PBS液清洗后，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，晾干，封片，在顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，陽性對(duì)照采用福州邁新公司提供的陽性組化切片。一抗、二抗和DAB試劑均購于福州邁新公司。TTF-1和SPA的陽性判讀詳見參考文獻(xiàn)[10]。

1.2 隨訪

通過門診、電話或信函進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者病情、復(fù)發(fā)時(shí)間以及轉(zhuǎn)移部位，末次隨訪時(shí)間為2016年5月20日。1例患者失訪，按隨訪截止日期死亡分析。無病生存期(disease-free survival，DFS)是指手術(shù)日至術(shù)后第一次隨訪出現(xiàn)復(fù)發(fā)證據(jù)的生存時(shí)間。生存期(overall survival，OS)指從手術(shù)日開始至因任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各因素與復(fù)發(fā)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier曲線(Log-rank法)比較各因素對(duì)DFS對(duì)OS的影響，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后隨訪以及復(fù)發(fā)情況

中位隨訪時(shí)間為44.0個(gè)月，1年、3年和5年無疾病進(jìn)展生存率分別為59.0%、46.0%和35.0%，中位DFS為34.9個(gè)月，1年、3年和5年累計(jì)生存率分別為77.0%。57.0%43.0%，中位OS為57.7個(gè)月。112例早期術(shù)后肺腺癌患者中有68(60.7%)例復(fù)發(fā)，局部復(fù)發(fā)23例，遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)45例，包括骨轉(zhuǎn)移17例，腦轉(zhuǎn)移15例，6例出現(xiàn)腎上腺轉(zhuǎn)移，8例肝轉(zhuǎn)移，2例胃轉(zhuǎn)移，12例為兩處以上轉(zhuǎn)移。

TTF-1陽性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率為57.7%(56/97)，明顯低于陰性表達(dá)患者[80.0% (12/15)]；SPA陽性患者復(fù)發(fā)率為54.9%(39/71)，低于陰性表達(dá)患者[70.7%(29/41)]；淋巴結(jié)陰性患者復(fù)發(fā)率為47.8%(33/69)，明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者[81.4%(35/43)]，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者復(fù)發(fā)率分別為47.2%(25/53)、55.6%(15/27)和87.6%(28/32)。

2.2 術(shù)后肺腺癌組織中TTF-1表達(dá)對(duì)DFS和OS的影響

112例早期肺腺癌患者中TTF-1陽性表達(dá)為97例(86.6%)，其中TTF-1陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者術(shù)后中位DFS分別為：41.0個(gè)月和9.0個(gè)月(P=0.013，圖1)。中位OS分別為65.0和23.0個(gè)月(P=0.037，圖1)；TTF-1陰性表達(dá)的I期(IA和IB期共53例)肺腺癌患者術(shù)后中位DFS和OS分別為9.0和66個(gè)月，陽性表達(dá)者中位DFS和OS未出來(P=0.067和P=2.33)，見圖2。

2.3 術(shù)后肺腺癌組織中SPA表達(dá)對(duì)DFS的影響

112例肺腺癌患者中SPA陽性表達(dá)共71例，占63.4%(71/112)。其中SPA陽性表達(dá)與陰性表達(dá)Ⅰ～Ⅲ期肺腺患者平均DFS分別為59.0個(gè)月和15.0個(gè)月 (P=0.018，圖3)，中位OS分別為68.0和35.0個(gè)月(P=0.058)。

圖1 早期肺腺癌DFS和OS的K-M曲線圖

圖2 Ⅰ期肺腺癌DFS的K-M曲線圖

圖3 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS K-M曲線圖

2.4 其他指標(biāo)對(duì)DFS和OS的影響

Ⅰ期患者53例，其中ⅠA期17例，ⅠB期36例，Ⅱ期27例，其中ⅡA期19例，ⅡB期8例，Ⅲ期32例，ⅢA期28例，ⅢB期4例。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期中位DFS分別為69.0、23.0和13.0個(gè)月(P=0.000，圖4)，Ⅰ期中位OS未出來，Ⅱ和Ⅲ期中位OS分別為58.0和24.0個(gè)月(P=0.000，圖4)。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中位DFS分別為67.0和13.0個(gè)月,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中位OS未出來，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中位OS為24個(gè)月。此外還對(duì)年齡、性別、吸煙史以及腫瘤直徑對(duì)DFS和OS的影響進(jìn)行分析，見表1。

表1 肺腺癌臨床特征及各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)DFS和OS的影響

圖4 Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌DFS和OS K-M曲線圖

3 討論

該批數(shù)據(jù)顯示TTF-1在早期(Ⅰ～Ⅲ期)肺腺癌中表達(dá)率為86.6%，組織中TTF-1陽性表達(dá)患者較陰性表達(dá)患者復(fù)發(fā)率低，DFS和OS更長。我們將該批數(shù)據(jù)53例Ⅰ期單獨(dú)拿出來研究，發(fā)現(xiàn)TTF-1陽性表達(dá)在ⅠA和ⅠB中對(duì)復(fù)發(fā)的影響較預(yù)后的影響大。以往研究顯示組織中TTF-1陽性表達(dá)的NSCLC患者生存期或無疾病進(jìn)展期更長[2-3]。關(guān)于TTF-1的表達(dá)與NSCLC的生存期的關(guān)系的機(jī)制尚不十分清楚，基礎(chǔ)研究顯示TTF-1的轉(zhuǎn)錄靶向因子肌球蛋白結(jié)合蛋白(myosin binding protein H，MYBHP)能抑制ROCK1(physical interaction with Rho kinase 1)并且負(fù)向調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白的結(jié)構(gòu)，減少單個(gè)細(xì)胞的游動(dòng)，增加集體細(xì)胞的遷移，最終導(dǎo)致減少細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移[8]。中國有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中TTF-1的表達(dá)能抑制Ki-67的表達(dá)并且誘導(dǎo)凋亡。臨床研究顯示早期NSCLC患者中TTF-1陽性表達(dá)是1個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子[9]。并且我們前期研究發(fā)現(xiàn)組織中TTF-1的表達(dá)能預(yù)測EGFR突變狀態(tài)[6]，是否EGFR突變情況也影響復(fù)發(fā)和預(yù)后有待進(jìn)一步研究。也有文獻(xiàn)顯示亞裔人群TTF-1的表達(dá)率高于西方人群的表達(dá)，這與亞裔人群EGFR突變率高相吻合。從基礎(chǔ)到臨床均顯示組織中TTF-1陽性表達(dá)是NSCLC有利預(yù)后因子。我們對(duì)一批早期肺腺癌患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，TTF-1陽性表達(dá)的確有更好的預(yù)后，而且有更好的DFS，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，陰性表達(dá)復(fù)發(fā)率更高，從而提示組織中TTF-1陰性表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)。

SPA是肺呼吸上皮細(xì)胞分泌的1種糖蛋白，調(diào)節(jié)肺表面活性物質(zhì)功能的正常發(fā)揮，在維持肺功能發(fā)揮重要作用，該批數(shù)據(jù)中顯示SPA在肺腺癌中表達(dá)率為63.4%，陽性表達(dá)患者DFS優(yōu)于陰性患者。我們前期研究也提示SPA陽性表達(dá)預(yù)測EGFR突變，但沒有TTF-1與EGFR突變關(guān)系密切。有文獻(xiàn)報(bào)道，肺腺癌中SPA基因缺失與吸煙史以及腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，是肺癌不良的預(yù)后因子[5]。可能因?yàn)镾PA的表達(dá)對(duì)肺功能的影響較大，它參與局部炎癥和免疫反應(yīng)，異常改變將導(dǎo)致許多肺部疾病，如果SPA缺乏，可能會(huì)影響肺腺癌患者的肺功能，進(jìn)而出現(xiàn)SPA陰性表達(dá)的術(shù)后Ⅰ～Ⅲ期肺腺癌患者DFS較差。

目前臨床上TTF-1作為病理中區(qū)分肺原發(fā)性和轉(zhuǎn)移癌、肺腺癌與肺鱗癌1個(gè)常用的免疫組化指標(biāo)，根據(jù)以往文獻(xiàn)以及我們本次研究均提示TTF-1的表達(dá)預(yù)測復(fù)發(fā)，影響預(yù)后，我們能否將TTF-1陰性作為1種亞型特殊對(duì)待，或把TTF-1陰性表達(dá)作為1個(gè)高危因素，即使期別較早，也給與干預(yù)，如輔助化療，減少復(fù)發(fā)發(fā)生，提高生存期。但我們這批數(shù)據(jù)中17例ⅠA期患者TTF-1均為陽性表達(dá)，可能主要影響ⅠB期的復(fù)發(fā)情況。也許樣本量太少的緣故，這也是本研究的缺點(diǎn)。此外該研究還有缺點(diǎn)，我們分析組織中TTF-1和SPA的表達(dá)，與基因擴(kuò)增相比，可能敏感度比較低。

除了組織中TTF-1和SPA與DFS和OS的關(guān)系，我們也分析了性別、年齡、吸煙史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫塊大小以及TNM分期對(duì)復(fù)發(fā)以及預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫塊大小以及TNM分期對(duì)以上兩者影響差異顯著，再次證實(shí)了分期預(yù)測復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后的地位。

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(編輯：吳小紅)

The Predictive Value of the Expressions of TTF-1 and SPA Protein on the Recurrence and Prognosis of Lung Adenocarinoma after Surgery

LIURuiqing,LIXingya,CAOHuicun,etal.TheAffiliatedPeople'sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanPeople'sHospital,Zhengzhou,450000

Objective To study the predictive value of the expressions of TTF-1 and SPA protein on the recurrence and prognosis of lung adenocarinoma after surgery.Methods 112 cases of stage Ⅰ～Ⅲ lung adenocarcinoma were selected.The expressions of TTF-1 and SPA protein in tissues were detected by immunohistochemical detection.Results 68 cases had recurrence,median DFS of patients with positive and negative expression of TTF-1 were respectively 41 months and 9 months (P=0.013),the median OS were 65.0 months and 23.0 months respectively (P=0.037),median DFS of patients with positive and negative expression of SPA were respectively 59.0 months and 15.0 months (P=0.018),the median and OS were respectively 68.0 and 35.0 months (P=0.058).Conclusion The expression of TTF-1 and SPA in postoperative lung adenocarcinoma are effective predictors of recurrence.The patients with positive expression of TTF-1 have better prognosis.

Lung adenocarinoma;TTF-1;SPA;DFS;OS

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：21504082)

450000 鄭州大學(xué)附屬人民醫(yī)院，河南省人民醫(yī)院(劉瑞青，曹會(huì)存，李 輝，曹廣劭，劉建文，吳方明，劉玉巖，劉 健)；450000 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(李醒亞)；450000 河南省腫瘤醫(yī)院(陳利娟)

劉 健

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.07.002

R734.2

A

1001-5930(2017)07-1048-04

2016-08-19

2017-04-20)