彭賢慧，周麗雅，何利華，宋志強(qiáng)，張建中

1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.浙江省杭州市感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心； 3.北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科

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幽門螺桿菌感染者胃內(nèi)菌群特征分析

彭賢慧1，2，周麗雅3，何利華1，2，宋志強(qiáng)3，張建中1，2

1.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.浙江省杭州市感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心； 3.北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科

目的 通過(guò)比較幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染者和H.pylori陰性健康人群胃內(nèi)菌群差異，探討H.pylori對(duì)胃內(nèi)菌群的影響。方法 30例H.pylori感染者和30名H.pylori陰性健康志愿者胃黏膜標(biāo)本，經(jīng)組織研磨勻漿后提取基因組，對(duì)16S rDNA基因V3-V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建小片段文庫(kù)，基于Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)，利用250 bp Paired-End的方法進(jìn)行雙末端測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)生物信息處理后，得到有效序列，以97%一致性將序列聚類成為OTUs，經(jīng)聚類及物種注釋后獲得每個(gè)樣本在各分類水平的分布情況。比較分析兩組樣品α多樣性差異和β多樣性差異。統(tǒng)計(jì)分析兩組在各分類水平相對(duì)豐度變化情況。尋找因H.pylori感染引起相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化的物種。結(jié)果 與H.pylori陰性對(duì)照組相比，H.pylori陽(yáng)性組α多樣性顯著降低。β多樣性結(jié)果顯示，組內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)相似度高，而組間的菌群相似度較低。H.pylori陰性對(duì)照組內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為Shewanella、Streptococcus、Escherichia、Pseudomonas、Prevotella、Neisseria、Oscillospira；而H.pylori陽(yáng)性組內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬為Helicobacter、Prevotella、Pseudomonas、Fusobacterium和Streptococcus。H.pylori陽(yáng)性組內(nèi)Streptococcus、Prevotella、Fusobacterium、Campylobacter、Porphyromonas、Rothia、Neisseria、Heamophilus[Prevotella]、Veillonella、Leptotrichia、Actinomyces、Bulleidia相對(duì)豐度顯著升高；而陰性對(duì)照組Shewanella顯著升高。結(jié)論H.pylori能夠顯著影響胃黏膜菌群結(jié)構(gòu)，H.pylori可能與胃內(nèi)菌群共同促進(jìn)消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。

幽門螺桿菌；胃黏膜菌群；高通量測(cè)序

長(zhǎng)久以來(lái)，由于胃酸屏障，人們認(rèn)為胃內(nèi)是無(wú)菌的。然而1983年，Marshall和Warren共同發(fā)現(xiàn)了一種螺旋狀的革蘭氏陰性菌，即幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，該菌的發(fā)現(xiàn)徹底改變這一觀念。研究表明這一古老的病原體與人類共同進(jìn)化的歷史超過(guò)60 000多年。全球超過(guò)一半的人口感染H.pylori，多數(shù)為無(wú)癥狀感染，約10%的人發(fā)展為消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等[1-3]。H.pylori感染機(jī)體后為何會(huì)產(chǎn)生不同癥狀，其致病機(jī)制仍不明確。越來(lái)越多證據(jù)表明，H.pylori菌株[2-4]、宿主[1-3]、環(huán)境[2]等多方面因素共同決定了疾病的發(fā)生、發(fā)展。胃內(nèi)菌群作為胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，通過(guò)多種調(diào)控途徑維持胃內(nèi)環(huán)境的平衡[5]。一旦菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這種平衡勢(shì)必被打破，就會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[6]。H.pylori作為胃內(nèi)最重要的定植菌，是否影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)及如何影響胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，解決這些問(wèn)題有助于探究H.pylori的致病機(jī)理及為H.pylori相關(guān)疾病的治療提供新思路。

本研究選擇首次施行內(nèi)鏡檢測(cè)并未接受任何藥物治療的消化不良患者為研究對(duì)象，根據(jù)H.pylori特異基因熒光定量PCR判定胃黏膜樣本H.pylori感染狀況，將樣本分為H.pylori陽(yáng)性組和H.pylori陰性對(duì)照組。通過(guò)基于Illumina Hiseq 2000測(cè)序平臺(tái)，利用Pair-end雙末端測(cè)序法，對(duì)細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，比較H.pylori陽(yáng)性組和H.pylori陰性對(duì)照組菌群差異，探索因H.pylori感染引起的菌群結(jié)構(gòu)和組成的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年3月北京大學(xué)第三醫(yī)院消化內(nèi)科H.pylori陽(yáng)性患者30例，H.pylori陰性健康志愿者30名。納入標(biāo)準(zhǔn)：H.pylori陽(yáng)性組(HP組)：13C呼氣試驗(yàn)陽(yáng)性、PCR陽(yáng)性。H.pylori陰性對(duì)照組(HN組)：13C呼氣試驗(yàn)陰性、PCR陰性。所有受試者1個(gè)月內(nèi)未服用抗生素、微生態(tài)制劑、質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑等影響胃內(nèi)菌群的藥物。HP組男18例，女12例，年齡(41.3±12.5)歲(24～68歲)；HN組男16名，女14名，年齡(38.9±12.1)歲(20～69歲)。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑 QIAamp?DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs，USA)；Qiagen Gel Extraction Kit(QIAGEN，Germany)；TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina，USA)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集：受試者簽署知情同意書后，胃鏡下分別鉗取受試者胃竇、胃體黏膜活檢樣本各1塊，大小約1 mm×2 mm。取材后標(biāo)本置于無(wú)菌凍存管中并加入500 μl生理鹽水，立即于-80 ℃保存。

1.3.2 基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序：將胃黏膜組織連同生理鹽水轉(zhuǎn)移至組織研磨器進(jìn)行組織勻漿，使用試劑盒QIAamp?DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)獲取樣本總DNA，具體操作步驟見說(shuō)明書。提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和純度。以此為模板，采用帶Barcode的特異性引物對(duì)16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)。擴(kuò)增子經(jīng)純化、文庫(kù)制備后進(jìn)行定量，所有擴(kuò)增子等量混合建庫(kù)，本研究基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序(Paired-End)的方法， 對(duì)構(gòu)建的小片段文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理：使用QIIME(Version 1.7.0)軟件對(duì)低質(zhì)量下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)過(guò)拆分、截取、過(guò)濾、去除嵌合體后最終獲得有效數(shù)據(jù)，然后利用Uparse軟件對(duì)所有有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)，選擇出現(xiàn)頻率最高的OTUs作為代表序列。利用RDP Classifier(Version 2.2)和Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代表OTUs進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8～1)，分別在各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。后續(xù)的α多樣性分析和β多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。對(duì)各樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，以樣品中數(shù)量最少的作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，后續(xù)的α多樣性分析和β多樣性分析都是基于均一化處理后的數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 單樣品的多樣性(α多樣性)分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其中用于計(jì)算菌群多樣性的指數(shù)有Shannon和Simpson，計(jì)算菌群豐度的指數(shù)有Chao1和ACE。統(tǒng)計(jì)各樣本在各分類群的分布情況，并用柱狀圖進(jìn)行可視化展示。用稀釋曲線(Rarefaction curve)來(lái)反映測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性和間接展示樣品中物種豐富度。One-wayANOVA比較HP組和HN組α多樣性指數(shù)的差異。基于系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的Weighted Unifrac距離可用于衡量群落之間的差異大小?；赪eighted Unifrac 距離的NMDS分析用于反映不同分組樣本間的差異(β多樣性)。為了研究樣本間及組間樣本的相似性，基于Weighted Unifrac距離對(duì)所有樣品進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA V3-V4區(qū)序列測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 本研究采用Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)60例胃黏膜標(biāo)本微生物群落16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到的原始下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)控(拼接、過(guò)濾、去嵌合體)后，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)共計(jì)2 680 204條(44 670±13 021)，有效序列的平均讀長(zhǎng)為420 bp。以97%一致性將序列聚類成為OTUs，利用QIIME軟件計(jì)算共得到43 642個(gè)OTUs(HP：13 448，HN：30 194)。

2.2 稀釋曲線 隨著測(cè)序深度的增加，所得注釋細(xì)菌物種數(shù)量也不斷增加，當(dāng)隨機(jī)抽取的測(cè)序序列條數(shù)為8 000時(shí)，各樣本的稀釋曲線到達(dá)平臺(tái)期上升緩慢，說(shuō)明目前的測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠覆蓋絕大多數(shù)細(xì)菌物種，滿足后續(xù)分析。此外,HN組物種豐度顯著高于HP組(見圖1)。

2.3 α多樣性分析 經(jīng)過(guò)均一化后，得到可用于進(jìn)一步分析的序列數(shù)目為8 178條。對(duì)不同樣品的97%一致性閾值水平下的α多樣性分析指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，HP組和HN組Shannon指數(shù)分別為2.16±1.31和5.10±1.17，Simpson指數(shù)分別為0.41±0.25和0.85±0.10，Chao1指數(shù)分別為394.48±125.46和1 060.97±409.77，ACE指數(shù)分別為419.53±126.32和1 125.69±421.30。One-wayANOVA統(tǒng)計(jì)分析表明HP組和HN組α多樣性指數(shù)存在顯著性差異(P<0.01)。說(shuō)明HN組無(wú)論在物種豐度還是物種多樣性上均顯著高于HP組。進(jìn)一步表明，H.pylori的感染會(huì)顯著降低胃黏膜細(xì)菌群落的多樣性(見圖2)。

圖1 HP組和HN組稀釋性曲線Fig 1 Dilution curve of HP group and HN group

圖2 HP組和HN組α多樣性指數(shù)比較 A：Shannon 指數(shù)；B：Simpson 指數(shù)；C：Chao1 指數(shù)；D：ACE 指數(shù)

Fig 2 Comparison of α diversity indexes between HP group and HN group A: Shannon index; B: Simpson index; C: Chao1 index; D: ACE index

2.4 β多樣性分析 非度量多維尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)是一種將多維空間的研究對(duì)象簡(jiǎn)化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類，同時(shí)又保留對(duì)象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法?；赪eighted Unifrac的NMDS分析可以揭示樣品之間微生物群落的相似性。如果兩樣品間距離越近，則Weighted Unifrac距離矩陣值越小，說(shuō)明兩個(gè)群落構(gòu)成越相似(同時(shí)考慮物種類別和物種相對(duì)豐度)。利用QIIME計(jì)算基于物種相對(duì)豐度的β多樣性距離矩陣，并用R軟件(Version 3.2.0)的Vegan包繪制NMDS展示圖。如圖3所示，除個(gè)別離散點(diǎn)外，HP組和HN組內(nèi)樣品明顯聚集于兩個(gè)不同區(qū)域，后續(xù)我們使用基于Weighted Unifrac的UPGMA法對(duì)所有樣品的細(xì)菌群落構(gòu)成的相似性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示，除樣本HN0416和HN0456外，所有樣本按照HP組和HN組的分組明顯劃分為兩大分類群，綜上所述，HP組和HN組各樣品細(xì)菌群落無(wú)論在物種類別還是相對(duì)豐度上均顯著不同。

圖3 基于Weighted Unifrac距離的NMDS分析Fig 3 NMDS analysis based on Weighted Unifrac distance

圖4 基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹Fig 4 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

2.5 優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度展示 根據(jù)物種注釋結(jié)果，分別選取每個(gè)樣品在屬水平和門水平上相對(duì)豐度排名前十的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖。在屬水平，HP組內(nèi)5個(gè)優(yōu)勢(shì)物種Helicobacter、Prevotella、Pseudomonas、Fusobacterium和Streptococcus(相對(duì)豐度>1%)相對(duì)豐度之和所占比例超過(guò)80%；而HN組Shewanella、Streptococcus、Escherichia、Pseudomonas、Prevotella、Neisseria、Oscillospira7個(gè)優(yōu)勢(shì)物種僅占細(xì)菌總量的21.5%。在門水平，HP組Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria4個(gè)優(yōu)勢(shì)物種占細(xì)菌總量的90%以上；而HN組Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria5個(gè)優(yōu)勢(shì)物種占細(xì)菌總量的80%以上(見圖5)。

2.6 組間物種差異分析 為了尋找各分類水平下組間的差異物種，做組間的T檢驗(yàn)(SPSS 16.0)，找出差異顯著的物種。因兩組內(nèi)H.pylori相對(duì)豐度比例懸殊，為了避免這種干擾，需剔除H.pylori后進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。圖6A為門水平組間差異物種的比較，兩組間存在顯著差異的菌門有5個(gè)，與HN組相比，HP組發(fā)生顯著升高的菌門為Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria和Actinobacteria；發(fā)生顯著降低的菌門為Proteobacteria。圖6B為屬水平組間差異物種比較的結(jié)果，相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化的共計(jì)14個(gè)菌屬，其中13個(gè)菌屬HP組顯著高于HN組；僅Shewanella在HN組發(fā)生顯著升高。這些相對(duì)豐度發(fā)生顯著變化的菌屬主要分布于Proteobacteria、Fusobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria5個(gè)菌門。

圖5 物種相對(duì)豐度柱形圖 A：門水平上；B：屬水平上Fig 5 Relative abundance of species A: the phylum level; B: the genus level

注：左圖為組間差異物種豐度展示，圖中每個(gè)條形分別表示在分組間豐度差異顯著的物種在每個(gè)組中的均值。右圖為組間差異置信度展示，圖中每個(gè)圈的最左端點(diǎn)表示均值差的95%CI下限，圓圈的最右端點(diǎn)表示均值差95%CI上限。圓圈的圓心代表的是均值的差。圓圈顏色所代表的組為均值高的組。展示結(jié)果的最右端是對(duì)應(yīng)差異物種的組間顯著性檢驗(yàn)P值。

圖6 組間物種差異分析 A：門水平上； B： 屬水平上
Fig 6 Species difference analysis between two groups A: the phylum level; B: the genus level

2.7 組間群落標(biāo)志物 LEfSe(LDA Effect Size)是一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)的統(tǒng)計(jì)分析軟件，能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)識(shí)(Biomarker)，即組間差異顯著的物種。當(dāng)LDA設(shè)置為4.5時(shí)，Helicobacter、Epsilonproteobacteria、Campylobacterales、Helicobacteraceae、Proteobacteria在HP組升高；而HN組Gammaproteobacteria、Alteromonadales、Shewanella、Shewanellaceae、Firmicutes、Vibrionales、Enterobacteriaceae和Enterobacteriales等物種相對(duì)豐度顯著升高(見圖7)。

圖7 基于LEfSe統(tǒng)計(jì)的HP組和HN組物種相對(duì)豐度比較Fig 7 Comparison of relative abundance of species in HP group and HN group based on LEfSe statistics

3 討論

越來(lái)越多研究[7-9]表明，除H.pylori外，胃黏膜還存在大量微生物，這些微生物共同構(gòu)成了具有自身特征的胃黏膜微生物群落。傳統(tǒng)上，研究胃內(nèi)微生物群落特征的方法主要依賴于黏膜組織或內(nèi)容物的分離培養(yǎng)。然而受限于培養(yǎng)條件，80%的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的[10]。因此，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法很難全面地認(rèn)識(shí)胃黏膜菌群分布特征。目前基于非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法主要包括變性凝膠電泳技術(shù)(DGGE)、末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、基于16S rDNA的克隆文庫(kù)法和基因芯片技術(shù)等[11]。Bik等[12]利用克隆文庫(kù)的方法對(duì)分離自23例患者胃活檢標(biāo)本的1 833個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，鑒定得到共128個(gè)菌種，這些菌主要分布于8個(gè)菌門，研究發(fā)現(xiàn)H.pylori的存在不會(huì)對(duì)這些菌門的豐度產(chǎn)生影響。Maldonado-Contreras等[9]利用PhyloChip芯片法對(duì)12例患者的胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)在所有標(biāo)本中相對(duì)豐度最高的是變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)這4個(gè)門類，并認(rèn)為H.pylori陽(yáng)性標(biāo)本與H.pylori陰性標(biāo)本在這4個(gè)門類具有相似的構(gòu)成，HN組具有較高豐度的放線菌門和厚壁菌門，而HP組卻具有較高豐度的酸桿菌門和非螺桿菌變形菌門。然而無(wú)法避免的是這些方法同樣存在問(wèn)題：靈敏度較低、PCR的偏好性、克隆導(dǎo)致的取樣不足、僅能針對(duì)已知菌檢測(cè)等[13]。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)能在很大程度上克服以上缺陷，因其通量高、速度快、準(zhǔn)確度高、可進(jìn)行Pair-end雙向測(cè)序等優(yōu)勢(shì)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于微生態(tài)的研究中，讓我們對(duì)微生物群落的研究在認(rèn)知深度和廣度上有了大幅提高。

H.pylori作為胃內(nèi)最重要的病原體，并非唯一的病原體。越來(lái)越多證據(jù)表明，胃內(nèi)存在獨(dú)特的微生物群落。維持胃內(nèi)微生態(tài)環(huán)境平衡至關(guān)重要，一旦這種平衡打破，可能會(huì)導(dǎo)致慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。為了探索H.pylori對(duì)胃黏膜菌群的影響，本研究基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，采用Pair-end雙末端測(cè)序的方法，對(duì)細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析，通過(guò)比較HP組和HN組的菌群差異，試圖探索H.pylori感染所引起的菌群變化情況。

本研究結(jié)果表明，H.pylori感染機(jī)體后，胃內(nèi)菌群的α多樣性顯著降低，這一變化既包括物種數(shù)量的顯著下降也包括物種相對(duì)豐度的顯著下降。β多樣性分析的結(jié)果表明，兩組內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)相似性均較高，而兩組間的菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，相似性低。近年來(lái)，Prevotella被證實(shí)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并隨著Prevotella相對(duì)豐度升高，炎癥反應(yīng)程度會(huì)加劇[14]。同時(shí)，F(xiàn)usobacterium被認(rèn)為是一種致炎性微生物，它能夠抑制T細(xì)胞應(yīng)答、促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[15-16]。此外，亞硝基化合物(N-nitroso compounds)的合成能夠增加胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]，多種細(xì)菌可以通過(guò)自身的亞硝基酶將亞硝酸鹽還原成這種化合物，這些細(xì)菌包括Clostridium、Veillonella、Haemophilus、Staphylococcus和Neisseria等[17-18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，Prevotella、Fusobacterium、Nesseria、Veillonella的相對(duì)豐度在H.pylori陽(yáng)性組顯著升高。H.pylori可能與這些細(xì)菌相互作用，共同導(dǎo)致胃內(nèi)一系列疾病的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，H.pylori的定植會(huì)顯著改變胃黏膜的菌群結(jié)構(gòu)，并且消化性潰瘍、萎縮性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展可能是H.pylori和周圍菌群共同作用的結(jié)果。因此，了解H.pylori感染對(duì)胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響，可能為基于微生態(tài)治療胃內(nèi)疾病提供新思路。

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(責(zé)任編輯：李 健)

Characterization of Helicobacter pylori-infected gastric microbiota

PENG Xianhui1,2, ZHOU Liya3, HE Lihua1,2, SONG Zhiqiang3, ZHANG Jianzhong1,2

1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206; 2.Collaborative Innovation Center Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases in Hangzhou; 3.Department of Gastroenterology, Peking University Third Hospital, China

Objective To investigate the effects ofH.pylorion gastric microbiota by comparing the difference of gastric microbiota betweenH.pylori-positive and -negative individuals.Methods Genome was extracted after homogenate from gastric biopsies of 30H.pylori-positive cases and 30H.pylori-negative cases. The hypervariable region of 16S rDNA gene were amplified and a small fragment library was constructed cases. 250 bp Paired-End sequencing were conducted based on Illumina HiSeq 2000 sequencing platform. Raw data were processed by bioinformatics method and then the effective sequence was obtained, the sequence was clustered into the OTUs with 97% consistency. After the clustering and species annotation, the distribution of each sample was obtained in each class. The distribution of each sample in the categories level was obtained. The statistical difference of α diversity, β diversity between two groups were analyzed. Significant species in relative abundance were analyzed in two groups.Results Compared withH.pylori-negative control group, α diversity ofH.pylori-positive group was significantly decreased. The results showed that the similarity of the within-group on gastric microbiota was high, and the similarity between two groups was low. The predominant strains ofH.pylori-negative control group wereShewanella,Streptococcus,Escherichia,Pseudomonas,Prevotella,Neisseria,Oscillospira. WhileHelicobacter,Prevotella,Pseudomonas,FusobacteriumandStreptococcuswere the dominant strains inH.pylori-positive group. The relative abundance ofStreptococcus,Prevotella,Fusobacterium,Campylobacter,Porphyromonas,Rothia,Neisseria,Heamophilus[Prevotella],Veillonella,Leptotrichia,Actinomyces,BulleidiainH.pylori-positive group were significantly higher than those inH.pylori-negative control group.ConclusionH.pylorican significantly affect the structure and composition of gastric microbiota.H.pyloriand surrounding gastric microbiota may jointly promote the development of peptic ulcer, atrophic gastritis, gastric cancer and MALT lymphoma.

Helicobacter pylori; Gastric microbiota; High throughput sequencing

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAI06B02)

彭賢慧，博士研究生，研究方向：胃內(nèi)微生態(tài)。E-mail：pxhhappy@126.com

張建中，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：幽門螺桿菌致病機(jī)制。E-mail：zhangjianzhong@icdc.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.010

R378

A

1006-5709(2017)06-0658-06

2017-04-12