高 超，劉 陽(yáng)，王宇飛，張雪松，徐維盛，楊月欣

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肝臟線粒功能紊亂及姜黃素的拮抗效應(yīng)

高 超，劉 陽(yáng)，王宇飛，張雪松，徐維盛，楊月欣

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050)

目的：探討姜黃素對(duì)大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體功能紊亂的拮抗作用。方法：成年雄性BALB/C小鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]和安靜+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]。干預(yù)期為4w，干預(yù)期最后1w同時(shí)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練90 min，每天采用上述方式游泳運(yùn)動(dòng)7d，動(dòng)物末次運(yùn)動(dòng)完成后處死。觀察肝臟超微病理形態(tài)改變，測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平，以及肝臟線粒體膜電位、呼吸控制率等線粒體功能學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：與安靜對(duì)照組相比，姜黃素干預(yù)明顯抑制了大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(P<0.05)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(P<0.05)水平的上升，減輕了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肝細(xì)胞線粒體超微病理結(jié)構(gòu)異常。姜黃素干預(yù)顯著抑制了運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的小鼠肝臟線粒體膜電位(P<0.05)和呼吸控制率水平(P<0.05)的下降。結(jié)論：姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂具有良好的拮抗作用，為天然植物化學(xué)物應(yīng)用于抗運(yùn)動(dòng)疲勞提供新的前景方向。

姜黃素；大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；線粒體；超微病理

肝臟是體內(nèi)以代謝功能為主的重要器官，發(fā)揮著去氧化、分泌性蛋白質(zhì)的合成、儲(chǔ)存肝糖等關(guān)鍵作用，與機(jī)體運(yùn)動(dòng)應(yīng)激密切相關(guān)，同時(shí)也可能成為運(yùn)動(dòng)過(guò)勞性損傷的重要靶點(diǎn)[1]。研究表明，細(xì)胞線粒體的氧化呼吸鏈?zhǔn)菣C(jī)體活性氧(ROS)的最主要來(lái)源，正常情況下超過(guò)90%的ROS由呼吸鏈的“電子漏”產(chǎn)生，在細(xì)胞有氧呼吸過(guò)程中，大多數(shù)電子沿呼吸鏈傳遞至末端，最終與氧分子反應(yīng)生成H2O，但存在約2%～5%的電子可從呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ處漏出，生成自由基[2-3]。線粒體系統(tǒng)的功能一直是運(yùn)動(dòng)性損傷的重要研究?jī)?nèi)容，肝臟組織中線粒體含量豐富，耗氧量高，尤其在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，肝細(xì)胞能量代謝和氧耗驟增的情況下，生成的大量ROS直接攻擊線粒體，可能導(dǎo)致其超微病理結(jié)構(gòu)的改變以及膜電位和呼吸控制率的下降等功能紊亂[4-5]，因此，線粒體可能成為大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)肝細(xì)胞損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)[6]。

從而，尋找天然、安全、合理的外源性抗勞損的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，減輕肝臟線粒體功能紊亂，在預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肝臟損傷中至關(guān)重要[7，8]。姜黃素是從姜科、天南星科等植物中提取的一種植物多酚，很早就作為一種天然色素被廣泛用到食品工業(yè)中。研究表明，姜黃素具有很好的抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等功效[9-10]，并且可能對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)勞損傷及線粒體功能紊亂具有良好的拮抗作用[11-13]。本實(shí)驗(yàn)建立動(dòng)物大強(qiáng)度游泳訓(xùn)練損傷模型，研究姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肝臟線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的保護(hù)作用，為姜黃素應(yīng)用于創(chuàng)制抗過(guò)勞性損傷的膳食營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只健康雄性BALB/C清潔級(jí)小鼠，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，5w齡，體重18～20 g，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室清潔級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度20±2 ℃，相對(duì)濕度50%±5%。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 BS-200全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；Tecnai G2 12透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；Spectra Max M2 全能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；氧電極，英國(guó)漢莎科學(xué)儀器公司。

1.2.2 主要試劑 姜黃素，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；組織線粒體分離試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；羅丹明123熒光探針(Rhodamine 123，Rh123)，購(gòu)自美國(guó)Sigama公司；線粒體呼吸控制率(Respiratory control ratio，RCR)試劑盒，購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立 經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后，40只成年雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(Ct)、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組(Ex)、運(yùn)動(dòng)+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Ex+Cur)和安靜+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Cur)，每組10只。姜黃素以灌胃方式進(jìn)行干預(yù)，而安靜對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組則灌胃以等量的生理鹽水，干預(yù)期為4w，干預(yù)期最后1w同時(shí)進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，水溫控制在30±1℃，水深45 cm，進(jìn)行連續(xù)7d無(wú)負(fù)重游泳訓(xùn)練，每天持續(xù)90min。

1.3.2 取材及樣品制備 小鼠最后一次游泳結(jié)束后摘眼球取血，分離血清并檢測(cè)AST和ALT水平。迅速切取各組肝臟1 mm3左右放在2.5%戊二醛中4℃固定，進(jìn)行電鏡樣品制備。按照線粒體分離試劑盒要求，取約100 mg新鮮肝臟組織于冰浴中制備勻漿液，4℃離心(600 g)，取上清液再次4 °C離心(11 000 g)，將沉淀制備線粒體重懸液，待測(cè)。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 ALT、AST由BS-200全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，MMP)采用Rhodamine123熒光探針檢測(cè)；線粒體呼吸控制率(RCR)采用氧電極法檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠血清ALT和AST水平的影響

結(jié)果如圖1所示，與安靜對(duì)照組相比，大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)顯著提高了小鼠血清ALT(P<0.01)和AST(P<0.01)水平，表明大強(qiáng)度游泳導(dǎo)致了小鼠明顯的肝細(xì)胞損傷；而姜黃素干預(yù)顯著減輕了游泳小鼠血清ALT(P<0.05)和AST(P<0.05)水平。

2.2 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟超微病理的影響

由圖2可見(jiàn)，安靜對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞線粒體基質(zhì)密度正常，脊清晰，結(jié)構(gòu)基本完整。游泳運(yùn)動(dòng)小鼠肝細(xì)胞線粒體超微形態(tài)變異明顯，可見(jiàn)不同程度腫脹與變形，基質(zhì)電子密度下降，其嵴減少甚至消失而變空。與運(yùn)動(dòng)對(duì)照組相比，姜黃素處理小鼠肝細(xì)胞線粒體的腫脹和脊減少的程度相對(duì)較輕，提示姜黃素對(duì)游泳引發(fā)的小鼠肝細(xì)胞超微病理結(jié)構(gòu)紊亂具有良好的拮抗效應(yīng)。

圖1 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠血清ALT、AST水平的影響注：*、** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對(duì)照組；#P<0.05 vs 運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

圖2 電鏡下觀察姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟超微病理改變的影響

2.3 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體膜電位的影響

從圖3可知，大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體膜電位下降35.9 %(P<0.01)，姜黃素干預(yù)顯著抑制了游泳導(dǎo)致的小鼠肝臟線粒體膜電位的下降(P<0.05)。姜黃素本身對(duì)肝臟線粒體膜電位沒(méi)有明顯影響(P>0.05)。

圖3 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體膜電位的影響注：*、 ** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對(duì)照組； #P<0.05 vs 運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

2.4 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體呼吸控制率的影響

如圖4所示，與安靜對(duì)照組相比，游泳運(yùn)動(dòng)及姜黃素干預(yù)對(duì)肝細(xì)胞線粒體的3態(tài)呼吸未見(jiàn)顯著影響(P>0.05)，但游泳運(yùn)動(dòng)組4態(tài)呼吸上調(diào)40.1 %(P<0.01)，而姜黃素處理抑制了游泳小鼠4態(tài)呼吸的上調(diào)(P<0.05)。與安靜對(duì)照組相比，游泳運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體RCR降低了31.1%(P<0.01)，同時(shí)，姜黃素處理顯著緩解了游泳小鼠RCR水平的降低(P<0.05)。

3 討論

不同運(yùn)動(dòng)方式會(huì)對(duì)肝臟的形態(tài)、功能造成影響，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肝臟損傷卻往往在運(yùn)動(dòng)實(shí)踐中被忽視。研究表明，急性的劇烈運(yùn)動(dòng)能夠?qū)е卵遛D(zhuǎn)氨酶含量增加[14]，而力竭性的運(yùn)動(dòng)甚至可誘發(fā)較重的肝臟組織結(jié)構(gòu)改變以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等損傷表現(xiàn)[15]。肝臟富含線粒體，線粒體系統(tǒng)在機(jī)體運(yùn)動(dòng)機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的生理作用，而以往研究中也發(fā)現(xiàn)，線粒體可能成為運(yùn)動(dòng)過(guò)勞性傷害的重要靶部位[6]。本試驗(yàn)顯示，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致了小鼠肝臟尤其是線粒體的結(jié)構(gòu)和功能損傷，而姜黃素干預(yù)明顯地抑制了游泳導(dǎo)致的肝臟ALT和AST的釋放，顯著減輕了游泳引發(fā)的肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)改變和功能紊亂。

圖4 姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體呼吸控制率的影響注：*、 ** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對(duì)照組； #P<0.05 vs 運(yùn)動(dòng)對(duì)照組

正常的線粒體膜電位(MMP)是維持細(xì)胞線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、生成ATP的重要前提，而MMP的改變與線粒體膜損傷及功能紊亂緊密相關(guān)[16]。本研究顯示，大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)明顯降低了小鼠肝細(xì)胞線粒體MMP，揭示了線粒體膜損傷和病理結(jié)構(gòu)改變。相關(guān)證據(jù)表明，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)能夠引發(fā)線粒體膜通透性和流動(dòng)性的異常，可部分歸因于活性氧的猝發(fā)[17-18]。研究表明，細(xì)胞的能量主要來(lái)源于線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化，大約2%～5%的氧耗生成自由基，而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)肝細(xì)胞氧化代謝加速，可能導(dǎo)致線粒體持續(xù)的ROS生成，同時(shí)，也使線粒體成為ROS攻擊的關(guān)鍵靶點(diǎn)[4，19]。有證據(jù)顯示，線粒體內(nèi)膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)易受到ROS直接攻擊和細(xì)胞氧化-抗氧化平衡狀態(tài)的影響，引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔PTP開(kāi)放，線粒體MMP下降，細(xì)胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等物質(zhì)不斷釋放，線粒體過(guò)多攝入胞漿Ca2+，導(dǎo)致線粒體腫脹、變形等超微結(jié)構(gòu)改變及相關(guān)功能障礙，最終引起細(xì)胞凋亡[6，20-21]。本研究中，姜黃素干預(yù)明顯減輕了運(yùn)動(dòng)小鼠肝臟線粒體膜電位的異常改變，可能與其良好的清除自由基作用有關(guān)。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，姜黃素分子中含有酚羥基結(jié)構(gòu)，能夠直接猝滅自由基，還可通過(guò)活化抗氧化酶系和抑制氧化酶系等途徑，發(fā)揮抗氧化活性，對(duì)線粒體膜的結(jié)構(gòu)損傷以及功能紊亂發(fā)揮抗氧化保護(hù)效應(yīng)[11，22]。

線粒體RCR可較好衡量呼吸鏈氧化磷酸化水平以及ATP的生產(chǎn)能力，是反映線粒體呼吸功能的重要標(biāo)準(zhǔn)[23]，尤其4態(tài)呼吸的上調(diào)，可作為其內(nèi)膜損傷的關(guān)鍵證據(jù)[24]。本試驗(yàn)表明，大強(qiáng)度游泳運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體4態(tài)呼吸明顯上升，但并未使3態(tài)呼吸發(fā)生顯著改變，從而綜合表現(xiàn)為線粒體RCR的顯著降低。姜黃素干預(yù)則抑制了大強(qiáng)度游泳小鼠肝細(xì)胞線粒體4態(tài)呼吸，同時(shí)也緩解了RCR的降低，拮抗了線粒體呼吸功能障礙[6]。綜上所述，本研究結(jié)果表明姜黃素對(duì)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)小鼠肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷以及功能障礙表現(xiàn)出較好的拮抗作用，為姜黃素應(yīng)用于預(yù)防大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)的肝細(xì)胞損傷、創(chuàng)制營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑提供證據(jù)支持?！?/p>

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

High-Intensity Excercise Induced Hepatic Mitochondrial Dysfunction in Mice and Protective Effects of Curcumin

GAO Chao，LIU Yang，WANG Yu-fei，ZHANG Xue-song，XU Wei-sheng，YANG Yue-xin

(National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China)

curcumin；intense exercise；mitochondria；ultrastructural pathology

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(項(xiàng)目編號(hào)：2012BAD33B01)；中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所青年科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：NINH201606)。

高 超(1986— )，男，博士，助理研究員，研究方向：食物營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)。

楊月欣(1955— )，女，研究員，研究方向：食物營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)。