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        大強度運動導(dǎo)致肝臟線粒功能紊亂及姜黃素的拮抗效應(yīng)

        2017-06-29 12:03:32王宇飛張雪松徐維盛楊月欣
        中國食物與營養(yǎng) 2017年5期
        關(guān)鍵詞:膜電位姜黃肝細胞

        高 超,劉 陽,王宇飛,張雪松,徐維盛,楊月欣

        (中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所,北京 100050)

        大強度運動導(dǎo)致肝臟線粒功能紊亂及姜黃素的拮抗效應(yīng)

        高 超,劉 陽,王宇飛,張雪松,徐維盛,楊月欣

        (中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所,北京 100050)

        目的:探討姜黃素對大強度游泳運動小鼠肝臟線粒體功能紊亂的拮抗作用。方法:成年雄性BALB/C小鼠隨機分為安靜對照組、運動對照組、運動+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]和安靜+姜黃素組[100 mg/(kg·d)]。干預(yù)期為4w,干預(yù)期最后1w同時進行游泳運動訓練,每天訓練90 min,每天采用上述方式游泳運動7d,動物末次運動完成后處死。觀察肝臟超微病理形態(tài)改變,測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平,以及肝臟線粒體膜電位、呼吸控制率等線粒體功能學指標。結(jié)果:與安靜對照組相比,姜黃素干預(yù)明顯抑制了大強度運動導(dǎo)致的小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(P<0.05)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(P<0.05)水平的上升,減輕了運動導(dǎo)致的肝細胞線粒體超微病理結(jié)構(gòu)異常。姜黃素干預(yù)顯著抑制了運動導(dǎo)致的小鼠肝臟線粒體膜電位(P<0.05)和呼吸控制率水平(P<0.05)的下降。結(jié)論:姜黃素對大強度運動小鼠肝細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷和功能紊亂具有良好的拮抗作用,為天然植物化學物應(yīng)用于抗運動疲勞提供新的前景方向。

        姜黃素;大強度運動;線粒體;超微病理

        肝臟是體內(nèi)以代謝功能為主的重要器官,發(fā)揮著去氧化、分泌性蛋白質(zhì)的合成、儲存肝糖等關(guān)鍵作用,與機體運動應(yīng)激密切相關(guān),同時也可能成為運動過勞性損傷的重要靶點[1]。研究表明,細胞線粒體的氧化呼吸鏈是機體活性氧(ROS)的最主要來源,正常情況下超過90%的ROS由呼吸鏈的“電子漏”產(chǎn)生,在細胞有氧呼吸過程中,大多數(shù)電子沿呼吸鏈傳遞至末端,最終與氧分子反應(yīng)生成H2O,但存在約2%~5%的電子可從呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ處漏出,生成自由基[2-3]。線粒體系統(tǒng)的功能一直是運動性損傷的重要研究內(nèi)容,肝臟組織中線粒體含量豐富,耗氧量高,尤其在大強度運動過程中,肝細胞能量代謝和氧耗驟增的情況下,生成的大量ROS直接攻擊線粒體,可能導(dǎo)致其超微病理結(jié)構(gòu)的改變以及膜電位和呼吸控制率的下降等功能紊亂[4-5],因此,線粒體可能成為大強度運動引發(fā)肝細胞損傷的關(guān)鍵靶點[6]。

        從而,尋找天然、安全、合理的外源性抗勞損的營養(yǎng)補充劑,減輕肝臟線粒體功能紊亂,在預(yù)防大強度運動導(dǎo)致的肝臟損傷中至關(guān)重要[7,8]。姜黃素是從姜科、天南星科等植物中提取的一種植物多酚,很早就作為一種天然色素被廣泛用到食品工業(yè)中。研究表明,姜黃素具有很好的抗氧化、抗炎、降血脂、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等功效[9-10],并且可能對運動過勞損傷及線粒體功能紊亂具有良好的拮抗作用[11-13]。本實驗建立動物大強度游泳訓練損傷模型,研究姜黃素對大強度運動導(dǎo)致肝臟線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的保護作用,為姜黃素應(yīng)用于創(chuàng)制抗過勞性損傷的膳食營養(yǎng)補充劑提供支持。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        40只健康雄性BALB/C清潔級小鼠,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,5w齡,體重18~20 g,飼養(yǎng)于實驗室清潔級動物房,動物房溫度20±2 ℃,相對濕度50%±5%。

        1.2 主要實驗儀器和試劑

        1.2.1 主要儀器 BS-200全自動生化分析儀,深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;Tecnai G2 12透射電子顯微鏡,荷蘭FEI公司;Spectra Max M2 全能酶標儀,美國Molecular Devices公司;氧電極,英國漢莎科學儀器公司。

        1.2.2 主要試劑 姜黃素,購自美國Sigma公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測試劑盒,購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;組織線粒體分離試劑盒,購自碧云天生物技術(shù)有限公司;羅丹明123熒光探針(Rhodamine 123,Rh123),購自美國Sigama公司;線粒體呼吸控制率(Respiratory control ratio,RCR)試劑盒,購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1 動物模型的建立 經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1w后,40只成年雄性BALB/c小鼠,隨機分為安靜對照組(Ct)、運動對照組(Ex)、運動+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Ex+Cur)和安靜+姜黃素100 mg/(kg·d)組(Cur),每組10只。姜黃素以灌胃方式進行干預(yù),而安靜對照組和運動對照組則灌胃以等量的生理鹽水,干預(yù)期為4w,干預(yù)期最后1w同時進行游泳運動訓練,水溫控制在30±1℃,水深45 cm,進行連續(xù)7d無負重游泳訓練,每天持續(xù)90min。

        1.3.2 取材及樣品制備 小鼠最后一次游泳結(jié)束后摘眼球取血,分離血清并檢測AST和ALT水平。迅速切取各組肝臟1 mm3左右放在2.5%戊二醛中4℃固定,進行電鏡樣品制備。按照線粒體分離試劑盒要求,取約100 mg新鮮肝臟組織于冰浴中制備勻漿液,4℃離心(600 g),取上清液再次4 °C離心(11 000 g),將沉淀制備線粒體重懸液,待測。

        1.3.3 指標測定 ALT、AST由BS-200全自動生化分析儀檢測;線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)采用Rhodamine123熒光探針檢測;線粒體呼吸控制率(RCR)采用氧電極法檢測。

        1.4 統(tǒng)計分析

        2 結(jié)果與分析

        2.1 姜黃素對大強度運動小鼠血清ALT和AST水平的影響

        結(jié)果如圖1所示,與安靜對照組相比,大強度游泳運動顯著提高了小鼠血清ALT(P<0.01)和AST(P<0.01)水平,表明大強度游泳導(dǎo)致了小鼠明顯的肝細胞損傷;而姜黃素干預(yù)顯著減輕了游泳小鼠血清ALT(P<0.05)和AST(P<0.05)水平。

        2.2 姜黃素對大強度運動小鼠肝臟超微病理的影響

        由圖2可見,安靜對照組小鼠肝細胞線粒體基質(zhì)密度正常,脊清晰,結(jié)構(gòu)基本完整。游泳運動小鼠肝細胞線粒體超微形態(tài)變異明顯,可見不同程度腫脹與變形,基質(zhì)電子密度下降,其嵴減少甚至消失而變空。與運動對照組相比,姜黃素處理小鼠肝細胞線粒體的腫脹和脊減少的程度相對較輕,提示姜黃素對游泳引發(fā)的小鼠肝細胞超微病理結(jié)構(gòu)紊亂具有良好的拮抗效應(yīng)。

        圖1 姜黃素對大強度運動小鼠血清ALT、AST水平的影響注:*、** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對照組;#P<0.05 vs 運動對照組

        圖2 電鏡下觀察姜黃素對大強度運動小鼠肝臟超微病理改變的影響

        2.3 姜黃素對大強度運動小鼠肝臟線粒體膜電位的影響

        從圖3可知,大強度游泳運動導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體膜電位下降35.9 %(P<0.01),姜黃素干預(yù)顯著抑制了游泳導(dǎo)致的小鼠肝臟線粒體膜電位的下降(P<0.05)。姜黃素本身對肝臟線粒體膜電位沒有明顯影響(P>0.05)。

        圖3 姜黃素對大強度運動小鼠肝臟線粒體膜電位的影響注:*、 ** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對照組; #P<0.05 vs 運動對照組

        2.4 姜黃素對大強度運動小鼠肝臟線粒體呼吸控制率的影響

        如圖4所示,與安靜對照組相比,游泳運動及姜黃素干預(yù)對肝細胞線粒體的3態(tài)呼吸未見顯著影響(P>0.05),但游泳運動組4態(tài)呼吸上調(diào)40.1 %(P<0.01),而姜黃素處理抑制了游泳小鼠4態(tài)呼吸的上調(diào)(P<0.05)。與安靜對照組相比,游泳運動小鼠肝臟線粒體RCR降低了31.1%(P<0.01),同時,姜黃素處理顯著緩解了游泳小鼠RCR水平的降低(P<0.05)。

        3 討論

        不同運動方式會對肝臟的形態(tài)、功能造成影響,而大強度運動導(dǎo)致的肝臟損傷卻往往在運動實踐中被忽視。研究表明,急性的劇烈運動能夠?qū)е卵遛D(zhuǎn)氨酶含量增加[14],而力竭性的運動甚至可誘發(fā)較重的肝臟組織結(jié)構(gòu)改變以及炎性細胞浸潤等損傷表現(xiàn)[15]。肝臟富含線粒體,線粒體系統(tǒng)在機體運動機制中發(fā)揮著關(guān)鍵的生理作用,而以往研究中也發(fā)現(xiàn),線粒體可能成為運動過勞性傷害的重要靶部位[6]。本試驗顯示,大強度運動導(dǎo)致了小鼠肝臟尤其是線粒體的結(jié)構(gòu)和功能損傷,而姜黃素干預(yù)明顯地抑制了游泳導(dǎo)致的肝臟ALT和AST的釋放,顯著減輕了游泳引發(fā)的肝臟線粒體超微結(jié)構(gòu)改變和功能紊亂。

        圖4 姜黃素對大強度運動小鼠肝臟線粒體呼吸控制率的影響注:*、 ** P<0.05、 P<0.01 vs 安靜對照組; #P<0.05 vs 運動對照組

        正常的線粒體膜電位(MMP)是維持細胞線粒體進行氧化磷酸化、生成ATP的重要前提,而MMP的改變與線粒體膜損傷及功能紊亂緊密相關(guān)[16]。本研究顯示,大強度游泳運動明顯降低了小鼠肝細胞線粒體MMP,揭示了線粒體膜損傷和病理結(jié)構(gòu)改變。相關(guān)證據(jù)表明,高強度運動能夠引發(fā)線粒體膜通透性和流動性的異常,可部分歸因于活性氧的猝發(fā)[17-18]。研究表明,細胞的能量主要來源于線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化,大約2%~5%的氧耗生成自由基,而大強度運動引發(fā)肝細胞氧化代謝加速,可能導(dǎo)致線粒體持續(xù)的ROS生成,同時,也使線粒體成為ROS攻擊的關(guān)鍵靶點[4,19]。有證據(jù)顯示,線粒體內(nèi)膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)易受到ROS直接攻擊和細胞氧化-抗氧化平衡狀態(tài)的影響,引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔PTP開放,線粒體MMP下降,細胞色素c及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)等物質(zhì)不斷釋放,線粒體過多攝入胞漿Ca2+,導(dǎo)致線粒體腫脹、變形等超微結(jié)構(gòu)改變及相關(guān)功能障礙,最終引起細胞凋亡[6,20-21]。本研究中,姜黃素干預(yù)明顯減輕了運動小鼠肝臟線粒體膜電位的異常改變,可能與其良好的清除自由基作用有關(guān)。相關(guān)文獻顯示,姜黃素分子中含有酚羥基結(jié)構(gòu),能夠直接猝滅自由基,還可通過活化抗氧化酶系和抑制氧化酶系等途徑,發(fā)揮抗氧化活性,對線粒體膜的結(jié)構(gòu)損傷以及功能紊亂發(fā)揮抗氧化保護效應(yīng)[11,22]。

        線粒體RCR可較好衡量呼吸鏈氧化磷酸化水平以及ATP的生產(chǎn)能力,是反映線粒體呼吸功能的重要標準[23],尤其4態(tài)呼吸的上調(diào),可作為其內(nèi)膜損傷的關(guān)鍵證據(jù)[24]。本試驗表明,大強度游泳運動導(dǎo)致肝細胞線粒體4態(tài)呼吸明顯上升,但并未使3態(tài)呼吸發(fā)生顯著改變,從而綜合表現(xiàn)為線粒體RCR的顯著降低。姜黃素干預(yù)則抑制了大強度游泳小鼠肝細胞線粒體4態(tài)呼吸,同時也緩解了RCR的降低,拮抗了線粒體呼吸功能障礙[6]。綜上所述,本研究結(jié)果表明姜黃素對大強度運動小鼠肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷以及功能障礙表現(xiàn)出較好的拮抗作用,為姜黃素應(yīng)用于預(yù)防大強度運動引發(fā)的肝細胞損傷、創(chuàng)制營養(yǎng)補劑提供證據(jù)支持。◇

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        (責任編輯 李婷婷)

        High-Intensity Excercise Induced Hepatic Mitochondrial Dysfunction in Mice and Protective Effects of Curcumin

        GAO Chao,LIU Yang,WANG Yu-fei,ZHANG Xue-song,XU Wei-sheng,YANG Yue-xin

        (National Institute for Nutrition and Health,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China)

        curcumin;intense exercise;mitochondria;ultrastructural pathology

        國家科技支撐計劃(項目編號:2012BAD33B01);中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所青年科學基金(項目編號:NINH201606)。

        高 超(1986— ),男,博士,助理研究員,研究方向:食物營養(yǎng)評價。

        楊月欣(1955— ),女,研究員,研究方向:食物營養(yǎng)評價。

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