王寅 李園園 郝海波 梁惠 馬愛國

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·論著·

干酪乳桿菌對利福平和異煙肼聯(lián)用所致大鼠肝損傷的保護作用

王寅 李園園 郝海波 梁惠 馬愛國

目的 觀察干酪乳桿菌代田株(Lactobacilluscaseistrain Shirota，LcS)對RFP和INH聯(lián)合用藥所致大鼠肝損傷的保護作用。方法 將72只無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為：正常對照組，模型組， LcS低、中、高劑量組，雙環(huán)醇組，每組12只。模型組，LcS低、中、高劑量組及雙環(huán)醇組大鼠每天灌胃RFP(50 mg/kg)和INH(50 mg/kg)，2 h后LcS低、中、高劑量組大鼠分別灌胃10×108、20×108、40×108菌落形成單位(CFU)/kg的LcS，持續(xù)28 d。正常對照組大鼠灌胃0.9%生理鹽水(20 ml/kg)，雙環(huán)醇組大鼠灌胃7.5 mg/kg雙環(huán)醇，每天1次，持續(xù)28 d。檢測大鼠肝臟指數(shù)、肝勻漿超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量、血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)等，并進行比較。結(jié)果 RFP和INH給藥28 d后，模型組大鼠肝臟系數(shù)升高到(3.14±0.15) %，肝勻漿中MDA和SOD分別達到(4.52±0.52) nmol/mg蛋白和(72.51±11.05) U/mg 蛋白；血清ALT和ALP分別達到(65.45±20.10) U/L和(322.79±61.73) U/L，TBA、TBIL、DBIL、IBIL分別達到(91.34±16.93) μmol/L、(7.82±2.53) μmol/L、(4.70±1.29) μmol/L和(3.69±0.54) μmol/L。LcS補充后，與模型組相比，LcS高劑量組大鼠肝臟系數(shù)降低到(2.88±0.12) %；LcS低、中、高劑量組大鼠MDA含量明顯下降，分別達到(2.94±0.48) nmol/mg蛋白、(2.82±0.36) nmol/mg蛋白和(2.62±0.28) nmol/mg蛋白；SOD活性明顯增強，分別達到(84.60±8.50) U/mg蛋白、(86.28±5.52) U/mg蛋白和(2.62±0.28) U/mg蛋白。與模型組相比，LcS高劑量組的ALT、ALP均降低，分別為(49.92±15.32) U/L和(280.70±54.32) U/L；LcS低、中、高劑量組的TBA水平分別降低到(67.63±18.95) μmol/L、(55.32±19.17) μmol/L 和(52.92±23.00) μmol/L；LcS中、高劑量組的DBIL和IBIL水平也明顯降低，其中DBIL分別降低到(3.64±1.68) μmol/L和(2.92±0.86) μmol/L，IBIL分別降低到(3.21±0.22) μmol/L和(3.12±0.42) μmol/L，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。與模型組相比，雙環(huán)醇組大鼠的血清TBA、TBIL、DBIL、IBIL水平分別降低到(64.49±22.41) μmol/L、(6.33±1.46) μmol/L、(3.54±1.21) μmol/L和(3.01±0.36) μmol/L，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。結(jié)論 干酪乳桿菌能減輕RFP和INH聯(lián)合所致的大鼠肝損傷。

乳桿菌，干酪； 利福平； 異煙肼； 藥物性肝損傷； 結(jié)果與過程評價(衛(wèi)生保健)； 動物實驗

利福平(RFP)和異煙肼(INH)是臨床治療肺結(jié)核常用的一線抗結(jié)核藥物，但具有潛在的肝毒性，是藥物性肝損傷臨床檢測的重點藥物[1]。由于“肝-腸軸”和肝腸循環(huán)的存在，腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡的破壞可促進肝病發(fā)生和發(fā)展[2]。我國抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損傷發(fā)生率較高，約為8%～30%[3]，是導致患者抗結(jié)核藥物治療中斷或失敗、產(chǎn)生耐藥性的重要原因，直接影響治療效果及病情轉(zhuǎn)歸。益生菌是一類能促進腸道菌群生態(tài)平衡，對宿主健康有益的活體微生態(tài)制劑。近些年來，通過補充益生菌來預防肝臟疾病得到越來越多的關(guān)注。已經(jīng)有研究報道顯示，益生菌對于由飲酒、病毒感染及代謝性疾病引起的慢性肝損傷有保護作用[4-5]。也有研究表明，植物乳酸菌與L-精氨酸聯(lián)合使用可以保護內(nèi)毒素誘導的肝損傷[6]，然而其機制尚不明確。干酪乳桿菌代田株(Lactobacilluscaseistrain Shirota，LcS)是在世界范圍內(nèi)廣泛流行和被研究的益生菌，已有研究證實LcS可以通過改善腸道微生物組成，以及調(diào)節(jié)免疫應答從而發(fā)揮對人體健康的有益作用。筆者擬通過RFP和INH灌胃建立大鼠肝損傷模型，研究補充LcS對RFP和INH所致大鼠肝損傷的保護作用，為開發(fā)LcS的臨床應用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料和試劑

養(yǎng)樂多風味乳酸桿菌飲料[LcS含量：1×108菌落形成單位(CFU)/ml，日本養(yǎng)樂多株式會社]；利福平膠囊和異煙肼片(沈陽紅旗制藥有限公司)；雙環(huán)醇片(北京協(xié)和藥廠)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA試劑盒)、考馬斯亮藍蛋白定量測試試劑盒(三者均由南京建成生物工程研究提供)；TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑增強版(SYBR Green)均由天根生化科技(北京)有限公司提供。

二、模型建立及分組

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量為 180～220 g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20080002]。適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為6組：正常對照組，模型組，LcS低、中、高劑量組，雙環(huán)醇組，每組12只。INH直接溶于無菌生理鹽水，制成濃度為30 g/L的灌胃液，RFP溶于pH 3.0的鹽酸溶液，制成濃度為30 g/L的灌胃液，雙環(huán)醇溶于藥用聚乙二醇(PEG400)，制成濃度為30 g/L的灌胃液。正常對照組灌胃0.9%氯化鈉注射液(20 ml/kg，連續(xù)28 d)；其余各組大鼠每天1次灌胃RFP 50 mg/kg和INH 50 mg/kg，連續(xù)28 d，灌胃體積為20 ml/kg，建立肝損傷模型。在給予RFP和INH 2 h后，LcS的3個劑量組分別灌胃10×108、20×108、40×108cFU/kg的LcS；雙環(huán)醇組大鼠灌胃7.5 mg/kg雙環(huán)醇；每天1次，持續(xù)28 d。

各組大鼠末次灌胃后禁食12 h，稱重后給予3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腹主動脈取血，留取血清；完整分離肝臟并稱重，計算肝臟指數(shù)；剩余組織于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、觀察及測量指標

1.一般情況觀察：試驗期間每周稱大鼠體質(zhì)量1次，并觀察大鼠的生長情況、毛發(fā)顏色的變化、精神狀況、食欲及對外界的刺激回應。

2.肝臟指數(shù)計算：大鼠處死后，完整分離其肝臟，冷生理鹽水沖洗表面血污，濾紙吸干，稱重，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)(%)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

3.肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量測定：分離大鼠肝臟并稱重后，取0.5 g大鼠肝組織，加入冰生理鹽水5 ml，用電動勻漿機在冰水中碾磨勻漿，制造10%肝勻漿，1249×g離心15 min，取上清液于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用考馬斯亮藍法測定肝組織蛋白濃度，羥胺法測定SOD活性，硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法檢測其中MDA含量，詳細檢測方法按試劑盒說明操作。

4.生化指標檢測：給藥28d后，麻醉大鼠，腹主動脈取血至無肝素的采血管，室溫靜置30 min，1880×g離心10 min，制備血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。用全自動生化分析儀測量每組大鼠血清中的谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、血清總膽汁酸(TBA)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、間接膽紅素(IBIL)。

5.大鼠糞便腸道菌群檢測：給藥28 d后，取大鼠糞便樣品，嚴格按照TIANamp Stool NDA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒要求提取大鼠糞便基因組總DNA，-20 ℃凍存。用實時熒光定量PCR方法對大鼠糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌及糞腸球菌16S rDNA V3可變區(qū)進行定量分析并制作標準曲線，將提取的大鼠糞便基因組DNA進行以上4種菌株16S rDNA V3可變區(qū)熒光定量PCR反應，反應完畢后進行溶解曲線分析。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件Eppendorf Mastercycler ep realplex自動分析Ct值(即PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù))，將Ct值代入標準曲線，求出大鼠糞便樣品中4種菌株的含量

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、各組大鼠的一般情況

1.毛色變化：正常對照組大鼠毛色無明顯變化。其余各組大鼠在灌胃第2周時開始出現(xiàn)不同程度的毛色變黃、無光澤，灌胃期間毛色變黃為持續(xù)性，處死前大鼠的毛色泛黃，沒有光澤。

2.精神狀態(tài)：正常對照組大鼠在灌胃期間無明顯變化。其余組大鼠在灌胃第1周時精神狀態(tài)良好，食欲佳，對外界刺激敏感；在灌胃第2周出現(xiàn)精神狀態(tài)不佳，食欲降低，對外界刺激遲鈍。

二、各組大鼠的肝臟指數(shù)測定

給藥28 d后，正常對照組，模型組，LcS低、中、高劑量組及雙環(huán)醇組大鼠肝臟指數(shù)分別為(2.81±0.25) %、(3.14±0.15) %、(3.06±0.17) %、(3.03±0.07) %、(2.88±0.12) %、(2.87±0.17) %，組間差異有統(tǒng)計學意義(F=4.90，P<0.01)。進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組大鼠的肝臟指數(shù)升高；與模型組相比，LcS高劑量組和雙環(huán)醇組的肝臟指數(shù)均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

三、各組大鼠肝組織SOD活性和MDA含量的測定

給藥28 d后，與正常對照組相比，模型組大鼠肝勻漿中MDA平均含量升高了38.5%，SOD活性降低了20.7%；與模型組相比，LcS各劑量組的MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增強，見表1。

表1 給藥28 d后各組大鼠肝組織MDA含量及SOD活性變化

注a：與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；b：與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

四、大鼠血清生化指標

給藥28 d后，各組大鼠血清ALT、AST、ALP的變化情況見表2。與正常對照組相比，模型組的ALT、AST、ALP均升高，其中ALT和ALP平均水平分別升高了20.0%和19.3%，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，益生菌高劑量組的ALT、ALP平均水平分別降低了16.3%和14.4%，差異有統(tǒng)計學意義。

給藥28 d后，各組大鼠血清TBA、TBIL、DBIL、IBIL的變化見表3。與正常對照組相比，各組大鼠的TBA、TBIL、DBIL、IBIL的水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，益生菌各組及雙環(huán)醇組TBA平均水平均明顯降低，分別降低了26.0%、39.4%、42.1%、29.4%；雙環(huán)醇組TBIL平均水平降低了19.1%，差異均有統(tǒng)計學意義；益生菌中、高劑量組和雙環(huán)醇組的DBIL和IBIL也明顯降低，其中DBIL平均水平分別降低了22.6%、37.9%、24.7%，IBIL平均水平分別降低了13%、15.4%、18.4%。

五、大鼠的腸道菌群變化情況

給藥28 d后，各組大鼠糞便菌群分析結(jié)果見表4。與正常對照組相比，模型組的雙歧桿菌和乳酸桿菌含量明顯降低，糞腸球菌和大腸桿菌含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。與模型組相比，LcS組大鼠糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量明顯升高，而糞腸球菌和大腸桿菌的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。

討 論

藥物性肝損傷在臨床上是需要重點關(guān)注的問題，其關(guān)系到患者用藥后的生命安全。RFP和INH是臨床廣泛使用的一線抗結(jié)核藥物，但兩者聯(lián)用會明顯增加肝毒性，嚴重影響肺結(jié)核的系統(tǒng)治療和患者的生存質(zhì)量。美國胸科協(xié)會認為INH的肝毒性機制是其代謝過程中形成的肼及乙酰肼[7]。RFP可以競爭性的抑制膽紅素的排泄，導致膽紅素的淤肝臟與腸道有緊密的解剖與功能關(guān)系，腸道微生物在腸道中與宿主相互作用，通過肝腸循環(huán)，在肝病的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[9-10]。有資料顯示,益生菌可以促進急性膽汁淤積大鼠的胃腸消化間期移行性肌電復合波(MMC)節(jié)律性恢復，從而改善肝損傷，減輕膽汁淤積，對肝臟起到保護的作用[11]。在肺結(jié)核的治療過程中，需要長期、聯(lián)合應用大劑量的抗生素，RFP更是一種廣譜抗生素，在長期的抗結(jié)核藥物治療過程中容易導致患者腸道微生物群的紊亂。因此，筆者通過補充益生菌，調(diào)節(jié)大鼠腸道微生態(tài)平衡，觀察LcS是否對RFP和INH聯(lián)合所致肝損傷有保護作用。合理攝入活性益生菌，能夠改善和修復腸道菌群失調(diào)。在2001年，我國公布了雙歧桿菌、乳酸桿菌、嗜熱鏈球等三類共計9種可用于保健食品的益生菌名單。本次實驗采用的是LcS作為干預物，研究其對RFP和INH聯(lián)合所致肝損傷的保護作用。結(jié)果顯示，LcS對RFP和INH聯(lián)合所致大鼠肝損傷有一定的保護作用。

表2 給藥28 d后各組大鼠血清生化指標檢測結(jié)果

注a：與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；b：與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶

表3 給藥28 d后各組大鼠血清生化指標分析結(jié)果

注a：與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；b：與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)。TBA：血清總膽汁酸；TBIL：總膽紅素；DBIL：直接膽紅素；IBIL：間接膽紅素積；還可以誘導肝藥酶的活性，加快INH的代謝，增加乙酰肼代謝的活性中間體和肼，與肝細胞過氧化反應增強，從而加重INH的肝毒性。有研究表明，氧化應激是INH和RFP聯(lián)用致肝損傷的機制之一[8]。

表4 給藥28 d后各組大鼠腸道菌群檢測結(jié)果

注a：與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)；b：與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)

肝臟指數(shù)反映肝組織腫脹的嚴重程度。本次實驗中，與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯升高；LcS高劑量組大鼠的肝臟指數(shù)較模型組大鼠明顯降低，一定程度上說明益生菌能減輕RFP和INH聯(lián)合所致肝損傷。

MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，SOD是防御超氧負離子損傷的重要酶，兩者在機體氧化-抗氧化平衡中起著重要的作用。MDA含量的高低間接反映了機體脂質(zhì)過氧化的嚴重程度[12]，SOD活力的高低反映了細胞清除自由基能力的大小。本次試驗中，與正常對照組相比，模型組大鼠肝勻漿中MDA含量升高，SOD活性降低，說明RFP和INH聯(lián)用能引起細胞脂質(zhì)過氧化增強，細胞清除自由基的能力下降，細胞氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡。補充LcS后，益生菌各組大鼠的肝勻漿MDA含量都有明顯降低，SOD活性升高。這一結(jié)果與王俊國等[13]和張書文等[14]等報道的結(jié)果一致。

ALT、AST和ALP活力與肝細胞損傷的嚴重程度相關(guān)。本次研究大鼠是在RFP和INH聯(lián)合灌胃28 d后，檢測其血清中ALT、AST和ALP水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT和ALP升高；與模型組相比，LcS高劑量組大鼠血清ALT和ALP水平明顯降低。TBA是膽固醇在肝臟的分解代謝產(chǎn)物，其代謝改變會直接影響正常的肝功。IBIL來自死亡的紅細胞，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為直接膽紅素，為膽汁的組成成分之一。DBIL和IBIL之和就是TBIL。當肝細胞受到損害，膽紅素不能直轉(zhuǎn)化為膽汁，膽汁排泄受阻，造成血中膽紅素升高。本次實驗中，與正常對照組相比，模型組大鼠血清中TBA、IBIL、DIIL、TBIL升高，與而王莉等[15]和何雪等[16]的研究結(jié)果一致。與模型組相比，LcS各組大鼠血清TBA水平降低；LcS中、高劑量組的DBIL和IBIL也明顯降低。

另外，筆者對實驗動物的腸道菌群進行了研究，結(jié)果顯示，各組大鼠的腸道菌群分布發(fā)生了改變，主要表現(xiàn)在與正常對照組相比，模型組大鼠糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量減少，糞球菌和大腸桿菌數(shù)量增加；與模型組相比，LcS各組大鼠糞便中雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量升高，糞球菌和大腸桿菌含量降低。有研究顯示，益生菌制劑可降低肝硬變、肝昏迷患者血漿內(nèi)毒素水平、改善肝功能[17]；可促進燙傷大鼠、肝硬變大鼠、急性肝損傷大鼠受損腸黏膜屏障修復，有效防治腸道細菌或內(nèi)毒素易位[18-19]。

綜上所述，LcS可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)紊亂，改善腸道屏障功能，對RFP和INH聯(lián)用所致大鼠肝損傷時發(fā)揮保護作用。LcS作為一種安全有效的活體微生物制劑，值得在肺結(jié)核患者抗結(jié)核藥物所致肝損傷的預防方面進行進一步推廣應用。

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(本文編輯：李敬文)

Protective effects of Lactobacillus casei on liver injury induced by rifampicin combined with isoniazid in rats

WANGYin,LIYuan-yuan,HAOHai-bo,LIANGHui,MAAi-guo.

InstituteofNutrition,MedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China

MAAi-guo,Email:magfood@126.com

Objective To explore the protective effect of Lactobacillus casei strain Shirota (LcS) on liver injury induced by rifampin (RFP) combined with isoniazid (INH) in rats. Methods Seventy-two specific pathogen free (SPF) male SD rats were randomly divided into 6 groups including normal control group, model group, low-dose, mid-dose and high-dose LcS groups, and bicyclol group (eachn=12). Rats in model group, low-dose, mid-dose, high-dose LcS groups and bicyclol group were given by gavage with INH (50 mg/kg) and RFP (50 mg/kg) once a day, and two hours later, low-dose, mid-dose, high-dose LcS groups were given by gavage LcS of 10×108CFU/kg, 20×108CFU/kg and 40×108CFU/kg, respevtivel; the normal control group were given by gavage with physiological saline (20 ml/kg) once a day, and the bicyclol group were given by gavage with bicylol (7.5 mg/kg) once a day. Total duration of the 6 groups was all 28 days. The 1iver index, superoxidedismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), alkaline phosphatase (ALP), total biliary acid (TBA), total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL) and indirect bilirubin (IBIL) wre tested and compared. Results When RFP and INH were given by gavage for 28 days, in model group, the liver index increased to (3.14 ± 0.15) %, the contents of MDA and SOD in model group were (4.52±0.52) nmol/mgprot and (72.51±11.05) U/mgprot, the ALT and ALP were (65.45±20.10) U/L and (322.79±61.73) U/L, the contents of TBA, TBIL, DBIL and IBIL were (91.34±16.93) μmol/L, (7.82±2.53) μmol/L, (4.70±1.29) μmol/L and (3.69±0.54) μmol/L, respectively. After supplement of LcS, the liver index of LcS high-dose group decreased to (2.88 ± 0.12) %; the content of MDA in the probiotics groups decreased significantly by (2.94±0.48) nmol/mgprot, (2.82±0.36) nmol/mgprot and (2.62±0.28) nmol/mgprot and the content of SOD in the probiotics groups significantly increased to (84.60±8.50) U/mgprot, (86.28±5.52) U/mgprot and (2.62±0.28) U/mgprot. Compared with the model group, the ALT and ALP of high-dose probiotics group decreased to (49.92±15.32) U/L and (280.70±54.32) U/L, respectively; the levels of TBA in low-dose, mid-dose and high-dose probiotics groups were also significantly decreased to (67.632±18.95) μmol/L,(55.322±19.17) μmol/L and (52.92±23.00) μmol/L, respectively; the DBIL of middle- and high-dose probiotics groups were significantly decreased to (3.64±1.68) μmol/L and (2.92±0.86) μmol/L, and the IBIL were significantly decreased to (3.21±0.22) μmol/L and (3.12±0.42) μmol/L, differences were statistically significant (P<0.05). Compared to model group, levels of TBA, TBIL, DBIL and IBIL in bicyclol group were reduced to (64.49±22.41) μmol/L, (6.33±1.46) μmol/L, (3.54±1.21) μmol/L and (3.01±0.36) μmol/L, respectively. Conclusion LcS could reduce the liver injury induced by RFP combined with INH in rats.

Lactobacilluscasei; Rifampin; Isoniazid; Drug-induced liver injury; Outcome and process assessment (health care); Animal experimentation

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.06.014

國家自然科學基金(81673160)

266021 青島大學醫(yī)學部營養(yǎng)研究所[王寅(研究生)、李園園(研究生)、郝海波(研究生)、梁惠、馬愛國]

馬愛國，Email：magfood@126.com

2017-03-03)