甘麗英 樊曉暉 楊海波

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·論著·

CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液與外周血中的表達水平及其意義

甘麗英 樊曉暉 楊海波

目的 探討結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液及外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞的表達水平及其意義。 方法 收集2015年3月至2016年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院未經(jīng)治療的40例胸腔積液患者的胸腔積液及外周血標(biāo)本，其中結(jié)核性胸膜炎患者20例，非結(jié)核性胸膜炎患者20例；另外選擇同期廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢人員18名作為正常對照組。40例胸腔積液患者通過胸腔穿刺采集胸腔積液，所有受試者通過真空采血法抽取外周血；用流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腔積液及外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量。對結(jié)核性胸膜炎組、非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量進行比較分析；對3組外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量進行比較分析；同時對結(jié)核性胸膜炎組、非結(jié)核性胸膜炎組的胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量進行相關(guān)性分析。 結(jié)果 結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(14.69±4.06)%]明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組[(9.75±3.40)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.19，P<0.01)。3組外周血CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.78，P=0.029)；其中結(jié)核性胸膜炎組外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(5.26±2.92)%]分別高于非結(jié)核性胸膜炎組[(3.76±2.07)%]和正常對照組[(3.29±1.79)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04，P=0.046；t=2.61，P=0.012)。結(jié)核性胸膜炎組中，胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(14.69±4.06)%、(5.26±2.92)%]呈正相關(guān)(r=0.54，P=0.013)；非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(9.75±3.40)%、(3.76±2.07)%]無相關(guān)性(r=0.03，P=0.424)。 結(jié)論 CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量的變化影響結(jié)核性胸膜炎的發(fā)生、發(fā)展，在其中可能扮演重要的免疫調(diào)節(jié)角色。

結(jié)核, 胸膜； T淋巴細(xì)胞亞群； 胸腔積液； 免疫調(diào)節(jié)

結(jié)核性胸膜炎是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)及其代謝產(chǎn)物結(jié)核蛋白進入機體胸膜腔引起的炎癥反應(yīng)，結(jié)核性胸膜炎患者治療不當(dāng)可導(dǎo)致胸膜粘連與增厚，從而引發(fā)不同程度的胸痛和胸悶，甚至出現(xiàn)包裹性積液、對側(cè)肺氣腫、膿胸等并發(fā)癥，嚴(yán)重者危害生命健康[1]。全球感染MTB的人數(shù)眾多，但僅有約5%的感染者發(fā)病，其發(fā)病的因素相對復(fù)雜，其中最重要的是感染的MTB的菌量及其毒力大小，以及機體的抗結(jié)核免疫能力，機體的免疫系統(tǒng)則發(fā)揮主要作用[2-3]。

結(jié)核病患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞，這一屬性導(dǎo)致結(jié)核性胸腔積液富含CD4+T淋巴細(xì)胞。目前，結(jié)核性胸膜炎的細(xì)胞免疫學(xué)機制尚未完全明確，有研究指出體內(nèi)因持續(xù)性抗原刺激導(dǎo)致的免疫缺陷是其發(fā)病的一項重要因素[4]。CD28是T細(xì)胞表面黏附分子，高表達于CD4+T淋巴細(xì)胞上，并稱為CD4+CD28+T淋巴細(xì)胞。機體針對抗原的持續(xù)免疫導(dǎo)致了免疫系統(tǒng)的衰老和重構(gòu)，初始多克隆高增殖的CD4+CD28+T淋巴細(xì)胞在抗原重復(fù)作用下，端?？s短、下調(diào)CD28轉(zhuǎn)化為記憶性，可形成寡克隆區(qū)帶有限增殖的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞，此時的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞是缺失CD28的CD4+T淋巴細(xì)胞，在不同基因背景和抗原環(huán)境的相互作用下，CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞明顯增殖，并介導(dǎo)了組織器官的免疫損傷，引起機體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯增強[5]。雖然國內(nèi)外對CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量在結(jié)核病中的變化情況進行過諸多研究，但是對CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞在結(jié)核性胸膜炎中產(chǎn)生的影響鮮有報道。因此，本研究主要以結(jié)核性胸膜炎患者T淋巴細(xì)胞為檢測對象，重點研究結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液及外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞的百分含量，進而分析CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞在結(jié)核性胸膜炎患者中的變化水平及其意義。

對象和方法

一、研究對象

選擇2015年3月至2016年12月期間在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的未經(jīng)抗結(jié)核治療的結(jié)核性胸膜炎患者20例。其中，男11例，女9例，年齡14～65歲，平均年齡(41.15±14.63)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床癥狀包含低熱、盜汗、干咳、胸痛、咯血等，臨床具有胸腔積液體征，經(jīng)胸部X線攝影和超聲檢查證實有胸腔積液，CT診斷及病原學(xué)檢查確診，經(jīng)胸腔穿刺抽液、胸腔積液檢查結(jié)果為滲出液，臨床抗結(jié)核藥物治療有效；所有患者近期內(nèi)均未使用過糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑,均未進行抗結(jié)核藥物治療，均無免疫相關(guān)性疾病，無臟器并發(fā)癥及其他感染，排除了其他原因引起的胸膜炎。

選擇同期廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的非結(jié)核性胸腔積液患者20例。其中，男12例，女8例，年齡18～69歲，平均(56.30±14.33)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：排除結(jié)核病和結(jié)核性胸膜炎導(dǎo)致胸腔積液的患者。其中肺癌11例、乳腺癌4例、膿胸2例、淋巴癌3例，均經(jīng)臨床確診。

選擇同期廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者18名作為正常對照組。其中，男10名，女8名，年齡27～51歲，平均(39.03±10.67)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：各項生化指標(biāo)，與免疫相關(guān)指標(biāo)及心、肝、腎功能均正常。

二、方法

1. 標(biāo)本采集：所有結(jié)核性胸膜炎患者與非結(jié)核性胸膜炎患者均于入院接受正規(guī)治療前抽取外周血2 ml及胸腔積液50 ml；正常對照組健康體檢者僅抽取外周血2 ml。所有外周血均于清晨空腹抽取并用肝素抗凝。此研究通過廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核，受試者均知情同意。

2. 標(biāo)本檢測：(1)外周血與紅細(xì)胞裂解液以1︰3 的比例漩渦混勻，冰上靜置15 min，450×g離心10 min棄上清，沉淀白細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，經(jīng)密度梯度離心法用淋巴細(xì)胞分離液分離提取云霧層淋巴細(xì)胞；(2)胸腔積液以離心半徑15 cm，1000 r/min離心10 min后棄上清，沉淀細(xì)胞用PBS重懸，經(jīng)密度梯度離心法用淋巴細(xì)胞分離液分離提取云霧層淋巴細(xì)胞；(3)外周血和胸腔積液分離提取的淋巴細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入流式管中，實驗管孵育相應(yīng)熒光標(biāo)記的抗體[藻紅蛋白標(biāo)記小鼠抗人CD4抗體(PE mouse anti-human CD4)、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的小鼠抗人CD28抗體(FITC mouse anti-human CD28)]，同型管孵育相應(yīng)的同型對照異硫氰酸熒光素標(biāo)記的小鼠IgG 1 K型抗體(FITC mouse IgG 1 K isotype control)。室溫避光孵育30 min，終止孵育并應(yīng)用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)上樣檢測；(4)紅細(xì)胞裂解液及淋巴細(xì)胞分離液均購自北京索萊寶科技有限公司；熒光標(biāo)記物PE mouse anti-human CD4、FITC mouse anti-human CD28、FITC mouse IgG1 K isotype control均購自美國BD公司。選擇CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞群作為鑒定，將流式細(xì)胞儀檢測后的結(jié)果用其配套CellQuest軟件分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、CD4+、CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量在各組中的比較

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量在3組人群外周血之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.42，P<0.01；F=21.57，P<0.01)；相比于正常對照組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞百分含量，結(jié)核性胸膜炎組和非結(jié)核性胸膜炎組均較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.07，P<0.01；t=3.44，P<0.01)；而相比于正常對照組外周血CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量，僅在結(jié)核性胸膜炎組中表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.04，P<0.01)，與非結(jié)核性胸膜炎組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.98，P=0.331)。對于胸腔積液CD4+T淋巴細(xì)胞百分含量，結(jié)核性胸膜炎組高于非結(jié)核性胸膜炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.20，P=0.035)；而結(jié)核性胸膜炎組CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量低于非結(jié)核性胸膜炎組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.31，P<0.01)。正常對照組及非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液及外周血的CD4+/CD28+T淋巴細(xì)胞比值<1.5，而結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液及外周血CD4+/CD28+T淋巴細(xì)胞比值>1.5(表1)。

二、CD4+、CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量的相關(guān)性

在此基礎(chǔ)上，對各組CD4+與CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+與CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量呈正相關(guān)(r=0.59，P=0.027)，CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量少于CD4+T淋巴細(xì)胞百分含量(t=4.18，P<0.01)，而結(jié)核性胸膜炎組外周血和非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液及外周血中CD4+與CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量均不相關(guān)(r=0.20，P=0.431；r=0.13，P=0.575；r=0.37，P=0.105)。

三、不同組別CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量在胸腔積液及外周血中的比較及相關(guān)性

結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(14.69±4.06)%]明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組[(9.75±3.40)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.19，P<0.01)。外周血CD4+CD28-T

表1 3組患者胸腔積液、外周血CD4+、CD28+ T淋巴細(xì)胞水平的比較

表2 胸腔積液及外周血中CD4+ CD28- T淋巴細(xì)胞百分含量在各組間的比較

注 “-”表示未進行該項檢測

淋巴細(xì)胞百分含量在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.78，P=0.029)，結(jié)核性胸膜炎組外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(5.26±2.92)%]分別高于非結(jié)核性胸膜炎組[(3.76±2.07)%]和正常對照組[(3.29±1.79)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04，P=0.046；t=2.61，P=0.012)；但非結(jié)核性胸膜炎組和正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.62，P=0.536)。結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(14.69±4.06)%]明顯高于外周血[(5.26±2.92)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.48，P<0.01)，非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量[(9.75±3.40)%]也明顯高于外周血[(3.76±2.07)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.72，P=0.027)，結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量呈正相關(guān)(r=0.54，P=0.013)，非結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量無相關(guān)性(r=0.03，P=0.424)(表2)。

討 論

結(jié)核性胸膜炎可誘發(fā)滲出性胸腔積液，是由于MTB及其代謝產(chǎn)物刺激胸膜而引起的一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞是機體細(xì)胞免疫功能的主要效應(yīng)細(xì)胞，其中包含CD8+、CD4+等T淋巴細(xì)胞亞群，并在機體中保持穩(wěn)態(tài)，平衡一旦被打破，機體免疫功能降低易受病菌侵害。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素2(IL-2)可通過調(diào)節(jié)結(jié)核性胸膜炎患者CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的表達水平進而糾正患者免疫功能失調(diào)[6]。MTB為兼性胞內(nèi)寄生菌，因而機體抗結(jié)核特異性免疫主要以細(xì)胞免疫為主，其中CD4+T淋巴細(xì)胞是結(jié)核病患者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞[7-8]。機體抗結(jié)核免疫中，CD4+T淋巴細(xì)胞作為輔助性T淋巴細(xì)胞亞群可促進免疫細(xì)胞增殖分化并在機體中放大免疫效應(yīng)，進而增強免疫功能，對抗消滅MTB。Lazarevic等[9]研究指出CD4+T淋巴細(xì)胞的下降程度與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

CD28是一種同源二聚體糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員，可表達在95%的CD4+T淋巴細(xì)胞上，并參與調(diào)控免疫應(yīng)答的起始、擴大、維持和下調(diào)，尤其在免疫維持中起重要的作用；它能維持適量、有功能的T細(xì)胞存活，并保證特異性免疫應(yīng)答，此外還可能涉及T細(xì)胞的成熟、分化及下調(diào)，CD28協(xié)同刺激活化T細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，在保證機體體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)的同時，對外來抗原可產(chǎn)生特異應(yīng)答[10]。T細(xì)胞活化需要兩個信號，其中第二信號(CD28/B7)由抗原呈遞細(xì)胞上的B7分子與T淋巴細(xì)胞上的CD28的結(jié)合而提供；CD28是 T淋巴細(xì)胞最主要的第二信號受體，高表達于CD4+T淋巴細(xì)胞并發(fā)揮免疫效應(yīng)，CD28/B7途徑對于抗結(jié)核的Th1活化非常關(guān)鍵，缺乏CD28的T淋巴細(xì)胞活化將導(dǎo)致機體對MTB的免疫無反應(yīng)性[11]。Bernal-Fernandez等[12]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者外周血中CD4+CD28+T淋巴細(xì)胞下降明顯。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎組無論胸腔積液還是外周血的CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量均明顯低于對應(yīng)非結(jié)核性胸膜炎組和正常對照組，符合多克隆高增殖的CD4+CD28+T淋巴細(xì)胞在抗原重復(fù)作用下，端?？s短、下調(diào)CD28轉(zhuǎn)化為有限增殖的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞這一說法，CD4+/CD28+T淋巴細(xì)胞比值在結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液和外周血均升高。且發(fā)現(xiàn)結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+T淋巴細(xì)胞與CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量呈正相關(guān)(r=0.59，P=0.027)，結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液CD4+T淋巴細(xì)胞可隨著CD28+T淋巴細(xì)胞降低而降低，CD28+T淋巴細(xì)胞百分含量降低進而減少CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。提示結(jié)核性胸膜炎患者T淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡，其免疫功能失調(diào)與胸腔積液CD4+、CD28+T淋巴細(xì)胞比例紊亂相關(guān)。

Cretney等[13]研究表明，T細(xì)胞亞群的相對比例可能與患者的免疫功能狀態(tài)和病情進展密切相關(guān)，CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞數(shù)量的增多與多種自身免疫性和慢性炎癥疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性血管炎、動脈粥樣硬化、腦梗死及不穩(wěn)定心絞痛等相關(guān)[14]。Xu等[15]報道Kv1.3鉀離子通道阻斷可降低急性冠狀動脈綜合征患者CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素(IFN-γ)及穿孔素。其次，CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞也可表達殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer immunoglobulin-like receptors，KIRs)，其具有細(xì)胞毒效應(yīng)，活化后可釋放穿孔素進而殺傷靶細(xì)胞，如果表達升高將導(dǎo)致機體的免疫功能受到抑制，提示其在疾病發(fā)展中扮演了致病的角色[16]。

本研究運用流式細(xì)胞術(shù)，以結(jié)核性胸膜炎患者為研究對象，對結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液及外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量進行分析，結(jié)果顯示結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液及外周血中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量均明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組及正常對照組，在結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液中CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量增加尤為明顯，并且結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液和外周血的CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞百分含量呈正相關(guān)，說明CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞可能參與了結(jié)核性胸膜炎的病理過程，CD4+CD28-T淋巴細(xì)胞的比例變化可影響結(jié)核性胸膜炎的發(fā)生、發(fā)展，在其中可能扮演重要的免疫調(diào)節(jié)角色。

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(本文編輯：郭萌)

The levels and significance of CD4+CD28-T lymphocytes in pleural effusion and peripheral blood in patients with tuberculous pleurisy

GANLi-ying，F(xiàn)ANXiao-hui，YANGHai-bo.

DepartmentofMicrobiology,SchoolofBasicMedicine,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530022,China

s：FANXiao-hui，Email：fanxiaohui63@163.com；YANGHai-bo，Email：yanghaibo33@hotmail.com

Objective To investigate the levels and significance of CD4+CD28-T lymphocytes in the pleural effusion and peripheral blood of patients with tuberculous pleurisy. Methods Pleural effusion and peripheral blood samples were collected from 40 patients with pleural effusion, including 20 cases with tuberculous pleurisy and 20 with non-tuberculous pleurisy, in the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University from March 2015 to December 2016 before the onset of treatment. Peripheral blood samples were also collected from 18 healthy individuals at the medical examination center of the same hospital and served as a control group. Pleural effusions were collected by thoracentesis and peripheral blood samples by vacuum blood collection. The percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in the pleural effusion of the tuberculous and non-tuberculous pleurisy groups, measured by flow cytometry, was compared, as was the percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in the peripheral blood from the three groups. Correlation analysis of the percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in the pleural effusion and peripheral blood in each group was also performed. Results The percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in the pleural effusion was significantly higher in the tuberculous pleurisy group than in the non-tuberculous pleurisy group ((14.69±4.06) % vs. (9.75 ±3.40) %,t=4.19，P<0.01). The percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in peripheral blood was significantly different between the three groups (F=3.78,P=0.029); the percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in peripheral blood was higher in the tuberculous pleurisy group than in the non-tuberculous group and the healthy control group ((5.26±2.92) % vs. (3.76±2.07) %,t=2.04,P=0.046); (5.26±2.92) % vs. (3.29 ±1.79) %,t=2.61,P=0.012). The percentage of CD4+CD28-T lymphocytes in the pleural effusion was positively correlated with that in peripheral blood in the tuberculous pleurisy group ((14.69±4.06)% vs (5.26±2.92)%;r=0.54,P=0.013), but not in non-tuberculous pleurisy group ((9.75±3.40)% vs (3.76±2.07)%;r=0.03,P=0.424). Conclusion Changes in the proportion of CD4+CD28-T lymphocytes affect the development of tuberculous pleurisy, and may play an important role in the immunoregulation of tuberculous pleurisy.

Tuberculosis, pleural; T-lymphocyte subsets; Pleural effusion; Immunomodulation

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.06.013

國家自然科學(xué)基金(81360243)

530022 南寧，廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室

樊曉暉，Email：fanxiaohui63@163.com；楊海波，Email：yanghaibo33@hotmail.com

2017-03-06)

注：樊曉暉和楊海波為并列通信作者