魏永忠

(遼寧省實驗林場，遼寧 撫順 113311)

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板栗花粉活力測定方法比較

魏永忠

(遼寧省實驗林場，遼寧 撫順 113311)

為建立板栗高效快速的花粉活力測定方法，分別采用了TCC染色法、I2-KI染色法和固體培養(yǎng)基萌發(fā)法對板栗花粉活力進(jìn)行了測定比較。結(jié)果表明：采用TCC染色法和I2-KI染色法染色后花粉的不易辨識，測定結(jié)果偏低，不適合作為板栗花粉活力的測定方法；固體培養(yǎng)基萌發(fā)法辨識度高，萌發(fā)率高，適合作為板栗花粉活力的測定方法。

板栗；花粉活力；萌發(fā)率；染色法

板栗(Castaneacrenata)是我國東北地區(qū)重要的野生資源，具有良好的經(jīng)濟(jì)價值，由于其果實豐富的營養(yǎng)價值，不論是鮮果還是加工產(chǎn)品深受老百姓喜愛，是我國北方山地農(nóng)林增收的重要手段，栽培面積較大，是該地區(qū)重要的木本糧油作物。在生產(chǎn)和育種實踐中，都需要明確種質(zhì)資源的花粉的萌發(fā)能力。但目前，關(guān)于板栗花粉活力的測定方法尚未開展系統(tǒng)研究。鑒于此，筆者參照杜鵑[2]、玉米[3]、木薯[4]、韭菜[5]等植物花粉活力測定方法對板栗花粉活力測定方法進(jìn)行比較，旨在為建立快速有效的板栗花粉活力測定方法為人工授粉育種和授粉樹配置提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016年5月采自遼寧省鳳城市紅旗鎮(zhèn)，采集待開放的雄花花序的健壯枝條。采集后送往實驗室陰涼處水培1d后收集新鮮花粉。待花藥散出花粉粒后，收集花粉粒于試管內(nèi)-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

碘(I2)、碘化鉀(KI)、氯化三苯基四氮唑(TCC)等均為分析純，購自北京索萊寶生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

TCC染色法：在載玻片上涂勻花粉后加1滴TTC溶液并蓋上蓋玻片。將樣品放置于20℃培養(yǎng)箱，10 min后取出進(jìn)行顯微觀察。以紅色認(rèn)定花粉可萌發(fā)。紅色的花粉數(shù)總數(shù)與觀察的花粉總數(shù)比值為花粉萌發(fā)率。

I2-KI染色法：將少量花粉均勻置于載玻片后加1滴I2-KI溶液，2 min后取出顯微觀察。凡染成藍(lán)紫色認(rèn)定為花粉可萌發(fā)。藍(lán)紫色的花粉數(shù)總數(shù)與觀察的花粉總數(shù)比值為花粉萌發(fā)率。

固體培養(yǎng)基萌發(fā)法：培養(yǎng)基做如下配制：1.0%瓊脂，蔗糖濃度分別為5%、10%、15%和20%，硼酸濃度分別為0.010 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1，其他元素的添加參照胡適宜的方法[6]。培養(yǎng)基熔解后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。冷卻后，用牙簽蘸取少量花粉均勻彈在培養(yǎng)基上，帶花粉的培養(yǎng)基放置于20℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)24h。顯微鏡下測定萌發(fā)率。萌發(fā)的花粉數(shù)總數(shù)與觀察的花粉總數(shù)比值為花粉萌發(fā)率。

以上3種方法均在4倍顯微鏡下，要求觀察花粉總數(shù)大于200。每種方法重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基條件對花粉發(fā)芽率測定的影響

試驗中，選用4水平蔗糖濃度及3水平硼酸濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)板栗花粉并測定其萌發(fā)率，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，同水平的硼酸濃度下，當(dāng)蔗糖濃度在5%～15%區(qū)間內(nèi)，花粉的萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增加而逐漸升高；當(dāng)蔗糖濃度超過15%時，萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增加反而降低。15%時的花粉萌發(fā)率均為最高值，萌發(fā)率分別為77.3%、68.9%和74.3%。實驗結(jié)果表明，同水平的蔗糖濃度下，硼酸濃度對板栗花粉萌發(fā)作用規(guī)律不明顯。15%蔗糖濃度條件下，最佳的硼酸濃度為0.01 mg·mL-1，此時花粉萌發(fā)率最高，達(dá)到77.3%。

圖1 不同蔗糖、硼酸濃度對花粉萌發(fā)率的影響

2.2 不同方法測定板栗花粉生活力的比較

采用TTC染色法，花粉均呈淡紅色，顏色的深淺差異不明顯，對花粉粒活力狀況辨識困難。采用I2-KI染色法，花粉呈藍(lán)色，顏色的深淺差異同樣不明顯，辨識度差。此外，從表1可以看出，采用染色法的測定結(jié)果均低于固體培養(yǎng)基萌發(fā)法。固體培養(yǎng)基萌發(fā)法與如上2種染色方法相比，花粉萌發(fā)率測定值最高，且不必通過花粉的顏色辨識花粉的活力情況，判斷方法客觀、準(zhǔn)確。因此，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC法和I2-KI法更適用于板栗花粉活力的測定。

表1 不同方法對板栗花粉生活力的測定比較

測定方法花粉平均萌發(fā)率5%顯著水平TTC染色法56.3%cI2-KI染色法46.5%c固體培養(yǎng)基萌發(fā)法77.3%a

3 結(jié)論與討論

在比較蔗糖和硼酸濃度對板栗花粉生活力的影響時發(fā)現(xiàn)：在一定范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度的提高花粉的萌發(fā)率也在增加，超過此范圍就起到相反的作用。這是因為蔗糖不僅為花粉管的萌發(fā)提供能量，同時還參與細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。當(dāng)蔗糖濃度在未打破滲透壓平衡時，隨著濃度的增加花粉營養(yǎng)供給越充分，花粉萌發(fā)率越高；當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到并超過一定值后會打破這種平衡，產(chǎn)生細(xì)胞脫水現(xiàn)象而抑制了花粉的萌發(fā)。

硼元素對花粉也很重要，這是因為硼的缺乏會導(dǎo)致花粉粒中脫氫酶活性降低而使呼吸作用受到抑制，最終影響花粉萌發(fā)。本研究未發(fā)現(xiàn)硼酸濃度對板栗花粉萌發(fā)的作用的規(guī)律性，這可能因為一定蔗糖濃度條件下花粉對硼元素量需求存在差異。

比較3種測定板栗花粉生活力方法發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC染色法和I2-KI染色法更容易掌握，結(jié)果準(zhǔn)確性更高，更適合作為板栗花粉活力的標(biāo)準(zhǔn)測定方法。兩種染色法測定花粉的生活力雖然具有步驟簡單的優(yōu)點，但測定結(jié)果低于固體培養(yǎng)基的測定方法，這可能與花粉壁厚度有關(guān)，增加了測定的誤差。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第十二卷)[M].北京：科學(xué)出版社,1998.

[2] 張超儀,耿興敏.六種杜鵑花屬植物花粉活力測定方法的比較研究[J].植物科學(xué)學(xué)報,2012,30( 1):92～99．

[3] 王燕哲,崔彥宏,張麗華,等,玉米花粉活力測定方法的比較研究[J].玉米科學(xué),2010,18(3):173～176．

[4] 俞奔馳,李軍,盤歡,等.木薯花粉活力測定及驗證試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,(13):25～27.

[5] 汪妮,張志軒,董自梅.韭菜花粉生活力測定方法的篩選研究[J].長江蔬菜,2009,(2):53～54.

[6] 胡適宜.花粉生活力的測定[J].植物學(xué)通報,1993,70(2):60～62.

Comparison onCastaneacrenataPollen Viability Determination Methods

WEI Yong-zhong

(Experimental Forest Farm of Liaoning,Fushun 113311,Liaoning,China)

In order to find out the quicker and easier methods of determining the pollen viability ofCastaneacrenata,the pollen viability were detected by methods of I-KI，T TC and solid medium.According to the results,methods of the staining with TTC and I2-KI were difficult to determine the pollen viability,but solid medium germination method was suitable to be used to detect the pollen viability

Castaneacrenata,Pollen viability,Staining,Germination rate

2016-12-29

魏永忠(1968-)，遼寧撫順人，本科，現(xiàn)從事樹木生產(chǎn)與管理工作。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.02.023

S722.3

A

1003-5508(2017)03-0100-02