王世飛，景遠文，李海瑞，黃馳雄，盧永康，賓建平*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510515；2.深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院，廣東 深圳 518112)

超聲聯(lián)合微泡對不同凝齡富血小板血栓和富紅細胞血栓的溶栓效果

王世飛1，景遠文1，李海瑞1，黃馳雄1，盧永康2，賓建平1*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510515；2.深圳市孫逸仙心血管醫(yī)院，廣東 深圳 518112)

目的 探討超聲聯(lián)合微泡對不同凝齡富血小板血栓(PRT)和富紅細胞血栓(ERT)的溶栓效果。方法 分別于體外和大鼠體內(nèi)頸總動脈制備不同凝齡的PRT和ERT。離體及在體實驗均分為4組，即離體PRT 3 h組、離體PRT 24 h組、離體ERT 3 h組、離體ERT 24 h組及在體PRT 3 h組、在體PRT 24 h組、在體ERT 3 h組、在體ERT 24 h組；分別于體外循環(huán)裝置和大鼠頸總動脈血栓模型中進行超聲聯(lián)合微泡溶栓實驗，并采集超聲圖像。行病理組織學(xué)檢查以驗證血栓成分。離體實驗主要分析溶栓后管腔橫截面積增加百分比及溶栓率，在體實驗主要分析溶栓后血管再通率及頸總動脈血流速度。結(jié)果 溶栓治療后，離體及在體實驗顯示：PRT 3 h組與ERT 3 h組管腔橫截面積增加百分比[(121.12±13.21)% vs (130.09±15.34)%]、溶栓率[(39.83±7.09)% vs (42.14±5.17)%]、血管再通率(83.33% vs 91.67%)及頸總動脈血流速度[(0.21±0.02)m/s vs (0.22±0.01)m/s]差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。PRT 24 h組與ERT 24 h組比較、PRT 24 h組與PRT 3 h組比較、ERT 24 h組與ERT 3 h組比較，管腔橫截面積增加百分比、溶栓率、血管再通率、頸總動脈血流速度均下降(P均<0.05)。與ERT 24 h組比較，PRT 24 h組管腔橫截面積增加百分比、溶栓率、血管再通率及頸總動脈血流速度均下降(P均<0.05)。結(jié)論 超聲聯(lián)合微泡對溶解離體及在體大鼠頸總動脈PRT和ERT的效果隨血栓凝齡的增加而下降，且以PRT為著。

血栓凝齡；超聲檢查；微泡；血小板；紅細胞；溶栓

研究[1-6]證實，超聲聯(lián)合微泡可有效溶解體外血栓及冠狀動脈、大腦中動脈、下肢靜脈等大血管血栓，其主要機制為超聲的空化效應(yīng)。但各研究中血栓形成時間相對較均一，主要在3～6 h以內(nèi)[1-6]，而臨床多數(shù)患者血栓形成的時間差異較大，從數(shù)小時至數(shù)十小時不等。本課題組前期研究[7]表明超聲聯(lián)合微泡可有效溶解富血小板血栓(platelet-rich thrombus， PRT)和富紅細胞血栓 (erythrocyte-rich thrombus， ERT)，改善大鼠急性缺血性腦卒中模型的預(yù)后。本實驗擬分別在體外循環(huán)裝置和大鼠頸總動脈血栓模型中探討超聲聯(lián)合微泡對不同凝齡PRT和ERT的溶栓效果，以期為超聲聯(lián)合微泡溶栓治療時間窗的選擇提供有價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠66只(購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，體質(zhì)量250～300 g。脂質(zhì)微泡由南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，平均粒徑(2.03±1.18)μm，濃度約2.0×109/ml～4.3×109/ml。本實驗經(jīng)動物實驗倫理委員會審批。

1.2血栓體外實驗

1.2.1PRT的制備 將5只SD大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，抽取主動脈血，加入4%檸檬酸鈉溶液抗凝，1300 rpm離心10 min，分別吸取上層富血小板血漿及下層紅細胞懸液混合，加入凝血酶促凝。夾閉橡皮管下端，經(jīng)上端加入已混勻促凝劑的富血小板血漿。共制備14個血栓樣本。血栓制備后于4℃分別放置3 h(離體PRT 3 h組，7個樣本)和24 h(離體PRT 24 h組，7個樣本)，使血栓充分凝固、收縮。

1.2.2ERT的制備 將5只SD大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，抽取主動脈血。夾閉橡皮管下端，經(jīng)上端加入主動脈血。共制備14個血栓樣本。血栓制備后于4℃分別放置3 h(離體ERT 3 h組，7個樣本)和24 h(離體ERT 24 h組，7個樣本)，使血栓充分凝固、收縮。

1.2.3離體血栓組織學(xué)檢查 體外血栓制備后，以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，進行光學(xué)顯微鏡下觀察。以戊二醛固定，進行電子顯微鏡下觀察。在離體PRT 3 h組、離體PRT 24 h組、離體ERT 3 h組和離體ERT 24 h組中，每組隨機抽取2個樣本進行組織學(xué)檢查。

1.2.4體外循環(huán)裝置溶栓實驗 安裝體外循環(huán)溶栓裝置(圖1)。以恒流泵維持裝置內(nèi)PBS溶液流速為20 cm/s，并以水浴鍋維持溫度為37℃。以微量輸液泵經(jīng)側(cè)孔注入脂質(zhì)微泡，持續(xù)30 min。超聲輻照采用Siemens Sequoia 512超聲儀，4V1C型探頭，頻率2 MHz，機械指數(shù)1.9，間歇輻照模式(輻照10 s，間歇10 s)，持續(xù)30 min。在離體PRT 3 h組、離體PRT 24 h組、離體ERT 3 h組和離體ERT 24 h組中，每組5個樣本進行超聲聯(lián)合微泡溶栓實驗。

圖1 體外溶栓裝置示意圖

1.2.5體外血栓超聲檢查 采用Siemens Sequoia 512超聲儀，15L8探頭，頻率2 MHz，分別于溶栓前及溶栓后即刻采集各組離體血栓的二維超聲圖像，測量溶栓前后的管腔橫截面，計算管腔橫截面增加百分比，管腔橫截面增加百分比=(溶栓后管腔橫截面面積-溶栓前管腔橫截面面積)/溶栓前管腔橫截面面積×100%。

1.2.6溶栓率 對各組離體血栓均于溶栓前及溶栓后即刻分別以電子天平測量其平均濕重，計算溶栓率。溶栓率=(溶栓前質(zhì)量-溶栓后質(zhì)量)/溶栓前質(zhì)量×100%。

1.3SD大鼠頸總動脈血栓在體實驗

1.3.1建立PRT模型 將28只SD大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，逐層鈍性分離頸總動脈。將浸泡有10%三氯化鐵溶液的濾紙片置于頸總動脈下方，約10 min后撤去濾紙，即可形成PRT[8]，從而建立大鼠頸總動脈PRT模型。建模后3 h和24 h者即為在體PRT 3 h組(n=14)和在體PRT 24 h組 (n=14)。

1.3.2建立ERT模型 將28只SD大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，逐層鈍性分離頸總動脈。短暫夾閉頸總動脈近端及遠端(間隔約0.5 cm)，向夾閉的頸總動脈內(nèi)注射少量凝血酶，約2 min后松開夾閉動脈，即可形成ERT[9]，從而建立大鼠頸總動脈PRT模型。建模后3 h和24 h者即為在體ERT 3 h組(n=14)和在體ERT 24 h組(n=14)。

1.3.3在體血栓組織學(xué)檢查 于在體PRT 3 h組、在體PRT 24 h組、在體ERT 3 h組和在體ERT 24 h組中，每組隨機抽取2只進行組織學(xué)檢查。取大鼠頸總動脈行冰凍切片，經(jīng)預(yù)冷丙酮溶液固定后常規(guī)行HE染色及免疫組化染色(標記血小板GP Ⅱb/Ⅲa)，以判斷小鼠頸總動脈動脈內(nèi)是否形成相應(yīng)的血栓。

1.3.4在體血栓模型溶栓實驗 對在體PRT 3 h組、在體PRT 24 h組、在體ERT 3 h組和在體ERT 24 h組各12只頸總動脈血栓SD大鼠模型，均以微量輸液泵經(jīng)尾靜脈注入0.2 ml脂質(zhì)微泡，在25 min分鐘內(nèi)輸注完畢。采用Siemens Sequoia 512超聲儀進行超聲輻照，4V1C型探頭，頻率2 MHz，機械指數(shù)1.9，間歇輻照模式(輻照10 s，間歇10 s)，持續(xù)30 min。

1.3.5在體血栓超聲圖像采集 采用Siemens Sequoia 512超聲儀，15L8探頭，頻率2 MHz。分別于超聲聯(lián)合微泡溶栓治療前及治療后即刻采集頸總動脈二維超聲圖像及脈沖多普勒圖像，觀察溶栓后大鼠頸總動脈血流情況，可探及血流則認為血管再通，并測量血流速度。計算在體血栓各組的再通率，再通率=頸總動脈再通大鼠數(shù)量/總數(shù)量×100%。

2 結(jié)果

2.1體外實驗

2.1.1體外血栓組織學(xué)檢查 離體PRT 3 h組及離體PRT 24 h組血栓均可見血小板小梁結(jié)構(gòu)，并見散在紅細胞；離體ERT 3 h組及離體ERT 24 h組血栓均可見大量紅細胞，并見散在纖維蛋白網(wǎng)格。隨著血栓凝齡增加，PRT和ERT均凝固、收縮，組織學(xué)表現(xiàn)為紅細胞間隙變小，纖維蛋白網(wǎng)更加致密(圖2)。

2.1.2離體血栓超聲表現(xiàn) 聲像圖顯示溶栓后離體血栓各組管腔橫截面均較溶栓前增大(圖3)。離體PRT 24 h組與離體PRT 3 h組 [(58.43±12.28)% vs (121.12±13.21)%]比較、離體ERT 24 h組與離體ERT 3 h組 [(95.35±16.47)% vs (130.09±15.34)%]比較，溶栓后管腔橫截面增加百分比均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。離體PRT 24 h組與離體ERT 24 h組比較，溶栓后管腔橫截面增加百分比減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。離體PRT 3 h組與離體ERT 3 h組溶栓后管腔橫截面增加百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.3溶栓率 離體PRT 24 h組與離體PRT 3 h組[(20.04±8.19)% vs (39.83±7.09)%]比較、離體ERT 24 h組與離體ERT 3 h組[(35.21±5.26)% vs (42.14±5.17)%]比較，溶栓率均出現(xiàn)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。離體PRT 24 h組與離體ERT 24 h組比較，溶栓率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。離體PRT 3 h組與離體ERT 3 h組溶栓率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2在體實驗

2.2.1在體血栓組織學(xué)檢查 在體PRT 3 h組及在體PRT 24 h組頸總動脈管腔中均見大量血小板小梁形成的交差網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；在體ERT 3 h組及在體ERT 24 h組均可見大量紅細胞，而血小板含量較少。見圖4。

2.2.2在體血栓超聲表現(xiàn) 聲像圖顯示在體血栓各組SD大鼠溶栓前頸總動脈內(nèi)均可見血栓形成(圖5)。溶栓后在體PRT 3 h組、在體ERT 3 h組、在體PRT 24 h組和在體ERT 24 h組頸總動脈再通率分別為83.33%(10/12)、91.67%(11/12)、41.67%(5/12)和66.67%(8/12)；各組血栓成功再通模型中頸總動脈血流速度分別為(0.21±0.02)m/s、(0.22±0.01)m/s、(0.13±0.02)m/s和(0.16±0.01)m/s。溶栓后在體PRT 3 h組與在體ERT 3 h組血管再通率及血流速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。在體PRT 24 h組與在體PRT 3 h組比較、在體ERT 24 h組與在體ERT 3 h組比較，血管再通率及血流速度均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與在體ERT 24 h組比較，在體PRT 24 h組血管再通率及血流速度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

圖2 體外血栓組織學(xué)檢查 A～C.光學(xué)顯微鏡下離體PRT 3 h(HE，×100)、24 h(HE，×100)及電子顯微鏡下離體PRT 24 h(×3 000)可見血小板小梁結(jié)構(gòu)及散在紅細胞，隨血栓凝齡增加PRT更加致密化； D～F.光學(xué)顯微鏡下離體ERT 3 h(HE，×100)、24 h(HE，×100)及電子顯微鏡下離體ERT 24 h(×3 000)可見大量紅細胞及散在的纖維蛋白網(wǎng)，隨血栓凝齡增加ERT更加致密化

圖3 PRT及ERT超聲聯(lián)合微泡治療前后管腔橫截面二維超聲圖像 A、B.PRT治療前和治療后3 h; C、D.PRT治療前和治療后24 h; E、F.ERT治療前和治療后3 h; G、H.ERT治療前和治療后24 h

3 討論

本研究主要在體外模型和大鼠體內(nèi)頸總動脈血栓模型中探討超聲聯(lián)合微泡對不同凝齡PRT和ERT的溶栓效果，結(jié)果表明超聲聯(lián)合微泡能夠明顯溶解PRT及ERT，其溶栓效果隨血栓凝齡的增加而下降，超聲聯(lián)合微泡溶解新鮮PRT及ERT效果相似，而隨著血栓凝齡的增加，其對2種血栓的溶栓效果均下降，其中以PRT更明顯。

圖4 在體大鼠頸總動脈血栓模型組織學(xué)檢查 A、B.HE染色(A)光學(xué)顯微鏡下(×100)PRT 24 h組可見大量血小板小梁形成交差網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，免疫組化染色(B)顯示血小板含量較高； C、D.HE染色(C)光學(xué)顯微鏡下(×100)ERT 24 h組可見大量紅細胞，免疫組化染色(D)顯示大量紅細胞，血小板含量少

圖5 在體大鼠頸總動脈血栓模型超聲聯(lián)合微泡溶栓效果 治療前后大鼠頸總動脈管腔二維超聲(A～J)及脈沖多普勒超聲(K～O)圖像，超聲聯(lián)合微泡治療后頸總動脈再通、血流速度增加

臨床患者血栓形成時間不同[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，超聲聯(lián)合微泡溶栓效果隨血栓凝齡的增加而下降。理論上，新鮮血栓內(nèi)部水分較多，纖維蛋白網(wǎng)稀疏，結(jié)構(gòu)較疏松，內(nèi)部存在較多微孔道，可為微泡進入血栓內(nèi)部提供通道，從而增強超聲聯(lián)合微泡治療的溶栓效果；隨著血栓凝齡的增加，血栓逐漸收縮、致密，血栓內(nèi)水分及微孔道減少，使得進入血栓內(nèi)部的微泡減少，且微泡僅與血栓表面接觸，加之血栓結(jié)構(gòu)的變化可影響超聲對血栓的生物學(xué)效應(yīng)，因此超聲聯(lián)合微泡治療對陳舊血栓的溶栓效果較差。本研究中，隨著血栓凝齡的增加，PRT和ERT均更加致密化，超聲聯(lián)合微泡的溶栓效果下降，與Xie等[12]的研究相似。與ERT相比，超聲聯(lián)合微泡溶解陳舊PRT的效果受血栓凝齡增加的影響更大，原因在于PRT血小板含量較多，而血小板活化可引起血栓明顯收縮[13]。隨著血栓凝齡的增加，陳舊PRT較ERT更致密，微泡進入血栓內(nèi)部通道進一步減少，微泡僅能在血栓表面與血栓發(fā)生相互作用，因此超聲聯(lián)合微泡對其溶解能力更差。

有研究[14]報道，在體外提高超聲溶栓機械指數(shù)(機械指數(shù)為3)可提高其對血栓凝齡較大血栓的溶栓效果，但高機械指數(shù)在體內(nèi)可能對微血管產(chǎn)生破壞作用，嚴重情況下可導(dǎo)致局部出血。為確保良好的溶栓效果及減少溶栓的不良反應(yīng)，進行超聲聯(lián)合微泡溶栓應(yīng)盡量在血栓形成的早期進行，尤其是針對PRT，溶栓越早進行效果越好。

總之，本實驗結(jié)果表明超聲聯(lián)合微泡溶解PRT和ERT的效果隨血栓凝齡的增加而下降，血栓凝齡越小溶栓效果越好，尤其以PRT為甚。

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Efficacy of microbubble-enhanced sonothrombolysis on platelet-rich thrombi and erythrocyte-rich thrombi of different ages

WANGShifei1，JINGYuanwen1，LIHairui1，HUANGChixiong1，LUYongkang2，BINJianping1*

(1.DepartmentofCardiology,NanfangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China； 2.DepartmentofCardiology,ShenzhenSunYat-senCardiovascularHospital,Shenzhen518112,China)

Objective To investigate the efficacy of microbubble-enhanced sonothrombolysis on platelet-rich thrombi (PRT) and erythrocyte-rich thrombi (ERT) in different ages. Methods PRT and ERT in different ages were prepared both in vitro and in vivo of common carotid artery in rats. All the participants were divided into 8 groups with 4 in vitro and another 4 in vivo experiment, including PRT 3 h, PRT 24 h, ERT 3 h， ERT 24h in vitro groups and PRT 3 h, PRT 24 h, ERT 3 h, ERT 24 h in vivo groups. Microbubble-enhanced sonothrombolysis was carried out in both in vitro and in vivo experiments, and the ultrasonic images were collected. The components of PRT and ERT were identified by histopathological examination. The percentage increase of luminal cross sectional area and lytic ratio in vitro, and the recanalization rate and mean blood flow velocity of common carotid artery in vivo were mainly analyzed. Results After sonothrombolysis, both in vitro and in vivo experiment showed there was no statistically significant difference of the percentage increase of luminal cross sectional area ([121.12±13.21]% vs [130.09±15.34]%), lytic ratio ([39.83±7.09]% vs [42.14±5.17]%), recanalization rate (83.33% vs 91.67%) and blood flow velocity of common carotid artery ([0.21±0.02]m/s vs [0.22±0.01]m/s) between PRT 3 h group and ERT 3 h group (bothP>0.05). PRT 24 h group compared with EPR 24 h group, PRT 24 h group compared with PRT 3 h group， as well as ERT 24 h group compared with ERT 3 h group， the percent increase of luminal cross sectional area， lytic ratio， recanalization rate and blood flow velocity of common carotid artery reduced (allP<0.05). Conclusion The efficacy of microbubble-enhanced sonothrombolysis on PRT and ERT in vitro and in vivo of of rat common carotid artery model decrease with the increase of thrombus age, especially for the PRT.

Thrombolysis age; Ultrasonography; Microbubbles; Platelet; Erythrocyte; Thrombolysis

國家自然科學(xué)基金面上項目(81571689)。

王世飛(1991—)，男，江西九江人，碩士，醫(yī)師。研究方向：超聲微泡溶栓。E-mail: shifeiw@qq.com

賓建平，南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，510515。E-mail: jianpingbin@hotmail.com

2016-09-27

2017-02-26

R445.1; R-332

A

1003-3289(2017)06-0832-06

10.13929/j.1003-3289.201609127