李文清， 李中舉， 孟志鵬， 牛夢(mèng)宇， 李萬(wàn)利

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

牛IRS1基因3’UTR的克隆、鑒定及生物信息學(xué)分析

李文清1， 李中舉1， 孟志鵬1， 牛夢(mèng)宇1， 李萬(wàn)利2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002)

以奶牛乳腺組織為材料，采用3’RACE技術(shù)克隆到奶牛IRS1基因3’UTR的全長(zhǎng)，進(jìn)一步對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行了驗(yàn)證，同時(shí)利用TargetScan 7.0和PicTar軟件預(yù)測(cè)可能結(jié)合的microRNA，并對(duì)多個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)合的microRNA，進(jìn)行最小結(jié)合自由能分析。結(jié)果表明，成功克隆了1 327 bp的牛IRS1 3’UTR全長(zhǎng)，與NCBI上的預(yù)測(cè)序列一致率達(dá)到99%；miR-128、miR-96、miR-27a為2個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的結(jié)合microRNA；3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的最小自由能分別為-89.58 、-87.91 、-100.88 kJ·mol-1，表明牛IRS1基因表達(dá)可能受到這3個(gè)microRNA的調(diào)控。

牛；胰島素受體基質(zhì)1;3’非翻譯區(qū)；3’RACE；最小自由能

胰島素受體基質(zhì)1(Insulin Receptor Substrate 1，IRS1)是一種幾乎在所有細(xì)胞和組織中都表達(dá)的蛋白，是類胰島素生長(zhǎng)因子1受體(Insulin like growth factor 1 receptor, IGF1R)和胰島素受體(Insulin Receptor, IR)的停泊蛋白[1]，屬于胰島素受體基質(zhì)家族。這個(gè)家族由4個(gè)蛋白構(gòu)成，分別是IRS1～I(xiàn)RS4，IRS1是這個(gè)家族中的主要成員。它能激活下游多個(gè)信號(hào)通路，主要包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路，通過這些信號(hào)通路IRS1可以調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)及促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起著核心作用[2]。雖然牛的基因組序列在2009年就已經(jīng)公布出來，但是很多基因都是預(yù)測(cè)序列，其3’UTR是未知的，牛的IRS1基因就是這樣的。在NCBI上只有IRS1的預(yù)測(cè)序列，序列號(hào)為XM_003581871.2，而這段序列在Ensenble數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示全部為內(nèi)含子，因此不同數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道不一致。IRS1基因mRNA的3’非編碼區(qū)(UTR)作為其mRNA的重要組成部分，可能與microRNA結(jié)合而被引導(dǎo)發(fā)生降解或翻譯受阻，從而引起下游信號(hào)通路發(fā)生改變。miRNA是一類長(zhǎng)度約23 nt的內(nèi)源性的非編碼RNA，它與奶牛乳腺泌乳和乳成份合成相關(guān)[3-5]。為研究奶牛IRS1基因在奶牛乳腺泌乳網(wǎng)絡(luò)中所起的作用，找到可能對(duì)其調(diào)控的microRNA，闡明IRS1基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)奶牛泌乳、促生長(zhǎng)及代謝的影響，本研究根據(jù)GenBank中公布的牛IRS1預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)測(cè)序)法成功地克隆了牛IRS1 3’UTR序列，并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 參照MOYES活體取樣的方法[6]采集泌乳中期荷斯坦奶牛乳腺組織0.5 g，置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株和試劑 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109；克隆載體T-Vector p MDTM20；總RNA的提取采用RNAiso Plus;基因組DNA的去除采用Recombinant DNase I(RNase Free)；3‘RACE合成試劑盒3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase；膠回收純化試劑盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0；PCR擴(kuò)增試劑盒LATaq?with GC Buffer；連接酶DNA Ligation Kit Ver.2.1，以上產(chǎn)品均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上發(fā)表的IRS1預(yù)測(cè)序列(GenBank號(hào)：XM_003581871.2)，采用Oligo 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物進(jìn)行已知序列驗(yàn)證：上游引物F0: GGTCAAGGACTTCAAACAGC；下游引物R0: ATACCTCAGTTCCACATCCC。3’端序列同源獲取序列設(shè)計(jì)的上游引物F4: CCACAAGAGAATGAGTTTACGC;下游引物R4: AAAAGTGACAATGTAGCCCTGGT。IRS1 3’RACE的引物設(shè)計(jì)，外側(cè)上游引物F7: TTTGGAATGAATAATGTGGGTGTT;內(nèi)側(cè)上游引物F8: TTCATTTCCTGCATTGTCTCA，下游引物由TaKaRa 3’RACE試劑盒提供。對(duì)IRS1 3’RACE序列驗(yàn)證設(shè)計(jì)的上游引物F1: GAAGACCTAAATGACCTCAGCAAA；下游引物R5: TAATGTTACACTGGACGTTCTC。引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 牛乳腺組織Total RNA 提取 使用RNAiso Plus(TaKaRa)提取奶牛乳腺組織Total RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。然后使用Recombinant DNase I(RNase Free)(TaKaRa)進(jìn)行基因組DNA的去除。

1.2.2 牛IRS1基因3’UTR的擴(kuò)增 具體操作參照3’RACE試劑盒說明書進(jìn)行，即使用已知序列驗(yàn)證時(shí)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，分別以F7加RACE outer primer、F8加RACE inner primer進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃,30s;55℃,30s;72℃,1min;35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.2.3 序列拼接 使用Sequencher 4.9軟件對(duì)上述測(cè)得的序列進(jìn)行拼接。

1.2.4 牛IRS1基因3’UTR的克隆、鑒定及分析 將3’RACE產(chǎn)物純化回收后，克隆于M13-47載體中進(jìn)行測(cè)序，將序列測(cè)通。后又對(duì)RACE序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、測(cè)序，以驗(yàn)證RACE序列是否是根據(jù)已知序列得到的。

1.2.5 序列BLAST比對(duì)分析 牛與其他哺乳動(dòng)物IRS1基因的3’UTR的比較生物信息學(xué)分析 應(yīng)用NCBI上的BLAST軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，確定測(cè)序基因所屬的物種。

1.2.6 靶位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用miRanda軟件預(yù)測(cè)牛IRS1基因 3’UTR區(qū)miRNA結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳腺組織Total RNA提取結(jié)果

利用Trizol試劑從牛乳腺組織中提取到了完整的總RNA，經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)3條帶(圖1)，其R260/280在1.8和2.0之間，純度較好。

2.2 已知序列驗(yàn)證結(jié)果

取5 μL以F0和R0為引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2。在750 bp和500 bp間出現(xiàn)單一的預(yù)期目的條帶，經(jīng)膠回收純化PCR產(chǎn)物后，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知序列一致，為590 bp的序列。

2.3 3 ′端序列獲取結(jié)果

通過設(shè)計(jì)F4和R4引物，取5 μL同源獲取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3。

注：M為DL2000 DNA Marker；1為牛乳腺組織Total RNA。

Note: M indicates DL2000 DNA Marker; 1 indicates total RNA of bovine mammary gland.

圖1 牛乳腺組織Total RNA電泳圖
Fig.1 Total RNA eletrophoretogram of bovine mammary gland tissue

注：M為DL2000 DNA Marker；Lane 1為已知序列的PCR產(chǎn)物；Lane 2為未加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照。

Note: M indicates DL2000 DNA Marker; Lane 1 indicates PCR production of known sequence; Lane 2 indicates negative control without reverse transcriptase.

圖2 已知序列PCR電泳圖
Fig.2 PCR electrophoretogram of known sequence

在1 000 bp處有單一條帶。經(jīng)膠回收純化后再次進(jìn)行測(cè)序分析表明其大小為937 bp。

取5 μL 3′RACE的套式PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4。

切膠回收目的產(chǎn)物，約250 bp，命名為CTG111-3P1。直接CTG111-3P1測(cè)序，序列有套峰，需要克隆測(cè)序。克隆測(cè)序時(shí)使用M13-47對(duì)CTG111-3P1-1和CTG111-3P1-11質(zhì)粒測(cè)序，將序列測(cè)通。

2.4 RACE序列驗(yàn)證結(jié)果

取5 μL CTG111 F1/R5為引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5。圖5表明在2 000 bp和1 000 bp間出現(xiàn)單一條帶。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明得到的RACE序列是根據(jù)已知序列得到的。

注：M為DL2000 DNA Marker；Lane 1為未加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照；Lane 2為同源獲取的PCR產(chǎn)物。

Note: M indicates DL2000 DNA Marker; Lane 1 indicates negative control without reverse transcriptase; Lane 2 indicates PCR production of homologous acquisition.

圖3 同源獲取的PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.3 PCR eletrophoretogram of homology sequence

注：M為DL2000 DNA Marker；Lane 1為3’RACE PCR產(chǎn)物；Lane 2為未加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照。

Note: M indicates DL2000 DNA Marker; Lane 1 indicates PCR production of 3’RACE; Lane 2 indicates negative control without reverse transcriptase.

圖4IRS1基因3′RACE套式PCR電泳圖
Fig.4 PCR electrophoretogram ofIRS1 3’RACE

注：M為DL2000 DNA Marker，Lane 1為RACE序列驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，Lane 2為未加反轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照。

Note: M indicates DL2000 DNA Marker; Lane 1 indicates PCR production of RACE sequence; Lane 2 indicates negative control without reverse transcriptase.

圖5 RACE序列驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物電泳圖
Fig.5 PCR electrophoretogram of verifing RACE sequence

2.5 序列拼接和同源比對(duì)結(jié)果

用Sequencher 4.9軟件對(duì)上述測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，最終獲得的3’端未知序列。測(cè)序、擴(kuò)增加上已知序列共獲得可確認(rèn)的牛IRS1長(zhǎng)度為1 516 bp，3’UTR序列長(zhǎng)度為1 338 bp，其中包括11 bp polyA的尾巴，將polyA尾巴去掉后還剩下1 327 bp。對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRS1基因的3’RACE序列與NCBI上公布的牛IRS1的預(yù)測(cè)序列(XM 003581871.2)基本一致，一致性達(dá)到99%。與人的IRS1序列的一致性為87%，可見IRS1基因的3’UTR在不同物種間的保守性較高，然而是否存在microRNA的結(jié)合位點(diǎn)還要進(jìn)行下一步的分析。

2.6 靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)及同源性分析

利用TargetScan 7.0軟件分析可能結(jié)合的microRNA，有11個(gè)microRNA靶向牛IRS1基因3’UTR的保守位點(diǎn)，包括miR-128、miR-96/1271、miR-302a、miR-27-3p、 miR-15/16/195/424-5P/497、miR-29-3p。利用PicTar軟件，有11個(gè)microRNA靶向牛IRS1基因3’UTR的保守位點(diǎn)，包括miR-126、miR-96、miR-145、miR-183、 miR-27a、miR-128a/b miR-27b、miR-30a-5p、miR-30d、miR-30e。取2個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的microRNA(miR-128、miR-96、miR-27a)和實(shí)測(cè)的IRS1 3’UTR序列代入網(wǎng)址http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid，進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)最小自由能分析，結(jié)果如表1所示。

表1 結(jié)合位點(diǎn)自由能和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 1 Free energy and secondary structure analysis of binding sites

3 討論

一些研究者認(rèn)為在奶牛乳腺泌乳過程中的確有大量的microRNA參與到乳汁合成及調(diào)控的過程中[3-5]，但microRNA調(diào)控奶牛乳腺具體基因的報(bào)道較少。IRS1蛋白是多個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，主要激活下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路。IRS1基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控對(duì)研究奶牛泌乳啟動(dòng)及乳成份合成是非常重要的。但是，牛的基因很多都是預(yù)測(cè)序列，其3’UTR是未知的，這給后續(xù)的一些研究帶來困難。本試驗(yàn)采用3’RACE技術(shù)來獲得牛IRS1的3’UTR，最后獲得1 327 bp的片段長(zhǎng)度，不包括末尾的Poly(A)，與NCBI上公布的牛IRS1的預(yù)測(cè)序列(XM 003581871.2)基本一致，一致性達(dá)到99%。通過3’RACE測(cè)序還獲得IRS1 11bp polyA的尾巴，這個(gè)polyA序列不是真實(shí)的長(zhǎng)度。3’RACE接頭序列polyT的長(zhǎng)度是人為設(shè)定的，根據(jù)試劑盒的不同，polyA的長(zhǎng)度也不相同，所以本研究得到這個(gè)polyA序列是預(yù)測(cè)值，不能反應(yīng)它的真實(shí)長(zhǎng)度。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)得的牛IRS1 3’UTR序列進(jìn)行microRNA靶位點(diǎn)預(yù)測(cè),結(jié)果得到許多可能結(jié)合的microRNA。多個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的microRNA具有較高的可能性，本研究就進(jìn)一步對(duì)2個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)到的microRNA進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)最小自由能分析。分析發(fā)現(xiàn)bta-miR-128、bta-miR-96、bta-miR-27a與IRS1 3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)最小自由能(△G)≤-62.79 kJ·mol-1，一般認(rèn)為最小自由能(△G)≤-62.79 kJ·mol-1是可以結(jié)合的[7]。

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(責(zé)任編輯：蔣國(guó)良)

Cloning, identification and bioinformatics analysis of the 3’UTR of bovineIRS1

LI Wenqing1， LI Zhongju1, MENG Zhipeng1, NIU Mengyu1, LI Wanli2

(1.Life Science College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China; 2 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002,China)

Using bovine mammary tissue as material, bovineIRS1 gene 3’UTR full length was cloned by 3’RACE technology. Measured sequence was further validated. At the same time, TargetScan 7.0 and PicTar sofeware were used to predict the possible binding microRNA. Minimal binding free energy of the multiple software conjunct predicting microRNAs was analyzed. The results showed that the 1327bp 3’UTR full length of bovineIRS1 was successfully cloned. The detected sequence was 99% consistent with the predicted sequences in NCBI. MiR-128,miR-96 and miR-27a were predicted by two authoritative software together. The minimum free energy of three binding sites was -89.58, -87.91 and -100.88 kJ·mol-1, respectively. These results suggested that the bovineIRS1 gene expression might be regulated by the three microRNAs.

bovine;IRS1; 3’ untranslated region; 3’RACE; minimum free energy

2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501978);河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A230010)

李文清(1979-)，女，河南潢川人，副教授，主要從事奶牛營(yíng)養(yǎng)與牛奶品質(zhì)研究。

李萬(wàn)利(1979-)，男，河南駐馬店人，副研究員，博士。

1000-2340(2017)01-0048-05

S852.23

A