陳曉怡，王炎，趙怡程，白少娟，何婷，常艷麗，姜蕊,2，萬欣蕾，邢丹，折改梅*

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2．保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000)

制 劑 工 藝

大孔吸附樹脂富集青龍衣總多酚的工藝研究

陳曉怡1，王炎1，趙怡程1，白少娟1，何婷1，常艷麗1，姜蕊1,2，萬欣蕾1，邢丹1，折改梅1*

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2．保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000)

采用大孔樹脂富集青龍衣中多酚類成分。通過靜態(tài)吸附及解吸附篩選出最佳樹脂，在此基礎(chǔ)上考察上樣液濃度、上樣pH、上樣體積、上樣流速、洗脫劑濃度、洗脫劑體積、洗脫流速、徑高比等工藝參數(shù)。結(jié)果表明AB-8為富集青龍衣總多酚的最佳樹脂，最佳工藝參數(shù)為：上樣液濃度為0.070 g/mL、上樣pH=4.0、上樣體積為1 BV、上樣流速為3 BV/h、去離子水除雜3 BV、洗脫劑濃度70% 、洗脫劑體積2 BV、洗脫流速為2 BV/h、徑高比為1∶8，青龍衣總多酚的含量由0.13%提高到52.09%。AB-8樹脂對(duì)青龍衣總多酚進(jìn)行有效的富集。

大孔吸附樹脂；青龍衣；總多酚

青龍衣始載于《開寶本草》，為我國(guó)民間常用中藥，為胡桃科胡桃屬植物核桃(JuglansregiaLinn.)和胡桃楸(J.mandshuricaMaxim.)的未成熟外果皮，又稱為核桃青皮。其始載于《開寶本草》，具有清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢等功效[1]，臨床上多用于治療腫瘤、皮膚病、淺表性胃炎等病[2-4]?，F(xiàn)代研究報(bào)道青龍衣富含多酚類、萘醌類、黃酮類、萜類和二芳基庚烷類成分[5-9]，其中多酚類成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、抗炎、抗癌、抗氧化和抗衰老等作用[10-12]，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大興趣。課題組前期建立了總多酚含量測(cè)定方法[11]，在此研究基礎(chǔ)上，筆者采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)大孔樹脂富集青龍衣總多酚的工藝參數(shù)進(jìn)行考察，確立最佳的工藝條件，為青龍衣多酚類成分活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、材料和試劑

SHB-III水循環(huán)真空泵(河南鞏義市英峪電子儀器廠)；DK-S 24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Sartorious BT25S型1/100000電子分析天平(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-2000紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海公司)。

HPD400、Diaion、D101和AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；鹽酸、鎢酸鈉、磷酸、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉、甲醇、無水乙醇(均為分析純，北京化工廠)；水為去離子水。

沒食子酸對(duì)照品(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)為20120418，純度99.0%)；核桃青皮采自北京昌平，經(jīng)本校中藥鑒定系張媛副教授鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃(JuglansregiaL.)的外果皮，將其陰干后制得青龍衣。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

本研究中采用課題組前期建立方法并已發(fā)表文章[13]。精密稱取青龍衣粉末1.00 g，加入16 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，超聲提取3次，每次20 min，過濾，合并濾液，再加入50 mL 4 mol/L的鹽酸，100℃水解2 h，定容至100 mL。以沒食子酸為對(duì)照品，采用紫外-可見分光光度法，測(cè)定樣品中總多酚的含量[13]。

2.2 洗脫液中總多酚的質(zhì)量濃度及含量測(cè)定

青龍衣總多酚含量的測(cè)定：取一定濃度的樣品溶液0. 2 mL，后續(xù)步驟同標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其濃度，并計(jì)算出總多酚的質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法等見實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文章[13]。計(jì)算公式如下：

式中：A為洗脫液吸光度(Abs)，C為洗脫液中總多酚的濃度(mg/mL)，W為洗脫液中總多酚含量(%)，V為洗脫液體積(mL)，N為稀釋倍數(shù)，M為洗脫物的質(zhì)量(mg)。

2.3 大孔樹脂的預(yù)處理

體積分?jǐn)?shù)95%乙醇浸泡大孔樹脂24 h，充分溶脹后，濕法裝柱，再用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇淋洗至流出液與水混合(1∶5)不呈白色為止，然后用去離子水沖洗至流出液無醇味，瀝干樹脂中水分備用。

表1 四種大孔樹脂的基本性能

2.4 樹脂類型的篩選

精密稱取預(yù)處理過的四種型號(hào)的樹脂各1.00 g，分別置于4個(gè)150 mL具塞磨口三角瓶中，精密加入青龍衣供試溶液(含總多酚0.003 1 mg/mL)20 mL，密封，每10 min振搖20 s，持續(xù)2 h，按照2.1的方法顯色測(cè)定吸附后各溶液中總多酚含量，計(jì)算各種類型樹脂吸附量和吸附率。取上述四種吸附后的樹脂，加入無水乙醇50 mL，密封，每10 min振搖20 s，持續(xù)2 h，測(cè)定各解吸液中總多酚的量，計(jì)算解吸率。

靜態(tài)吸附量(mg/g樹脂)=(C0-C1)V0/M1

靜態(tài)吸附率(%)=(C0-C1)/C0×100

靜態(tài)解吸率(%)=[C2V2/(C0-C1)V0]×100

式中：C0為初始質(zhì)量濃度(mg/mL)，C1為吸附后溶液中總多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，C2為解吸液中總多酚質(zhì)量濃度(mg/mL)，V0為供試液體積(mL)，V2為解吸液體積(mL)，M1為大孔吸附樹脂質(zhì)量(g)。結(jié)果見表2。

表2 4種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸數(shù)據(jù)

由表2數(shù)據(jù)可知，綜合整個(gè)靜態(tài)吸附和解吸附過程，AB-8樹脂吸附率和解吸率均最高。且AB-8大孔樹脂具有選擇性強(qiáng)、吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于大工業(yè)生產(chǎn)多酚類等多種成分的分離與富集[14]。綜合上述多種因素選用AB-8樹脂為富集青龍衣總多酚的最佳樹脂。

2.5 AB - 8型吸附樹脂富集青龍衣總多酚的工藝參數(shù)考察

2.5.1 上樣濃度的考察

配制濃度為0.10 g/mL、0.070 g/mL、0.050 g/mL、0.040 g/mL的溶液，濕法上樣于40 mL的AB-8樹脂柱，先用40 mL去離子水除雜，再用40 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏，測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖1 上樣濃度對(duì)總多酚含量的影響

由圖1可知，濃度在0.040 g/mL～0.070 g/mL之間，總多酚的含量隨著濃度的增加而迅速增加，在0.070 g/mL～0.10 g/mL之間，總多酚的含量隨濃度的增加而急劇下降。原因可能是上樣液濃度過低，多酚分子與樹脂的接觸機(jī)會(huì)增大，多酚分子能夠迅速擴(kuò)散至樹脂內(nèi)部。濃度過高，多酚分子的擴(kuò)散受到抑制，且濃度過大易出現(xiàn)絮凝和沉淀，堵塞樹脂，影響吸附[15]。綜合考慮，選擇最佳上樣濃度為0.070 g/mL。

2.5.2 上樣溶液pH的考察

取濃度為0.070 g/mL的上樣溶液4份，分別調(diào)節(jié)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0，濕法上樣于40 mL的AB-8樹脂柱，先用40 mL去離子水除雜，再用40 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏，測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖2 pH值對(duì)總多酚含量的影響

由圖2可知，隨著pH的增大，總多酚的含量先升高后下降，在pH=4.0時(shí)總多酚的含量最高，pH=2.0時(shí)含量最低。原因可能是上樣液pH的變化，可以改變多酚在溶液中的存在形式，影響其溶解度，從而影響多酚與大孔樹脂的分子間作用力。多酚類化合物含有酚羥基，呈酸性，在微酸性條件下易被樹脂吸附[16]，因此，選擇上樣液pH=4.0為宜。

2.5.3 泄漏曲線

配制濃度為0.31 mg/mL的青龍衣溶液240 mL，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL的AB - 8樹脂柱，以一個(gè)柱體積(40 mL)為單位，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏，測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的質(zhì)量濃度。

圖3 上樣體積對(duì)總多酚含量的影響

由圖3可知，隨著上樣量的增加，洗脫液中青龍衣總多酚的濃度不斷增大，上樣2 BV時(shí)，出現(xiàn)明顯泄漏，說明樹脂已吸附飽和[17]，為了避免樹脂過飽和而造成死吸附，選擇最佳上樣量為1 BV。

2.5.4 上樣流速的考察

取濃度為0.070 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL的AB-8樹脂柱，分別控制上樣流速為1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h，先用40 mL去離子水除雜，再用40 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏，測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖4 上樣流速對(duì)總多酚含量的影響

由圖4可知，隨著上樣流速的增大，總多酚的含量先升高后下降，流速為3 BV/ h時(shí)總多酚的含量最高，流速為1 BV/h時(shí)含量最低。原因可能是流速慢，多酚分子雖然能與樹脂內(nèi)表面充分接觸，使其含量增加，但會(huì)造成生產(chǎn)周期過長(zhǎng)、多酚容易發(fā)生降解、聚合。流速快，多酚和樹脂接觸時(shí)間短，來不及吸附就發(fā)生泄漏，導(dǎo)致含量降低。因此，選擇3 BV/h為最佳上樣流速。

2.5.5 上樣量與樹脂體積比的考察

配制濃度為0.070 g/mL的上樣溶液20 mL、40 mL、60 mL、80mL，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL的AB-8樹脂柱，分別用40 mL去離子水除雜，40 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液，然后分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖5 上樣量與樹脂體積比對(duì)總多酚含量的影響

從圖5可知，上樣量與樹脂體積的比為1∶1時(shí)，青龍衣總多酚的含量最高。故選擇最佳的上樣量與樹脂體積比為1∶1。

2.5.6 除雜用水量的考察

取濃度為0.070 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL的AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV去離子水除雜，再用40 mL無水乙醇洗脫，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏，測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

表3 不同用量水洗脫液中總多酚的含量

由表3可知，隨著水洗體積的增加，洗脫液中總多酚的含量先增加后減少，除雜用水量為3 BV時(shí)，總多酚的含量最高，故選擇3 BV為最佳的水洗體積。

2.5.7 洗脫劑濃度的考察

配制濃度為0.070 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，用3 BV去離子水除雜后，分別用40 mL 60%、70%、80% 和90% 乙醇洗脫，收集洗脫液，然后分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖6 洗脫劑濃度對(duì)總多酚含量的影響

由圖6可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，洗脫液中總多酚的含量先上升后下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70% 時(shí)含量最高，90% 含量最低。因此選用70% 的乙醇為最佳洗脫濃度。

2.5.8 洗脫劑體積的考察

配制濃度為0.070 g/mL 的溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，用3 BV去離子水除雜，再用70%乙醇分別洗脫1 BV、2 BV、3 BV、4 BV，收集洗脫液，然后分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖7 洗脫劑體積對(duì)總多酚含量的影響

由圖7可知，隨著洗脫體積的增加，總多酚的含量先增加后減少，用2 BV 70%乙醇洗脫時(shí)，總多酚的含量最高。故選擇2 BV為最佳洗脫體積。

2.5.9 洗脫流速的考察

取濃度為0.070 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，用3 BV去離子水除雜，再用70% 乙醇洗脫，分別控制洗脫流速為1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h，洗脫2 BV，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖8 洗脫流速對(duì)總多酚含量的影響

由圖8可知，隨著洗脫流速的增大，總多酚的含量先增加后減少，洗脫流速為2 BV/h時(shí)，總多酚含量最高，原因可能是洗脫流速過低，解吸時(shí)間長(zhǎng)、洗脫能力小。流速過快，多酚不能充分解吸，考慮到解吸效果和工作效率，確定最佳洗脫流速為2 BV/h。

2.5.10 徑高比的考察

分別裝徑高比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的AB-8樹脂柱，配制濃度為0.070 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于40 mL AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，先用3 BV去離子水除雜，再用2 BV 70%乙醇以2 BV/h的速度洗脫，收集洗脫液，分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。

圖9 樹脂柱徑高比對(duì)總多酚含量的影響

由圖9可知，樹脂柱徑高比在1∶8時(shí)，青龍衣總多酚的含量最高。因此，選擇樹脂柱最佳徑高比為1∶8。

2.5.11 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

以考察出的最優(yōu)工藝，即上樣1 BV生藥濃度為0.07 g/mL的青龍衣溶液，調(diào)pH為4.0，濕法上樣于徑高比為1∶8的AB-8樹脂柱，控制上樣流速為3 BV/h，用3 BV水除雜后，用2 BV的70%乙醇以2 BV/h的速度洗脫，收集洗脫液，然后分別蒸干得浸膏。測(cè)定洗脫液的吸光度值，計(jì)算總多酚的含量。經(jīng)計(jì)算這3次得到總多酚的含量分別為51.94%，53.48%，50.85%。轉(zhuǎn)移率分別為61.39%，62.04%，61.86%。平均含量為52.08%，平均轉(zhuǎn)移率為61.78%。

3 結(jié)論與討論

本論文與已有文獻(xiàn)比較[18]，相同之處在于均采用AB-8樹脂對(duì)青龍衣總多酚進(jìn)行富集。不同之處在于本研究采用與總多酚極性相近的弱極性、非極性和中極性的大孔樹脂對(duì)其進(jìn)行富集工藝的考察，多酚含量顯著提高。研究表明AB-8型大孔吸附樹脂對(duì)青龍衣總多酚具有良好的吸附性能，較大的吸附量，且易吸附、易解吸，是富集純化青龍衣總多酚的最佳樹脂。經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂富集純化后，青龍衣總多酚的含量由0.13%增加到52.09%，最佳富集工藝為：采用徑高比為1∶8的AB-8大孔吸附樹脂，最大上樣量為1 BV，最佳上樣濃度為0.070 g/mL，最佳上樣pH為4.0，最佳上樣流速為3 BV/h，去離子水除雜體積為3 BV，乙醇洗脫液的濃度為70%，洗脫體積為2 BV，最佳解吸流速為2 BV/h。實(shí)驗(yàn)中確定的總多酚富集工藝為進(jìn)一步開發(fā)青龍衣染發(fā)劑奠定基礎(chǔ)。

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Technic-process Study of Enriching Total Polyphenols fromJuglansRegiaL.

CHEN Xiao-yi1, WANG Yan1, ZHAO Yi-cheng1, BAI Shao-juan1,HE Ting1,CHANG Yan-li1, JIANG Rui1,2, WAN Xin-lei1, XING Dan1, SHE Gai-mei1

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;2.TheFirstCentralHospitalofBaoding,Baoding071000,China)

The total polyphenols fromJuglansregiaL. was enriched with macroporous resin. The optimal macroporous resin was selected after the static adsorption and desorption tests, with which to optimize the separation process of total polyphenols from J. regia. The parameters of concentration, pH value, bed volume and flow velocity from the sample liquid, as well as the parameters of concentration, bed volume, flow velocity and the ratio of diameter to height(D/H) from the eluant were observed with the optimal macroporous resin. The results showed that the AB-8 macroporous resin had good qualities of adsorption and desorption. The preferred condition for the procedure was as follows: the concentration of sample liquid was 0.070 g/mL, pH=4.0, the bed volume=1 BV, the flow rate of adsorption=3 BV/h, the volume of water to remove impurities was 3 BV; 70% ethanol was taken as the eluant, bed volume=2 BV, t he flow rate of desorption=2 BV/h and D/H=1∶8. Under this condition, the content of total polyphenols had been increased from 0.13% to 52.09%. The AB-8 macroporous resin could be effectively applied to purify the total polyphenols from J. regia.

Macroporous resin;JuglansregiaL.; Total polyphenols

2016-06-17

2016-12-18

北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201510026048)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題中青年教師資助項(xiàng)目(2013-JYBZZ-JS-137)；榆林現(xiàn)代特色農(nóng)業(yè)新技術(shù)研究與集成示范(2015CXY-13)

陳曉怡(1992-)，女，碩士研究生，專業(yè)：中藥化學(xué)。

*通訊作者：折改梅(1976-)，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中(民族)藥藥效成分和新藥創(chuàng)制研究。

R284.2

A

1002-2392(2017)03-0095-04