徐明遠，王謙博，崔紅花,謝彥梅，岳賽男，吳柏艷，郭盛磊，丁常宏，王振月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510000；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006;4.西冶地礦實驗測試有限責任公司，四川 成都 610051；5.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，北京 100000；6.哈藥集團三精制藥公司，黑龍江 哈爾濱 150060)

毛脈酸模愈傷組織誘導及生物活性成分分析

徐明遠1，王謙博2，崔紅花3,謝彥梅4，岳賽男5，吳柏艷6，郭盛磊1，丁常宏1，王振月1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510000；3.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006;4.西冶地礦實驗測試有限責任公司，四川 成都 610051；5.正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，北京 100000；6.哈藥集團三精制藥公司，黑龍江 哈爾濱 150060)

目的：建立誘導毛脈酸模愈傷組織的培養(yǎng)方法。方法：比較不同激素配比條件下不同外植體愈傷組織的誘導；采用高效液相色譜法，比較愈傷組織與幼苗中7種指標成分的含量差異。結果：子葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織出愈早，量多，增殖快，顏色鮮艷，有生命活力，利于繼代培養(yǎng)和進一步進行懸浮細胞的培養(yǎng)；子葉在2號培養(yǎng)基(MS+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L)中誘導狀況良好，愈傷組織誘導率高，并且愈傷組織生長速度快，愈傷組織為黃綠色，比較疏松，有利于愈傷組織進一步的懸浮細胞培養(yǎng)；愈傷組織中多數(shù)化學成分的峰面積較大，所測的7種生物活性成分中，愈傷組織中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量低于幼苗根，其余5種成分含量均高于幼苗根，尤其是在愈傷組織中檢測到了少量的酸模素成分。結論：子葉為誘導愈傷組織的外植體，2號培養(yǎng)基(MS+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L)為誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基；愈傷組織含有幼苗根中的全部化學成分，有5種化學成分的含量高于幼苗根，而且還測得有少量酸模素的存在。

毛脈酸模；愈傷組織；誘導

毛脈酸模(R.gmelini)是蓼科(Polygonaceae)酸模屬多年生草本植物，原植物名為毛脈酸模[1]，黑龍江省部分地區(qū)稱之為洋鐵葉，羊蹄葉[2]，產(chǎn)東北、華北、陜西、甘肅、青海(門源)、新疆(阿勒泰)[3]。民間以根入藥,對淋病、上呼吸道感染性疾病、癬病和瘡毒有確切療效。主要含白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚酸模素、大黃酚苷。具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒和抗氧化等作用[4-7]。因具有周期短、可控性強、不受外界條件限制等優(yōu)點,植物組織培養(yǎng)和大規(guī)模植物細胞培養(yǎng)已成為提高藥用植物繁育速度、保持優(yōu)良性狀或改良品種及解決藥用植物資源匱乏的最有前景的途徑[8-10]。本文研究毛脈酸模不同外植體愈傷組織誘導以及培養(yǎng)基條件，同時對愈傷組織與幼苗中7種指標成分的含量進行了對比分析。以期為該藥用植物快繁體系的建立和進一步細胞培養(yǎng)獲取主要生物活性成分奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 儀器

250-GB型光照培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；二級B2型生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；電熱手提式壓力蒸汽消毒器(哈爾濱市松花江醫(yī)療器械廠)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司；ZK-82B型真空干燥箱：上海市實驗儀器總廠)；美國Waters高效液相色譜儀(Waters 600型泵，2487型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站)；Mettler電子天平AE 240；DIKMA微孔濾膜(0.45 μm)。

1.2 藥品

毛脈酸模幼苗，出芽后生長約30 d的健康幼苗，取子葉和根為外植體。取自黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園溫室。樣品毛脈酸模幼苗根為生長3個月的干燥根，采于黑龍江中醫(yī)藥大學藥用植物園；樣品毛脈酸模愈傷組織為組織培養(yǎng)獲得。白藜蘆醇、白藜蘆醇苷均由美國SIGMA公司提供，大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均由中國藥品生物制品檢定所提供，酸模素、大黃酚苷由課題組成員從毛脈酸模植物中提取分離得到，經(jīng)波譜分析鑒定結構，歸一化法計算，含量在98%以上。95%醫(yī)用酒精(山東利爾康消毒科技有限公司)；升汞(分析純，北京恒業(yè)中遠化工有限公司)；95%乙醇(工業(yè)級，哈爾濱市新達化工廠)；甲醇(分析純，北京化工廠)；甲醇(色譜純，美國DIKMA試劑公司)；磷酸(分析純，天津市天河化學試劑廠)；水(飲用純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 實驗方法

2.1 無菌材料的獲得

選取生長健康的毛脈酸模幼苗，用自來水沖洗，洗去泥沙，轉入超凈工作臺中。無菌條件下，材料用95%醫(yī)用酒精浸泡(稍攪蕩)30 s，后用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%升汞(HgCl2)水溶液浸泡3 min，再用無菌水沖洗3～5遍，最后用無菌濾紙吸干水分，備用[11]。

2.2 愈傷組織的誘導

培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加3%蔗糖，0.9%瓊脂粉，調pH 5.8。以植物生長調節(jié)劑6-BA和2,4-D為主要因素，以不同的質量濃度：①6-BA：3.0、4.0、5.0 mg/L；②2,4-D：0.1、0.3 mg/L；以不加任何激素的MS培養(yǎng)基為空白對照組，共7個處理方式，見表1。將子葉切成6 mm×3 mm大小，根莖切成1cm長度，將兩種外植體分別接種于上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生愈傷組織。于光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照14 h/d ，光照強度1 500～2 000 Lx。

表1 愈傷組織誘導培養(yǎng)基

每5 d觀察生長狀況，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導情況。每處理30個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種5個外植體，重復3次。公式如下：愈傷組織誘導率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/未污染的外植體總數(shù)×100%。

2.3 愈傷組織化學成分的HPLC分析

2.3.1 色譜條件

色譜柱Thermo C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，預柱Phenomenex ODS-C18(4.0 mm×3.0 mm)，流動相為甲醇，0.1%磷酸水，梯度洗脫條件：0～70 min，30%～100%甲醇；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：40℃；進樣量：20 μL。

2.3.2 供試樣品的制備

幼苗期(生長3個月)毛脈酸模根，陰干，粉碎過80目篩，60℃干燥至恒重；愈傷組織，陰干，粉碎過80目篩，60℃干燥至恒重。分別精密稱定毛脈酸模幼苗根粉末和愈傷組織粉末0.5 g，置索氏提取器中加入50%乙醇70 mL，提取時間為4 h，濾過，60℃水浴蒸干。殘渣分別用25 mL甲醇溶解并定容至刻度，此溶液再過0.45 μm的微孔濾膜，棄去初濾液取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 結果

3.1 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的選擇

表2 愈傷組織誘導情況

注：以上實驗均設3次重復

從表2中可以看出，在空白對照組，不添加任何植物生長激素的MS培養(yǎng)基上，不能誘導產(chǎn)生愈傷組織，說明毛脈酸模愈傷組織的誘導產(chǎn)生，需要植物生長調節(jié)劑的刺激誘導。外植體子葉的愈傷組織誘導率明顯高于外植體根，根的愈傷組織誘導率極低。經(jīng)觀察得知，根誘導的愈傷組織顏色均為深綠色，量少，致密，生長緩慢，不利于愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)。子葉誘導產(chǎn)生的愈傷組織出愈早，量多，增殖快，顏色鮮艷，有生命活力，利于繼代培養(yǎng)和進一步進行懸浮細胞的培養(yǎng)。故選擇子葉為誘導愈傷組織的外植體。

由表2得知，子葉在2號培養(yǎng)基(MS+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L)中誘導狀況良好，愈傷組織誘導率高，并且愈傷組織生長速度快，愈傷組織為黃綠色，較致密，見圖1，有利于愈傷組織進一步的懸浮細胞培養(yǎng)。綜合以上實驗結果，選擇2號培養(yǎng)基(MS+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L)為誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基。

圖1 毛脈酸模愈傷組織

3.2 愈傷組織化學成分的HPLC分析

利用高效液相色譜獲得毛脈酸模幼苗根和愈傷組織的色譜圖，見圖2，并根據(jù)7種標準品的回歸方程計算得到了上述兩種樣品的化學成分含量，對樣品中所測的7種生物活性成分的含量進行了比較。

圖2 愈傷組織及幼苗根色譜圖注：1.為白藜蘆醇苷；2.為白藜蘆醇；3.為大黃酚苷；4.為酸模素；5.為大黃素；6.為大黃酚；7.為大黃素甲醚

表3 樣品化學成分含量

圖3 愈傷組織和幼苗根化學成分含量對比

由表3，圖3得知，愈傷組織中多數(shù)化學成分的峰面積較大，所測的7種生物活性成分中，愈傷組織中的白藜蘆醇苷和白藜蘆醇的含量低于幼苗根，其余5種成分含量均高于幼苗根，尤其是在愈傷組織中檢測到了少量的酸模素成分。

4 討論

植物次生代謝產(chǎn)物是藥物、健康食品、食物添加劑和精細化工品等的重要來源，結構的復雜性導致其化學合成困難。因此不管化學合成的手段多么先進，仍不能取代生物資源作為植物次生代謝產(chǎn)物的來源以從中開發(fā)藥物和健康食品[12]。本課題組前期研究結果證明其是一個有開發(fā)價值的藥用植物，目前該藥仍以野生資源為主[13-17]，并沒有進行人工馴化和規(guī)模性的栽培。本研究以誘導率和生長狀況為指標對毛脈酸模外植體和培養(yǎng)基進行篩選，最終確定選擇子葉為外植體，在MS+6-BA 3.0 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導情況最好，通過繼代培養(yǎng)可誘導出大量，比較疏松，有生命活力的愈傷組織。本研究僅是對誘導條件和外植體的篩選進行了初步研究，后續(xù)應選取毛脈酸模中有效指標成分進行篩選。利用高效液相色譜，分析毛脈酸模幼苗根和愈傷組織的化學成分含量，在所測的7種化學成分中，愈傷組織含有幼苗根中的全部化學成分，其中有5種化學成分的含量高于幼苗根，而且還測得有少量酸模素的存在。本研究進行成分分析的為第1 代愈傷組織, 下一步還需對其進行篩選和馴化以建立懸浮細胞培養(yǎng)體系。本研究結果對毛脈酸模的繁殖和細胞培養(yǎng)獲取其主要藥效物質具有一定的參考意義。

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Analysis of Induction and Bioactive Constituents ofRumexGmeliniCallus

XU Ming-yuan1, WANG Qian-bo2, CUI Hong-hua3,XIE Yan-mei4,YUE Sai-nan5, WU Bai-yan6, GUO Sheng-lei1, DING Chang-hong1, WANG Zhen-yue1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.TheFirstAffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Guangzhou510000,China; 3.CollegeofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China;4.XiyeMineralTestCo.Ltd.,Chengdu610051,China; 5.CTTQPharmaceuticalLtd,Beijing100000,China;6.SanjingPharmaceuticalCompany,Harbin150060,China)

Objective: To establish a culture method of callus induction forRumexgmelini. Methods: The callus inductions of different explants were compared under different hormone conditions. The content difference of seven kinds of components was also compared in the callus tissue and seedlings by HPLC method. Results: The callus of cotyledons grew early, with large quantity, fast proliferation, bright color, and full vitality, which was beneficial to the subculture and further culture of suspension cells. The cotyledons were induced well in No.2 culture medium (MS+6-BA 3.0 mg /L+2,4-D 0.1 mg/L), with high induction rate and fast growth speed. The callus is yellow-green and loose, which was good for further culture of cell suspension. The peak areas of most chemical components in the callus were larger. In terms of the seven bioactive components, polydatin and resveratrol in the callus were less than those in the seedling root. The contents of the other five components in the callus, in which a little amount of musizin was especially detected, were more than those in the seedling roots. Conclusion: The research suggests that the cotyledon may be the explants for callus induction, optimal medium is No.2 culture medium (MS+ 6-BA 3 mg/l+2,4-D 0.1 mg/l). The callus contained all the chemical elements in the seedling roots, of which the contents of five components were higher than those in the seedling roots, a little amount of musizin was also found.

Rumexgmelini; Callus; Induction

2016-07-07

2016-08-15

國家自然科學基金項目(30970300);哈爾濱科技創(chuàng)新人才研究專項基金項目(2010rfxxs031)

徐明遠(1980-)，男，博士研究生，臨床藥師，主要從事中藥藥效物質基礎研究，中藥資源開發(fā)利用與資源質量評價工作。

*通訊作者：王振月(1955-)，男，教授，博士研究生導師，主要從事中藥資源開發(fā)利用與資源質量評價、中藥材規(guī)范化生產(chǎn)理論與調控技術。

R285

A

1002-2392(2017)03-0041-04