李彩紅,王永剛, 鐘偉,蔡倩瑋,齊婧,尚俊平

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

丹蔞護冠方對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護機制研究

李彩紅1,王永剛2*, 鐘偉2,蔡倩瑋1,齊婧2,尚俊平2

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000)

目的：研究丹蔞護冠方對大鼠心肌缺血再灌注損傷的SOD、MDA、ET、NO含量和心肌細胞Bax、bcl-2表達的影響。方法：SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹蔞護冠方低劑量組(2.5 g/mL)、中劑量組(5 g/mL)和高劑量組(7.5 g/mL)，每組12只。丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組分別給予相關濃度的丹蔞護冠方濃縮液，假手術(shù)組及模型組予等量生理鹽水。各組大鼠均灌胃2周后，麻醉開胸，6～0無創(chuàng)縫線結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支30 min后，剪開縫線，再灌注120 min，建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。取出大鼠心臟，Elisa法檢測心肌組織勻漿中SOD、MDA、ET、NO含量，Western blot法檢測心肌組織Bax、bcl-2表達。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織SOD活性和NO含量降低，MDA和ET含量升高，Bax表達增高，bcl-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組大鼠心肌組織SOD活性和NO含量升高，MDA和ET含量降低，Bax表達降低，bcl-2表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹蔞護冠方中劑量比較，丹蔞護冠方低劑量組心肌組織NO含量降低，MDA含量升高，丹蔞護冠方高劑量組心肌組織SOD活性和NO含量升高，MDA和ET含量降低，Bax表達降低，bcl-2表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：丹蔞護冠方具有干預大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，其機制可能與丹蔞護冠方增加SOD活性和NO含量，降低MOD、ET含量，抑制氧化應激反應，改善血管內(nèi)皮功能，調(diào)控凋亡基因的表達有關。

丹蔞護冠方；心肌缺血再灌注損傷；保護機制

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是在指急性心肌缺血基礎上恢復血流再灌注后，不能使心臟功能恢復，反而加重心臟的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象[1]。其發(fā)生機制尚未完全闡明，研究表明氧自由基、鈣超載、心肌能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細胞、一氧化氮、炎性反應和細胞自噬、凋亡、壞死等因素均可能參與MIRI 的病理過程[2]。隨著冠狀動脈介入術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)在臨床的應用，心肌缺血再灌注損傷在臨床極為常見，受到國內(nèi)外學者的廣泛關注。中藥復方具有多成分、多靶點、多途徑的特點，在防治心肌缺血再灌損傷方面具有一定的優(yōu)勢，可從多個機制保護心肌[3]。本實驗擬采用藥物預處理的方法，探索丹蔞護冠方對心肌缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2012-003。

1.2 實驗藥物

丹蔞護冠方(由丹參、瓜蔞、半夏、薤白、肉桂、三七粉等組成，陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院制劑室制備)，丹蔞護冠方低劑量2.5 g/mL(相當于生藥材6 g)， 丹蔞護冠方中劑量5 g/mL(相當于生藥材12 g)， 丹蔞護冠方高劑量7.5 g/mL(相當于生藥材18 g)。

1.3 儀器與試劑

Ascent全自動酶標儀，美國Thermo公司；UV762雙光束紫外可見分光光度計，上海精密儀器廠；ELISA試劑盒：一氧化氮(NO)測試盒、內(nèi)皮素(ET)測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒，以上試劑盒由北京誠林生物科技有限公司提供；HX-100E小動物呼吸機，成都泰盟軟件有限公司；GS-15R冷凍離心機，美國Bekman公司；DYY-6C電泳儀；羊抗兔二抗，武漢博士德生物科技有限公司。

1.4 分組與給藥

60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、丹蔞護冠方低劑量組(2.5 g/mL)、中劑量組(5g/mL)和高劑量組(7.5 g/mL)，每組12只。丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組分別給予相關濃度的丹蔞護冠方濃縮液，假手術(shù)組及模型組予等體積生理鹽水，灌胃10 mL/kg，各組均提前給藥2周。除假手術(shù)組外，2周后各組均復制心肌缺血再灌注損傷模型。造模成功后，每組(含假手術(shù)組) 隨機選取8只大鼠進行指標檢測。

1.5 造模方法

大鼠稱體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖，氣管插管連接小動物呼吸機，經(jīng)左前胸3～4肋間開胸，充分暴露心臟，用6～0無創(chuàng)縫線結(jié)扎左冠狀動脈主干支(在動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部約1 mm處)，心電示波器顯示Ⅱ?qū)?lián)J點或ST段抬高>0.2 mV，局部心肌顏色變暗30 min后，剪開縫線，再灌注120 min，建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

1.6 觀察指標

1.6.1 Elisa法檢測大鼠心肌組織SOD、MDA、ET、NO含量

取出大鼠心肌組織，解凍后用冰鹽水漂洗，取0.3 g心肌組織，用眼科剪刀剪碎，置于預冷的玻璃勻漿器中，將搗桿垂直充分研磨6～8 min，使組織勻漿化，低溫4 000 r/min離心15 min后取上清液，采用Elisa法檢測心肌組織中SOD、MDA、ET、NO的含量。

1.6.2 Western blot檢測大鼠心肌組織Bax、bcl-2表達

將心肌組織置于勻漿器中剪碎并勻漿，加400 μL裂解液裂(含PMSF)置于冰上，裂解30 min后將裂解液移至15 mL離心管中，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液后采用BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉(TBST緩沖液配制)室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗脫×3次后加入二抗(1∶100)，室溫孵育2 h后TBST緩沖液洗脫3次，化學發(fā)光法(ECL)法顯影、定影并膠片曝光。

1.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織SOD、MDA含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織SOD活性降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組大鼠心肌組織SOD活性升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹蔞護冠方中劑量比較，丹蔞護冠方低劑量組心肌組織MDA含量升高，丹蔞護冠方高劑量組心肌組織SOD活性升高，MDA含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 丹蔞護冠方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織SOD、MDA含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與丹蔞護冠方中劑量比較，&P<0.05

2.2 對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NO、ET含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NO含量降低， ET含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組大鼠心肌組織NO含量升高， ET含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹蔞護冠方中劑量比較，丹蔞護冠方低劑量組心肌組織NO含量降低，丹蔞護冠方高劑量組心肌組織NO含量升高，ET含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 丹蔞護冠方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織NO、ET含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與丹蔞護冠方中劑量比較，&P<0.05

2.3 對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織Bax、bcl-2基因表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Bax表達增高，bcl-2基因表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，丹蔞護冠方低劑量、中劑量和高劑量組大鼠心肌組織Bax表達降低，bcl-2基因表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹蔞護冠方中劑量比較，丹蔞護冠方高低劑量組心肌組織Bax和bcl-2基因表達無顯著差異(P>0.05)，丹蔞護冠方高劑量組心肌組織Bax表達降低，bcl-2基因表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 丹蔞護冠方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織Bax、bcl-2基因表達的影響注：1.假手術(shù)組；2.模型組；3.丹蔞護冠方低劑量組；4.丹蔞護冠方中劑量組；5.丹蔞護冠方高劑量組

3 討論

心肌缺血再灌注損傷屬于中醫(yī)“胸痹”“真心痛”的范疇[4-5]，因年老體虛，心陽不振，心陰內(nèi)耗；或素體陽虛，胸陽不展，血行不暢；或情志失調(diào)，氣滯痰濁，而痹阻心脈；或飲食不當，損傷脾胃，以致清陽不升、氣機不暢、心脈痹阻，引發(fā)本病，本病病機為本虛標實，本虛主要為氣血陰陽的虛損，標實主要為氣滯、血瘀、痰毒[6-7]。故中醫(yī)治療以扶正補虛為主，輔以活血化痰、解毒散結(jié)為基本原則[8-9]。

丹蔞護冠方由丹參、瓜蔞、半夏、薤白、肉桂和三七粉等組成，具有化痰散結(jié)、活血通絡的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明：丹參酮ⅡA可升高心肌脂肪酸結(jié)合蛋白水平，升高心肌線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性，降低心肌組織缺血修飾白蛋白含量，抑制調(diào)亡加速基因bax 的表達,降低大鼠心肌梗死面積，減輕心肌細胞變性壞死程度，降低缺血再灌注對心肌線粒體的損傷從而保護心肌[10-11]。瓜蔞能增加離體豚鼠心臟冠脈血流量，改善缺血心肌能量和氧的供需平衡，可降低凋亡細胞數(shù)、MDA含量和CK活性，升高SOD活性和NO含量，抑制血小板氧合酶活性，減少血栓素A2而發(fā)揮抗血小板聚集作用[12-13]。瓜蔞薤白半夏湯可上調(diào)JAK2、STAT3、Bcl-2的表達，下調(diào)Bax表達，抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡的發(fā)生，上調(diào)VEGF 蛋白和基因的表達、升高MVD，促進大鼠MIRI后心肌組織的血管新生，形成冠脈側(cè)支，減少心肌梗死面積，對缺血再灌注心肌起保護作用[14-16]。

研究表明，心肌細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中起主導作用，有多種凋亡基因共同調(diào)控心肌細胞凋亡過程，其中Bcl-2在抑制細胞凋亡中起著關鍵作用， 而Bax在細胞凋亡中起著促進作用[17]。本實驗結(jié)果證實，丹蔞護冠方可增加SOD活性和NO含量，降低MOD、ET含量，促進Bcl-2表達，通過抑制氧化應激反應，改善血管內(nèi)皮功能能，調(diào)控凋亡基因的表達等途徑干預心肌缺血再灌注損傷從而保護心肌。

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2016-07-07

2016-10-15

陜西省科技廳自然科學研究計劃項目(2015JM8384)；陜西中醫(yī)藥大學科研基金項目(2015QN26)；陜西省第五批重點專科心腦血管病科建設項目；國家中醫(yī)藥管理局重點?？菩难懿】平ㄔO項目

李彩紅(1986-)，女，碩士研究生，主要從事冠心病的基礎與臨床研究。

*通訊作者：王永剛(1977)，男，博士,副教授，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病基礎與臨床研究。

R285.5

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1002-2392(2017)03-0024-03