徐靜，王宇，李霄，王斌，孟永海，匡海學(xué)，王秋紅

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

牽牛子水煎液對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎臟的保護(hù)作用

徐靜1，王宇1，李霄1，王斌1，孟永海1，匡海學(xué)1，王秋紅2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：觀察牽牛子水煎液對(duì)阿霉素腎病模型大鼠腎臟的保護(hù)作用。方法：采用尾靜脈注射阿霉素的方法建立大鼠腎小球硬化模型?？疾鞝颗Ｗ铀逡旱?、中、高劑量(0.21 g/kg，0.63 g/kg，1.26 g/kg)對(duì)阿霉素腎病模型大鼠血清生化指標(biāo)IL-1β、TNF-α及尿中蛋白含量的影響，并觀察腎臟病理改變。結(jié)果：與空白組比較，模型組白蛋白、總蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的含量明顯降低；總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐和尿素氮的含量明顯升高；IL-1β、TNF-α和尿中蛋白濃度明顯升高；腎小球上皮細(xì)胞腫脹明顯，腎小球毛細(xì)血管瘀血并部分閉塞，系膜基質(zhì)重度增生呈彌漫性分布。與模型組比較，牽牛子中劑量可以升高血清中白蛋白、總蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的水平，降低總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐、尿素氮、IL-1β、TNF-α及尿中蛋白濃度。光鏡檢查結(jié)果顯示牽牛子中劑量組腎小球上皮細(xì)胞腫脹及腎小球系膜基質(zhì)增生的程度明顯減輕。結(jié)論：牽牛子水煎液中劑量為有效劑量，它可以提高腎小球的濾過功能，調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓的平衡及血脂紊亂，減輕上皮細(xì)胞腫脹及腎小球系膜基質(zhì)增生，從而改善腎病綜合征表癥，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。其作用機(jī)理可能與降低炎性因子含量有關(guān)。

牽牛子；阿霉素腎??；腎小球硬化；白介素-1β；腫瘤壞死因子-α

腎小球疾病是指以腎小球損害為主的變態(tài)反應(yīng)性炎癥，是較為常見的疾病。其臨床表現(xiàn)為蛋白含量降低，腎小球?yàn)V過功能下降，血脂含量升高等腎病綜合征。阿霉素腎病模型病理及生理改變類似于人類的微小病變型腎病，且模型制備簡(jiǎn)單方便[1-3]。傳統(tǒng)利水中藥牽牛子具有瀉水通便、消痰滌飲等功效，常用于水腫脹滿，二便不通，痰飲積聚，氣逆喘咳等病癥[4]。本實(shí)驗(yàn)選用阿霉素誘導(dǎo)大鼠腎小球硬化，通過觀察不同濃度牽牛子水煎液對(duì)阿霉素腎病大鼠血清白蛋白、總蛋白、總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐、尿素氮、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白介素-1β和腫瘤壞死因子指標(biāo)和尿中蛋白濃度的變化，以及腎臟病理改變，探討牽牛子水煎液對(duì)阿霉素腎病模型治療作用及作用機(jī)制，為下一步性味拆分組分藥效學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

牽牛子藥材購自哈爾濱市藥材公司(產(chǎn)地：山東)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)教研室王振月教授鑒定為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil(L.) Choisy的干燥成熟種子，符合2010版《中國藥典》規(guī)定。牽牛子水煎液由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備提供。選用水煎煮法，獲得水煎液后，經(jīng)萃取、大孔樹脂、醇沉等步驟，將牽牛子水煎液拆分為互不交叉的4個(gè)組分脂肪油組分、多糖組分、酚酸組分、樹脂苷組分。制備流程見圖1。

圖1 牽牛子水煎液及拆分組分制備流程

100 g牽牛子，按照確定的牽牛子性味物質(zhì)基礎(chǔ)拆分工藝，拆分獲得水煎液39 g、脂肪油組分1.6 g、多糖組分23.1 g、酚酸組分8.0 g、樹脂苷組分6.3 g。即水煎液的提取率為39%。中國藥典中記載牽牛子用藥量為3～6 g，6 g×0.018=0.108 g，即0.108 g生藥量/200 g大鼠×1倍量×39%提取率=0.21 g/kg，即牽牛子給藥劑量為低劑量0.21 g/kg，中劑量0.63 g/kg，高劑量1.26 g/kg，比例為1∶3∶6(相當(dāng)于生藥0.054 g/kg,1.62 g/kg,0.324 g/kg)。取108 g干燥牽牛子水浸泡過夜，加入10倍水煎煮提取3次，每次2 h，合并濾液后濃縮至1 000 mL，濃度為0.054 g/mL生藥量，大鼠按照1 mL/100 g標(biāo)準(zhǔn)給予灌胃治療。

1.2 動(dòng)物

SD大鼠50只，7～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，雄性，SPF清潔級(jí)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK(黑)20130004號(hào)。

1.3 試劑

鹽酸阿霉素注射液10 mg/瓶(山西普德藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H14023143)；白蛋白(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：151411)、總蛋白(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：151261)、總膽固醇(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：151871)、總甘油三酯(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：167451)、肌酐(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：153281)、尿素氮(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：161281)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：162531)；大鼠腫瘤壞死因子-α(優(yōu)而生，批號(hào)：L161123029)、白介素-1βELISA試劑盒(優(yōu)而生，批號(hào)：L160818450)、BCA蛋白定量(康為世紀(jì)，批號(hào)：07112017)。

1.4 儀器

AB265-S電子分析天平(瑞士梅特勒公司)，2-16P高速離心機(jī)(德國sigma公司)，魅力2000全自動(dòng)生化分析儀(美國百昂集團(tuán)儀器公司)，Victor X3型酶標(biāo)儀(美國Perkin Elemr公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為五組，分別為空白組、模型組、牽牛子低劑量組、牽牛子中劑量組、牽牛子高劑量組。每組10只。自由飲水、飲食。

參照Bertain等文獻(xiàn)[1]進(jìn)行阿霉素模型的制備。將阿霉素用生理鹽水稀釋成0.4 mg/mL的注射液，第1天按4 mg/kg大鼠體質(zhì)量尾靜脈注射阿霉素，第8天以同樣方法按3.5 mg/kg大鼠體質(zhì)量注射阿霉素[5]。第11天開始給予牽牛子水煎液低、中、高劑量(0.21 g/kg，0.63 g/kg，1.26 g/kg)治療干預(yù)，周期為14天。第24天給藥后上代謝籠收集24 h尿液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定尿蛋白濃度。第25天，用烏拉坦麻醉后腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液并存于-80℃待測(cè)。用生化儀檢測(cè)血清中白蛋白、總蛋白、總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐、尿素氮、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。用酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA法)檢測(cè)IL-1β和TNF-α含量的變化，并觀察其腎臟病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血清中白蛋白、總蛋白和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量的影響

表1 牽牛子對(duì)阿霉素腎病大鼠血清白蛋白、總蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量的影響

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表1可見，與空白組比較，模型組白蛋白、總蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶指標(biāo)含量明顯降低，均具有極顯著性差異，證明模型建立成功。與模型組比較，在白蛋白指標(biāo)中，牽牛子中劑量組指標(biāo)含量明顯升高，具有顯著性差異；在總蛋白指標(biāo)中，牽牛子中劑量組指標(biāo)含量明顯升高，具有顯著性差異；在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶指標(biāo)中，牽牛子低、中、高劑量組指標(biāo)含量明顯升高，其中牽牛子低劑量組具有顯著性差異，牽牛子中、高劑量組具有極顯著性差異。

2.2 對(duì)血清中總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量的影響

由表2可見，與空白組比較，模型組總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量明顯升高，均具有極顯著性差異，證明模型建立成功。與模型組比較，在總膽固醇指標(biāo)中，牽牛子中劑量組含量明顯降低，具有顯著性差異；在總甘油三酯指標(biāo)中，牽牛子中劑量組指標(biāo)含量明顯降低，具有顯著性差異；在血肌酐指標(biāo)中，牽牛子中劑量組指標(biāo)含量明顯降低，具有顯著性差異；在尿素氮指標(biāo)中，牽牛子中、高劑量組指標(biāo)含量明顯降低，其中牽牛子中劑量組具有極顯著性差異，高劑量組具有顯著性差異。

表2 牽牛子對(duì)阿霉素腎病大鼠血清總膽固醇、總甘油三酯、血肌酐和尿素氮含量的影響

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 對(duì)血清中IL-1β、TNF-α含量的影響

表3 牽牛子對(duì)阿霉素腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的影響

注：與空白組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表3可見，與空白組比較，模型組IL-1β和TNF-α含量明顯升高，均具有極顯著性差異，證明模型建立成功。與模型組比較，牽牛子中劑量組IL-1β和TNF-α含量明顯降低，具有顯著性差異。

2.4 對(duì)尿中蛋白濃度的影響

表4 牽牛子對(duì)阿霉素腎病大鼠尿中蛋白濃度的影響

注：與空白組比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

由表4可見，造模前各組大鼠尿中蛋白濃度無明顯差異；處死前檢測(cè)尿中蛋白濃度，與空白組比較，模型組尿中蛋白濃度明顯升高，具有極顯著性差異。與模型組比較，牽牛子中、高劑量組尿中蛋白含量均明顯降低，其中，牽牛子中劑量組具有極顯著性差異。

2.5 腎組織病理學(xué)改變

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。光鏡下可見，空白組腎小球無腫脹，無充血，無系膜基質(zhì)增生，腎管型、腎曲管結(jié)構(gòu)正常。模型組大部分腎小球上皮細(xì)胞腫大，腎小球毛細(xì)血管充血，出現(xiàn)蛋白管型，球囊壁纖維化，系膜基質(zhì)中度或重度增生。牽牛子中劑量僅小部分腎小球腫脹，呈輕度系膜增生。其余各組可見大量蛋白管型及膠樣管型，腎小球萎縮。

圖2 各組腎臟組織HE染色(×400)

3 討論

牽牛子味苦、辛，性寒。歸肺經(jīng)、腎經(jīng)、大腸經(jīng)。具有瀉下、利尿、消腫、驅(qū)蟲等功效，主治肢體水腫、腎炎水腫、肝硬化腹水、便秘、蟲積腹痛等癥[6]?！侗静荨访t(yī)續(xù)注云，味苦寒能除濕，利小水，治下疰腳氣。凡藥中用牽牛者，少則動(dòng)大便，多則下水，此乃瀉氣之藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，牽牛子具有利尿作用[7]，提高腎小球?yàn)V過功能；具有瀉下作用、增加大腸小腸蠕動(dòng)；增加平滑肌作用，興奮子宮[8-9]；具有抗菌作用，可增長抑制率[10]。其中利尿作用尤為突出，張頌等[7]實(shí)驗(yàn)研究表明牽牛子能加速菊糖在腎臟中的排出。孫延平等[11]實(shí)驗(yàn)研究表明牽牛子具有利尿、增加大腸(小腸)推進(jìn)、胃排空、化痰、抗炎等藥理作用。臨床研究表明，尚學(xué)瑞[12]也發(fā)表了牽牛子治水腫驗(yàn)方。任建素[13]在治療慢性腎炎患者面浮肢腫、尿少尿閉等情況時(shí)，常在健脾益腎、化瘀通絡(luò)的基礎(chǔ)上，配伍牽牛子等利水中藥，采用逐水法使水濕從二便排出，調(diào)節(jié)水液代謝。余明[14]實(shí)脾飲加味治療慢性腎小球腎炎187例。牽牛子是該方的君藥，起主要作用。不過大量服用牽牛子也會(huì)產(chǎn)生毒副作用，胃腸、對(duì)腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)都有影響[15]。

本實(shí)驗(yàn)選用阿霉素誘導(dǎo)大鼠腎小球病變，該模型制備簡(jiǎn)單方便,較好復(fù)制。阿霉素可損害細(xì)胞生物膜，影響線粒體的氧化磷酸化過程，利用其腎毒性可造成與人類腎小球硬化相似的病理改變。阿霉素模型大鼠具有血清總蛋白、白蛋白含量降低，血肌酐、尿素氮及血脂含量升高等腎病綜合征表現(xiàn)。血清肌酐和尿素氮都是機(jī)體蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，它們的濃度取決于氮的分解和腎的排泄功能，在攝入食物及體內(nèi)代謝比較穩(wěn)定的情況下，其濃度的多少取決于腎的排泄能力，因此，血肌酐和尿素氮濃度在一定程度上反映腎小球的濾過功能[16]。與腎臟疾病相關(guān)的細(xì)胞因子很多，TNF-α和IL-1β是重要的致病炎癥因子。其中，TNF-α可直接或間接損傷腎小管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量引起凝血的物質(zhì)，促使腎小球基底面通透性的改變，從而加重腎小球的損傷[17]；IL-1β能夠引起腎小球內(nèi)凝血，刺激腎小球系膜細(xì)胞基質(zhì)增生，使腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎小球硬化[18]。

牽牛子中劑量能明顯升高血清中蛋白濃度，降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白的濃度；改善血脂含量，降低總甘油三酯、總膽固醇濃度；降低血清TNF-α和IL-1β水平含量；減輕腎小球系膜基質(zhì)增生。綜合評(píng)價(jià)后得出牽牛子中劑量能提高腎小球的濾過功能，調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓的平衡及血脂紊亂，減輕上皮細(xì)胞腫脹及腎小球系膜基質(zhì)增生，從而改善腎病綜合征表癥，對(duì)腎臟具有保護(hù)作用。作用機(jī)制可能通過降低一系列炎性細(xì)胞因子的含量，從而達(dá)到緩解水腫的療效。研究表明牽牛子中劑量為最佳劑量，對(duì)下一步實(shí)驗(yàn)中性味拆分組分藥效學(xué)研究提供依據(jù)，也為進(jìn)一步證明中藥性味拆分理論“一味一性”“一藥X味Y性(Y≤X)”的假說提供科學(xué)依據(jù)[19]。

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2016-11-25

2016-12-30

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2013CB531801)

徐靜(1986-)，女，博士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*通訊作者：王秋紅(1969-)，女，博士，教授，從事中藥炮制研究、中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和新藥開發(fā)。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0005-04