樊曉婷 田 蕾 楊 琳 李麗英

(首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系 ‘肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)’北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

· 基礎(chǔ)研究 ·

大麻素受體1介導(dǎo)人類中性粒細(xì)胞dHL60的遷移功能

樊曉婷 田 蕾 楊 琳 李麗英*

(首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系 ‘肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)’北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的 研究大麻素受體(cannabinoid receptors, CBs)對(duì)人類中性粒細(xì)胞(dHL60)遷移的影響。方法 體外培養(yǎng)人早幼粒白血病細(xì)胞系HL60，使用二甲基亞砜(dimethylsulphoxide, DMSO)誘導(dǎo)為類中性粒細(xì)胞(dHL60)，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)其分化標(biāo)志物CD11b mRNA的表達(dá)；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳、Western blotting法及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其大麻素受體1(CB1)及受體2(CB2)的表達(dá)；ACEA、AM281分別為CB1的藥理學(xué)激動(dòng)劑和拮抗劑，JWH133、AM630分別為CB2的藥理學(xué)激動(dòng)劑和拮抗劑，應(yīng)用Boyden chamber法檢測(cè)ACEA和JWH133對(duì)dHL60遷移的影響，并從藥理學(xué)阻斷CB1、CB2后，檢測(cè)其遷移功能的變化；使用鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維，并應(yīng)用高內(nèi)涵掃描分析的方法對(duì)肌動(dòng)蛋白纖維的聚合進(jìn)行分析。結(jié)果 dHL60在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)CB1、CB2；ACEA能夠誘導(dǎo)dHL60的遷移及其細(xì)胞骨架的聚合，且其所誘導(dǎo)的遷移能夠被CB1的藥理學(xué)阻斷劑AM281所阻斷，而CB2的藥理學(xué)阻斷劑AM630對(duì)ACEA所誘導(dǎo)的遷移并無影響；給予CB2的激動(dòng)劑JWH133對(duì)dHL60的遷移及細(xì)胞骨架的聚合無明顯作用。結(jié)論 激活CB1能夠促進(jìn)dHL60的遷移。

大麻素受體；人類中性粒細(xì)胞；細(xì)胞遷移

中性粒細(xì)胞屬于天然免疫的第一道防線，是人體內(nèi)最主要的固有免疫細(xì)胞之一，主要來源于骨髓。當(dāng)機(jī)體受到刺激發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，中性粒細(xì)胞被激活并進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，后將會(huì)朝著趨化梯度區(qū)域的上游遷移[1]。當(dāng)其遷移到炎性反應(yīng)部位，可以通過吞噬、脫顆粒作用及中性粒胞外誘捕網(wǎng)來發(fā)揮其功能[2]。由于中性粒細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，難以在體外培養(yǎng)，而人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60，經(jīng)藥物體外誘導(dǎo)后，可表現(xiàn)出不同程度地向粒細(xì)胞、單核細(xì)胞分化的現(xiàn)象。使用二甲基亞砜(dimethylsulphoxide, DMSO)進(jìn)行體外誘導(dǎo)，可分化為類中性粒細(xì)胞(dHL60)[3]。dHL60可替代中性粒細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。

內(nèi)源性大麻素是一類脂質(zhì)分子，主要包括2-花生四烯甘油(2-arachidonoyl glycerol，2-AG) 和N-花生四烯乙醇胺(N-arachidonoyl ethanolamine，AEA)，在多種疾病中發(fā)揮重要作用[4-5]，包括能量代謝性疾病、疼痛以及抑郁、心血管疾病等。大麻素受體(cannabinoid receptors, CBs)是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，可分為受體1(cannabinoid receptor 1，CB1)和受體2(cannabinoid receptor 2， CB2)兩個(gè)亞型。目前已有文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道，CB1在細(xì)胞遷移過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CB1可以調(diào)控白細(xì)胞向真皮的浸潤(rùn)，使用CB1基因敲除的小鼠，給予博來霉素的刺激，發(fā)現(xiàn)在其所誘導(dǎo)的真皮癌癥中損傷部位的白細(xì)胞數(shù)減少[6]；激活CB1可以通過Gα(i/o)并且激活下游小G蛋白R(shí)hoA，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移[7]。同時(shí)，激活CB1能夠誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞系J774A.1的遷移[8]。對(duì)于CB2受體，有文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道其在緩減炎性反應(yīng)、緩減氧化應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用。

然而，大麻素受體如何影響中性粒細(xì)胞的遷移并不清楚。因此本研究擬采用dHL60為研究對(duì)象，以CBs為靶分子，探討激活CBs對(duì)dHL60遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Histopaque?-1077、Histopaque?-1119(Sigma公司，美國)；1640培養(yǎng)基(Corning Cellgro公司，美國)；ACEA、AM281和AM630 (TOCRIS/R&D，美國)；BCATMprotein assay kit(Pierce公司，美國)；兔抗CB1多克隆抗體(Cayman Chemical公司，美國),兔抗CB2多克隆抗體(Cayman Chemical公司，美國),抗β-Tublin單克隆抗體(全式金公司，中國)；胎牛血清(Excell，中國)；Cy3標(biāo)記的二抗(Jackson Immunoresearch公司，美國)；Boyden chamber(BD Biosciences公司，美國)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國)；Calcein-AM (Life Technologies，美國)；N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-FORMYL-MET-LEU-PHE, fMLP)(Sigma公司，美國)；人纖連蛋白Fibronectin(Calbiochem公司，美國)；Alexa Fluor 488 鬼筆環(huán)肽(Life Technologies公司，美國)；德國Heraeus公司CO2 培養(yǎng)箱(BB16)；Fluoroskan AscentTMFL 熒光和化學(xué)發(fā)光分析儀；美國LI-COR公司Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)；美國Thermo Fisher公司高內(nèi)涵分析儀(Cell Insight公司)；美國 Bio-Rad公司Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)；美國ABI公司Real-time PCR儀(AB Prism 7300)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL60購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心細(xì)胞庫。使用20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HL60，并于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)鑒定dHL60 中 CD11b mRNA 的變化情況

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers for real time RT-PCR

CB1: cannabinoid receptor 1;CB2: cannabinoid receptor 2.

檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，溶解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果以18S rRNA 進(jìn)行校正，用ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

1.4 Western blotting法檢測(cè)dHL60中CB1、CB2 的表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白：收集誘導(dǎo)后的dHL60，加入20μL RIPA裂解液，置于冰上15 min，后13 200轉(zhuǎn)離心15 min，使用BCATMprotein assay kit對(duì)待測(cè)樣本濃度進(jìn)行檢測(cè)，后99 ℃蛋白變性10 min。上樣，20 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，DNA 預(yù)染Marker 加入7 μL，電泳完成后并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h，anti-Tublin按1∶1 000用脫脂奶粉稀釋，anti-CB1按1∶200用脫脂奶粉稀釋， anti-CB2按1∶200用脫脂奶粉稀釋。4 ℃過夜，TBS洗。二抗按1∶10 000用脫脂奶粉稀釋，避光平搖1 h，TBS洗，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描。

1.5 細(xì)胞免疫熒光鑒定 dHL60 中CB1、CB2 的表達(dá)

接種dHL60于96孔板中(10 000/孔)，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛4 ℃固定細(xì)胞40 min。PBS洗。0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PBST室溫打孔15 min，2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min，分別用一抗CB1(1∶100, Cayman Chemical)、CB2(1∶100, Santa Cruze公司)，4 ℃孵育過夜。PBS洗。Cy3標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h。PBS洗。DAPI染核，高內(nèi)涵掃描分析并獲取圖像。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) dHL60 表達(dá)CB1和CB2

dHL60的CB1和CB2的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠濃度為2%，100 V恒壓電泳40 min，暗室內(nèi)紫外拍照。引物序列見表1。

1.7 F-actin 染色

接種dHL60于Fibronectin包被過的板子中進(jìn)行細(xì)胞爬片(2×105/孔)，給予不同濃度的ACEA(CB1激動(dòng)劑)及 fMLP(陽性對(duì)照)刺激細(xì)胞，后用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛4 ℃固定細(xì)胞40 min。PBS洗 3次，每次5 min。0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))PBST室溫打孔15 min，2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min，Alexa Fluor 488 鬼筆環(huán)肽(1∶100 PBS稀釋)室溫染色20 min，PBS洗3次，每次5 min。DAPI染色5 min，高內(nèi)涵掃描分析并獲取圖像。

1.8 Boyden chamber assay 檢測(cè) dHL60 的遷移能力

dHL60 用2 μmol/L Calcein-AM 4 ℃孵育30 min，后用含2.5%(體積分?jǐn)?shù))血清的培養(yǎng)基重懸。經(jīng)處理過的細(xì)胞懸液200μL，加在 Transwell 小室的上室中(膜孔徑3μm)并接種在24孔板上。含有2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))血清以及趨化因子的培養(yǎng)基700 μL加在下室中。遷移一定時(shí)間后，棄去小室，收集下室液體，1 200 r/min， 5 min 離心，棄上清，用100 μL PBS 重懸并將重懸液加入到不透光的96孔板(白色底板)中，使用Fluoroskan AscentTMFL 熒光和化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)板485/530 nm處的熒光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體外誘導(dǎo) HL60 分化為 dHL60，其分化標(biāo)志物CD11b的表達(dá)明顯增加

使用1.3%(體積分?jǐn)?shù))二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)后，HL60中CD11b的表達(dá)明顯上升，DMSO誘導(dǎo)1 d后，與對(duì)照組相比CD11b的表達(dá)上升2.36倍，2 d時(shí)上升5.99倍，3 d時(shí)上升11.9倍，4 d時(shí)上升9.22倍，誘導(dǎo)至第5天與原代中性粒細(xì)胞CD11b的表達(dá)最為接近(P<0.05)(圖1)。

圖1 HL60經(jīng)DMSO誘導(dǎo)后CD11b的表達(dá)明顯增加Fig.1 CD11b mRNA expression up-regulated in dHL60

HL60 cell was cultivatedinvitroand stimulated by 1.3% DMSO for 5 days. CD11b mRNA expression was determined by real time RT-PCR. Representatives of three independent experiments are shown.*P<0.05vsunstimulated,n=3; RT-PCR:reverse transcription-polymerase chain reaction; DMSO:dimethylsulphoxide.

2.2 dHL60在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)CB1和CB2

圖2A中NO-RT為陰性對(duì)照，顯示dHL60在mRNA水平上表達(dá)CB1和CB2。進(jìn)一步確認(rèn)dHL60在蛋白質(zhì)水平表達(dá)CB1和CB2，Western blotting法檢測(cè)結(jié)果見圖2，其中腦和脾臟分別為CB1和CB2的陽性對(duì)照；如圖2C為免疫熒光的結(jié)果，dHL60在蛋白質(zhì)水平表達(dá)CB1(紅色熒光)和CB2(紅色熒光)。

2.3 CB1介導(dǎo)dHL60的遷移

使用Boyden chamber 細(xì)胞遷移，分別給予0.5、1.0、5.0mol/L CB1的激動(dòng)劑ACEA及CB2的激動(dòng)劑JWH133誘導(dǎo)遷移，0.5、1.0、5.0mol/L的ACEA能夠誘導(dǎo)dHL60的遷移；0.5mol/L的ACEA促遷移倍數(shù)為1.52倍， 1mol/L時(shí)促遷移倍數(shù)為2.20倍，在5mol/L的濃度時(shí)，ACEA的促遷移能力最大，上調(diào)為對(duì)照組的3.24倍(P<0.05)，而給予CB2的激動(dòng)劑JWH133對(duì)其遷移并無明顯影響(圖3)。

圖2 dHL60在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)CB1和CB2Fig.2 dHL60 expressed CB1 and CB2

A： RT-PCR production of CB1 or CB2 was size fractionated in a 2% agarose gel； B： CB1 and CB2 protein was evaluated by Western blotting. β-Tublin and GAPDH served as loading controls； C： Representative images of dHL60 for CB1 or CB2 (red) were shown by immunofluorescence. Scale bars: 25m；Nuclei were stained with DAPI for 5 mins. CB1: cannabinoid receptor 1; CB2: cannabinoid receptor 2; RT-PCR:reverse transcription-polymerase chain reaction.

圖3 CB1介導(dǎo)dHL60的遷移Fig.3 CB1 mediates the migration of dHL60

Boyden chamber assay was performed in dHL60. 100 nmol/L fMLP as positive control. dHL60 (4×104cells/chamber) were allowed to migrate for 2 hours and incubated with ACEA (CB1 agonist) or JWH133 (CB2 agonist).Migration values were determined by fluorescence of each well. Fluorescence was measured using Fluoroskan AscentTMFL analysis.*P<0.05vscontrol.n=3.CB1: cannabinoid receptor 1; CB2: cannabinoid receptor 2.

2.4 阻斷CB1能夠抑制dHL60的遷移

給予dHL60 CB1或CB2的藥理學(xué)阻斷劑AM281或AM630預(yù)孵育，后在Boyden chamber下室中加入終濃度為5 μmol/L ACEA。使用CB1的藥理學(xué)阻斷劑AM281后，dHL60的遷移受到明顯抑制，使用CB2的藥理學(xué)阻斷劑AM630，其對(duì)ACEA誘導(dǎo)的遷移并無影響(圖4)。

圖4 阻斷CB1能夠抑制dHL60的遷移Fig.4 Blockade of CB1 rather than CB2 reduces ACEA-mediated migration of dHL60

dHL60 were incubated with AM281or AM630 (CB2 antagonist, 10 μmol/L) for 1 hour prior to ACEA treatment (5μmol/L). Data were presented as the mean± SE of three independent experiments.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsACEA treatment.n=3. CB1: cannabinoid receptor 1; CB2: cannabinoid receptor 2.

2.5 激活CB1促進(jìn)dHL60骨架聚合，而激活CB2并無明顯作用

分別用0.5、1.0、5.0 μmol/L的ACEA及JWH133刺激dHL60，后進(jìn)行羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色以觀察細(xì)胞內(nèi)F-actin的聚合情況。高內(nèi)涵掃描熒光圖圖5A，F(xiàn)-actin熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5B。不同濃度的ACEA刺激后F-actin的表達(dá)增強(qiáng)，聚合水平明顯升高；0.5μmol/L的ACEA 刺激后F-actin的表達(dá)上升倍數(shù)為2.44倍，1μmol/L的ACEA 刺激后F-actin的表達(dá)上升倍數(shù)為2.50倍， 5μmol/L的ACEA 刺激后F-actin的表達(dá)上升倍數(shù)為2.73倍。而JWH133刺激后F-actin的表達(dá)無明顯變化，且不同濃度對(duì)于F-actin的表達(dá)并無影響。

3 討論

中性粒細(xì)胞在免疫相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用[11]。當(dāng)炎性反應(yīng)發(fā)生時(shí)，在趨化因子作用下會(huì)第一時(shí)間遷移到炎性反應(yīng)部位從而發(fā)揮功能。組織定居的巨噬細(xì)胞、壞死的組織細(xì)胞、細(xì)菌等均可以產(chǎn)生趨化信號(hào)以此介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向損傷部位的定向遷移[12]。然而，中性粒細(xì)胞向損傷部位的過渡浸潤(rùn)及有毒介質(zhì)的大量釋放均可能帶來損傷，例如在敗血癥、內(nèi)毒素血癥、缺血性再灌注損傷以及乙醇、病毒引發(fā)的肝臟疾病中，由中性粒細(xì)胞所引發(fā)的炎性反應(yīng)均有可能加重肝組織的損傷[13]。盡管中性粒細(xì)胞在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能，但其向損傷部位募集的分子機(jī)制并不十分清楚。

圖5 激活CB1促進(jìn)dHL60骨架聚合，而激活CB2并無明顯作用Fig.5 Activation of CB1 caused an increase of F-actin remodeling in dHL60

High content analysis was performed in dHL60. fMLP as positive control. Scale bars: 25μm.*P<0.05vscontrol group；n=3.CB1: cannabinoid receptor 1; CB2: cannabinoid receptor 2.

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)包括其合成酶、降解酶以及內(nèi)源性大麻素的配體及G蛋白偶聯(lián)的大麻素受體(CB1和CB2)。大麻素發(fā)揮其功能主要是通過激活G蛋白偶聯(lián)受體CB1和CB2。文獻(xiàn)[14-16]表明，關(guān)于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與炎性反應(yīng)的研究主要聚焦在CB2受體上，但近年來研究[17]顯示內(nèi)源性大麻素通過CB1影響免疫系統(tǒng)的功能，在多種免疫疾病中發(fā)現(xiàn)CB1發(fā)揮著非常重要的作用，包括多發(fā)性硬化和Crohn病。本研究首先明確了dHL60表達(dá)CB1及CB2。使用ACEA激活CB1可以誘導(dǎo)dHL60的遷移，且能夠被CB1的藥理學(xué)阻斷劑AM281所阻斷；由于CB1與CB2具有高度的同源性，因此ACEA對(duì)CB2有弱的親和力，筆者使用CB2的藥理學(xué)阻斷劑AM630，發(fā)現(xiàn)其對(duì)ACEA誘導(dǎo)的遷移并無影響。當(dāng)給予CB2的激動(dòng)劑JWH133，發(fā)現(xiàn)其對(duì)dHL60并無促遷移作用。細(xì)胞遷移與細(xì)胞骨架重構(gòu)息息相關(guān)[14]，而肌動(dòng)蛋白F-actin是細(xì)胞骨架的重要組成。本研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中F-actin的表達(dá)較少，在給予ACEA刺激后其F-actin的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而給予JWH133則無明顯變化，表明CB1介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)從而促進(jìn)了細(xì)胞遷移。以上結(jié)果提示，激活CB1能夠促進(jìn)dHL60的遷移而激活CB2則無明顯的促遷移作用。

本研究在體外驗(yàn)證了激活CB1能夠誘導(dǎo)dHL60的遷移，為中性粒細(xì)胞參與的炎性反應(yīng)提供了新的分子機(jī)制。

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編輯 慕 萌

Cannabinoid receptor 1 mediated the migration of human neutrophil-like cell line dHL60

Fan Xiaoting, Tian Lei, Yang Lin, Li Liying*

(1.DepartmentofCellBiology,MunicipalLaboratoryforLiverProtectionandRegulationofRegeneration,CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China)

Objective To investigate the effect of cannabinoid receptors (CBs) on migration of human neutrophil-like cell line dHL60. Methods HL60 cell was cultivated in vitro and stimulated by dimethylsulphoxide (DMSO) to differentiate into neutrophil-like cells (dHL60), RT-PCR was used to detect the CD11b mRNA expression as a differentiation marker. Western blotting and agarose gel electrophoresis were used to detect the expression of CB1 and CB2. Boyden chamber was used for cell migration assay. Filamentous actin (F-actin) stained with phalloidin was examined by high content analysis. Results In this study, we present evidence that dHL60 significantly expressed CB1 and CB2; the treatment of ACEA (agonist of CB1) caused an increase in dHL60 migration and F-actin remodeling, the pharmacological inhibition of CB1 markedly attenuated ACEA-induced migration; the treatment of JWH133 (agonist of CB2) has no effect on migration and F-actin remodeling. Conclusion CB1 mediated the migration of human neutrophil-like cell line dHL60.

cannabinoid receptors (CBs); human neutrophil-like cell; cell migration

國家自然科學(xué)基金(81430013), 北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IDHT20150502)。 This study was supported by National Natural and Science Foundation of China (81430013), Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20150502).

時(shí)間：2017-06-09 17∶26 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1726.008.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.018]

Q2

2016-08-05)

*Corresponding author， E-mail：liliying@ccmu.edu.cn