崔 旭 紀 方 舒洛娃 李俊發(fā) 潘楚雄*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院麻醉科，北京 100730；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系，北京 100069)

· 麻醉學與神經科學 ·

cPKCγ膜轉位在Herkinorin減輕 MCAO 小鼠腦缺血再灌注損傷中的作用

崔 旭1紀 方1舒洛娃1李俊發(fā)2潘楚雄1*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院麻醉科，北京 100730；2.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院神經生物學系，北京 100069)

目的 探討非阿片類阿片受體激動劑Herkinorin后處理的腦保護作用以及典型蛋白激酶 Cγ(conventional protein kinase Cγ，cPKCγ)的作用。方法 成年雄性C57BL/6小鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組(Naive)，假手術組(Sham)，模型組(ischemia/reperfusion，I/R)，溶劑組(I/R+D，再灌注前腹腔注射同等劑量的DMSO)，Herkinorin組(I/R+H，再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin)。應用小鼠腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導缺血性腦卒中模型，通過神經行為和運動功能檢測評估腦損傷程度，借助2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride, TTC)染色觀察腦梗死體積，蛋白印跡檢測cPKCγ膜轉位(激活)水平。結果 與I/R組比較，I/R+H 組缺血再灌注后24 h和7 d的神經行為評分明顯降低，爬桿實驗、圓柱體實驗和步錯實驗測評明顯改善 (P<0.05，n=6)。TTC染色顯示I/R組梗死體積24 h為31.44%±5.44%，7 d為23.44%±7.95%， I/R+H 組(24 h：17.19%±3.23%，7 d：13.26%±2.71%)腦梗死體積明顯減少(P<0. 05，n=6)。Western blotting結果顯示，I/R組缺血核心區(qū)(Ic)和半影區(qū)(P)中cPKCγ膜轉位水平都明顯下降，而Herkinorin可明顯減輕MCAO小鼠半影區(qū)內cPKCγ膜轉位水平的降低(P<0.05，n=6)。結論 10 mg/kg Herkinorin腹腔注射能減輕MCAO小鼠皮質的缺血再灌注損傷，cPKCγ膜轉位水平的變化可能參與Herkinorin后處理腦保護的分子機制。

Herkinorin；后處理；缺血再灌注；腦保護；蛋白激酶C

腦卒中起病突然，發(fā)病率、致殘率和致死率都很高，目前缺乏有效的治療方法。已有研究[1]證實藥物缺血后處理(ischemic postconditioning, IPost)對缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)腦組織有保護作用。研究[2]顯示阿片受體激動劑嗎啡后處理具有腦保護作用，其中典型蛋白激酶 Cγ (conventional protein kinase Cγ，cPKCγ)膜轉位可能參與嗎啡腦保護的機制。Herkinorin是一種新型的非阿片類阿片受體激動劑，本研究擬觀察Herkinorin后處理的腦保護作用以及cPKCγ膜轉位水平的變化。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

1)動物：成年雄性C57BL/6小鼠，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。標準喂養(yǎng)，自由飲水進食。

2)試劑：2,3,5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride, TTC)、二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自美國Sigma公司；cPKCγ多克隆兔抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體和ECL 反應底物購自日本Chemicon公司； BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；蛋白酶抑制劑(AEBSF、高肽蛋白酶、抑肽酶、抑胃肽酶A和胰凝乳蛋白酶抑制劑)、β-actin單克隆鼠抗體、磷酸酶抑制劑(氟化鉀、岡田酸、焦磷酸鋼)、DTT、NP-40、EDTA、EGTA和SDS 等均購自美國Sigma-Aldrich公司；Herkinorin 購自英國Abcam公司，使用DMSO作為溶劑。

1.2 實驗方法

1)模型制備：按參考文獻[3]制備小鼠腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，具體操作如下：小鼠麻醉后在顯微鏡下游離頸總、頸外及頸內動脈，將線栓(頭端直徑0.23 mm、主干直徑0.18 mm)從頸外動脈小孔插入，再經頸總動脈至頸內動脈并進而向上到達大腦中動脈(深度約12 mm)。線栓阻塞1 h后恢復頸總動脈至頸內動脈的血流。整個手術和阻塞過程平均約80 min，術中敷料保溫，術后放入有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水和進食。

2)實驗分組：采用數(shù)字表法隨機分為對照組(Naive)，假手術組(Sham)，模型組(ischemia/reperfusion，I/R)，溶劑組(I/R+D)，Herkinorin組(I/R+H)。Sham組只進行手術操作，不插入線栓，I/R組缺血1 h后再灌注，I/R+H組在再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin，I/R+D組在再灌注前腹腔注射同等劑量的DMSO。

3)神經行為學和運動功能評分：分別于小鼠腦缺血再灌注損害發(fā)生后24 h和7 d進行神經行為學評分(0分為無神經行為學異常，10分為死亡)和運動功能測定(爬桿實驗、掛線實驗、圓柱體實驗和步錯實驗)[4]。

4)TTC染色及腦梗死體積的計算：神經行為學和運動功能測試后，迅速斷頭取腦，將厚約1.5 mm的腦片置于0.5%(質量分數(shù))TTC PBS磷酸鹽緩沖液中于37 ℃下孵育30 min。用參考文獻[5]的方法用Imagepro plus軟件分析計算梗死體積。

5)蛋白樣品的制備及蛋白印跡(Western blotting)檢測：缺血再灌注后24 h將小鼠斷頭取腦，取缺血皮質核心區(qū)(Ic)，半影區(qū)(P)和缺血對側皮質(C)，按10μL/mg的比例加入Buffer A勻漿、離心(4 ℃、30 000×g) 30 min，取上清為胞質(cytosolic)蛋白成分；沉淀中加入等體積的Buffer B勻漿、超聲、離心 (4 ℃、30 000×g) 30 min，取上清為膜相關(particular)蛋白成分[6]。BCA法蛋白定量，90 ℃加熱變性5 min，20 ℃保存?zhèn)溆谩?各組取30 g樣品行電泳[10% (質量分數(shù))SDS PAGE、 4 ℃、20～30 mA]和轉膜 (PVDF膜、400 mA、3 h)，用1∶1 000的cPKCγ和β-actin分別和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗進行雜交，所得 X線膠片用GeI Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)掃描分析[7]。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 Herkinorin后處理可以改善MCAO小鼠神經行為學損傷和運動功能

1)神經行為學評分：缺血再灌注后24 h，Sham組小鼠神經行為輕度損傷；7 d后Sham組和Naive組小鼠神經行為學表現(xiàn)基本正常，神經行為學評分為0。MCAO組小鼠24 h和7 d的神經行為學功能嚴重損傷，主要表現(xiàn)為活動減少、側傾、轉圈、低反應性、前肢屈曲和運動失調等。分別于MCAO后24 h和7 d比較不同組間的差異，Herkinorin組神經行為評分明顯低于I/R組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，n=6)，詳見圖1A。

2) 運動功能測定：分別于MCAO后24 h和7 d比較不同組間運動功能的差異，和Naive及Sham組相比，I/R和I/R+D組小鼠到達地面時間(time total)明顯延長，I/R+H組則較I/R和I/R+D組明顯縮短(n=6，P<0.05)，詳見圖1B。在圓柱體實驗中，I/R+H組小鼠損傷側前肢探尋燒杯壁的次數(shù)較I/R和I/R+D組明顯增多(P<0.05，n=6)，詳見圖1C。歩錯實驗中，I/R+H組小鼠損傷側肢體的肌力和協(xié)調性較I/R和I/R+D組明顯改善(P<0.05，n=6)，詳見圖1D。

圖1 Herkinorin后處理改善MCAO小鼠神經行為學和運動功能Fig.1 Herkinorin relieved neurobehavioral and sensorimotor injury in MCAO mice

A:neurobehavioral score; B:pole test; C:cylinder test; D:foot fault test. Scores and tests were compared among groups respectively at 24 h and 7 d after reperfusion(#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive：control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; MCAO：middle cerebral artery occlusion.

2.2 Herkinorin后處理減少MCAO小鼠腦梗死體積

TTC染色顯示，I/R和I/R+D組小鼠在缺血再灌注后24 h(I/R：31.44%±5.44%，I/R+D：28.05%±3.25%)和7 d(I/R：23.44%±7.95%，I/R+D：21.05%±4.67%)有明顯的白色腦缺血灶，定量分析顯示與I/R和I/R+D組相比，Herkinorin后處理組(24 h：17.19%±3.23%，7 d：13.26%±2.71%)明顯減少了 MCAO所致的小鼠腦梗死體積 (n=6，P<0.05)，詳見圖2。

2.3 Herkinorin減輕MCAO小鼠皮質半影區(qū)cPKC γ膜轉位水平的下降

cPKCγ膜轉位計算：以膜相關成分中cPKCγ的相對量(cPKCγ/β-actin)與胞質和膜相關成分中cPKCγ的相對量和的比值表示cPKCγ的膜轉位水平，即膜相關蛋白/(胞質蛋白+膜相關蛋白)。Western blotting結果顯示，缺血再灌注后24 h小鼠腦組織缺血核心區(qū)(Ic)和半影區(qū)(P)中cPKCγ膜轉位水平都明顯下降，而Herkinorin可明顯減輕MCAO小鼠半影區(qū)內cPKCγ膜轉位水平的降低(P<0.05，n=6)詳見圖3，對核心區(qū)cPKCγ膜轉位水平的影響差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 Herkinorin預處理減少MCAO小鼠腦梗死體積Fig.2 Herkinorin decreased infarct volume of MCAO mice

A and C:images of TTC-stained brain coronal sections 24 h(A) and 7 d(C) after reperfusion; B and D: quantitative analysis of infarct volume (#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive:control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; MCAO：middle cerebral artery occlusion；TTC:2,3,5-triph-enyltetrazolium chloride.

圖3 Herkinorin減輕MCAO小鼠皮質半影區(qū)cPKCγ膜轉位水平的下降Fig.3 Herkinorin alleviated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in cortex peri-infact region of MCAO mice

A: Western blotting showed the changes in cPKCγ membrane translocation in mice cortex; B:Quantitative analysis showed that cPKCγ membrane translocation levels decreased significantly both in Ic and P regions of Naive and Sham group. Herkinorin attenuated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in P region of MCAO mice (#P<0.05vsNaive and Sham,*P<0.05vsI/R and I/R+D,n=6 per group). Naive:control; Sham: sham-operation; I/R:MCAO 1 h/reperfusion; I/R+D:I/R+DMSO intraperitoneal injection; I/R+H:I/R+10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection; Ic: ischemic core region; P:peri-infarct region; C:contralateral cortex. cPKCγ: conventional protein kinases Cγ; MCAO：middle cerebral artery occlusion.

3 討論

缺血后處理和預處理一樣，都能減輕神經系統(tǒng)缺血再灌注損傷，但臨床應用有局限性。藥物后處理在再灌注開始前激活內源的保護機制發(fā)揮腦保護作用，臨床可行性更強。阿片類藥物可以通過激活阿片受體而產生不同程度的腦保護作用[8]，但阿片類藥物固有的不良反應限制了其臨床應用。新型非阿片類阿片受體激動劑Salvinorin A是高選擇性κ阿片受體激動劑，具有起效迅速，鎮(zhèn)靜作用時間短，不產生呼吸抑制等眾多優(yōu)點，但其不足之處是可產生幻覺[9]。以Salvinorin A為模板合成的Herkinorin克服了這一缺陷。Herkinorin是高效的μ和 κ受體激動劑，它還具有明顯的負性β-arrestin偏愛性的配體。這一特性使Herkinorin既具備傳統(tǒng)的阿片類藥物的治療作用，又大大減少了藥物耐受、便秘、呼吸抑制等不良反應[10]。

本研究顯示再灌注前腹腔注射10 mg/kg Herkinorin可顯著減輕小鼠腦缺血再灌注損傷，改善術后神經功能和感覺運動功能評分，減小腦梗死體積。在體研究顯示Herkinorin通過舒張豬腦血管發(fā)揮腦保護作用，這種作用可能是通過κ阿片受體，而不是μ受體介導的[11]。筆者近期的研究[4]提示Herkinorin預處理能減輕MCAO小鼠缺血再灌注損傷。離體研究[2]顯示嗎啡后處理對氧糖剝奪小鼠海馬腦片有腦保護作用。作為新型的非阿片類阿片受體激動劑，目前關于Herkinorin后處理腦保護作用的研究并不多，還需要更多的研究論證。

阿片受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，PKCs是G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)中的效應物，PKCs分為典型PKCs(cPKCα, βⅠ, βⅡ和γ)、新奇型PKCs(nPKCε, ε, η和θ)和非典型PKCs(aPKCξ和t/λ)3種。大多數(shù)PKC的亞型廣泛分布于各種組織，但是cPKCγ僅存在于神經元中，且完全在大腦和脊髓中表達。在腦內其主要分布于與神經元突觸可塑性密切相關的小腦、海馬、大腦皮質等部位，因此它在神經系統(tǒng)的生理和病理功能調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用。同時cPKCγ在腦的缺血再灌注損傷中被認為是一個關鍵分子，具有中樞神經系統(tǒng)特異性。研究[12]顯示cPKCγ的激活參與了胰島素抑制神經元壞死的作用以及雌激素介導的神經保護作用，與胰島素和雌激素一樣，阿片受體激動劑也可通過外源性刺激激活神經元cPKCγ膜轉位水平增高進而起到對缺血損傷的保護作用[13]。研究[2，4]顯示PKCs亞型(如cPKCβI、cPKCγ、nPKCε和nPKCε)可能在阿片受體介導的嗎啡預處理神經保護中發(fā)揮重要作用。小鼠離體海馬腦片氧糖剝奪模型表明，cPKCγ和nPKCε均參與了嗎啡預處理的神經保護作用[14]。本研究結果顯示Herkinorin后處理減輕了小鼠缺血再灌注損傷后cPKCγ膜轉位水平的急劇下降，提示cPKCγ膜轉位也參與了 Herkinorin腦保護作用的分子機制。cPKCγ膜轉位參與了嗎啡和Herkinorin腦保護作用，提示2類藥物可能都是通過激活相同的阿片受體發(fā)揮腦保護作用的。

本研究對Herkinorin后處理的腦保護作用和機制做了初步探索，發(fā)現(xiàn)10 mg/kg Herkinorin腹腔注射能減輕MCAO小鼠皮質的缺血再灌注損傷，cPKCγ膜轉位水平的變化可能參與Herkinorin后處理腦保護的分子機制。Herkinorin后處理腦保護作用的受體類型還需要進一步研究。

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編輯 孫超淵

cPKCγ membrane translocation plays roles in Herkinorin postconditioning against ischemia/reperfusion injury in MCAO mice

Cui Xu1, Ji Fang1, Shu Luowa1, Li Junfa2, Pan Chuxiong1*

(1.DepartmentofAnaesthesiology，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100730，China； 2.DepartmentofNeurobiology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective To evaluate the effects of Herkinorin postconditioning against ischemia/reperfusion injury in middle cerebral artery occlusion (MCAO) mice and the role of conventional protein kinase Cγ (cPKCγ). Methods Healthy adult male C57BL/6 mice were randomly divided into five groups: control group (Naive), sham-operation group (Sham), ischemia for 1 h and reperfusion group (I/R), I/R and DMSO intraperitoneal injection group (I/R+D),I/R and 10 mg/kg Herkinorin intraperitoneal injection group (I/R+H). Neurobehavioral score, Pole test, Wire hang test, Cylinder test and Foot fault test were performed at 24 h and 7 d after reperfusion. Using MCAO induced ischemic stroke mouse model, cerebral infarct volume was evaluated with TTC staining, the cPKCγmembrane translocation levels were detected with Western blotting. Results MCAO induced ischemia/reperfusion injury resulted in increased neurobehavioral scores in mice. Compared with I/R group, neurobehavioral scores of I/R+H group were decreased significantly. Ischemia/reperfusion injury affected sensorimotor function. Pole test, Cylinder test and Foot fault test of I/R+H group were relieved significantly compared with I/R group (P<0.05,n=6). TTC staining showed that infarct volumes in I/R group were 31.44%±5.44% at 24 h and 23.44%±7.95% at 7 d, infarct volumes were decreased in I/R+H group (24 h:17.19%±3.23%,7 d:13.26%±2.71%) (P<0.05,n=6). Western blotting showed cPKCγmembrane translocation levels of ischemic core and peri-infarct regions in MCAO mice cortex were decreased significantly after ischemia for 1 h and reperfusion. Herkinorin alleviated the decrease of cPKCγ membrane translocation levels in cortex peri-infarct region (P<0.05,n=6). Conclusion 10 mg/kg Herkinorin could decrease neurobehavioral score, alleviate Pole test, Cylinder test and Foot fault test evaluation, decrease infarct volumes in MCAO mice. cPKCγ membrane translocation in cortex peri-infarct region may participate molecular mechanism of Herkinorin induced neuroprotection.

Herkinorin; postconditioning; ischemia/reperfusion; neuroprotection; protein kinases C

國家自然科學基金(81301065)，北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助計劃(D003034000031)，首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院科研骨干培育基金(2014-YJJ-GGL-044)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81301065)，Talent Training Plan of Beijing(D003034000031)，Training Foundation of Beijing Tongren Hospital (2014-YJJ-GGL-044).

時間：2017-06-09 17∶39 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170609.1739.038.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.03.002]

R614.1

2017-03-20)

*Corresponding author， E-mail：pandedao@126.com