劉四磊，趙 允，戴絢麗，吳 平

杭州娃哈哈集團有限公司 (杭州 310018)

高效液相色譜法測定八寶粥罐頭中乙二胺四乙酸二鈉含量的不確定度評定

劉四磊，趙 允，戴絢麗，吳 平

杭州娃哈哈集團有限公司 (杭州 310018)

根據(jù)JJF1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的原理與方法，建立了高效液相色譜法測定八寶粥罐頭食品中乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)含量的測量不確定度評定的數(shù)學模型。對數(shù)學模型中各不確定度分量的來源進行分析、量化和合成。當取樣量為2.0 g時，其測定的乙二胺四乙酸二鈉含量為(162.600±3.578) mg/L。最終結果的不確定度主要由標準溶液、樣品處理過程中回收率及標準曲線的建立引起。整體評定方法清晰合理，簡便準確，可為實驗室在該檢測過程中進一步提高檢測數(shù)據(jù)的可靠性和一致性作參考。

乙二胺四乙酸二鈉；不確定度；液相色譜；八寶粥罐頭

乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)具有很高的穩(wěn)定常數(shù)，能夠與絕大多數(shù)金屬離子在微劑量下發(fā)生絡合反應形成穩(wěn)定的化合物，能消除金屬離子或由金屬離子誘導產(chǎn)生的破壞食品感官性能的影響[1]。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定其作為穩(wěn)定劑、凝固劑、抗氧化劑、防腐劑，允許使用于果醬，果脯、腌制蔬菜、罐頭、飲料等9類食品中[2]。利用EDTA-2Na較強的絡合作用，可有效阻止或延緩食品褪色、氧化、變質，與防腐劑能表現(xiàn)出理想的協(xié)同作用，具有良好的抗菌活性[3]。然而過多的攝入EDTA-2Na會導致人體微量元素的損失，從而誘發(fā)一系列的疾病，因此，國內外對EDTA-2Na制定了嚴格的限量要求，每日允許攝入量為0～205 mg/kg。我國在雜糧罐頭食品中規(guī)定其最大使用量不得超過250 mg/kg[2]。

目前，國內外關于食品中EDTA-2Na的檢測方法有很多，主要有反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)[4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7]、毛細管電泳法[8]、液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS)[9]。其中HPLC法檢測過程中較多文獻采用CuCl2作為衍生化試劑，但和EDTA-2Na絡合后產(chǎn)物并不穩(wěn)定，尤其是對樣品基質干擾較大的罐頭類食品，當基質中含有Fe3+時檢測結果將不準確，難以滿足限量要求[10]。因此，有必要研究復雜基質類食品中EDTA-2Na的檢測方法，來滿足食品添加劑中規(guī)定的限量要求。

不確定度是指由于測量誤差的存在，造成測量值不能被確定的程度，是衡量測量結果質量可靠性和準確性的重要參數(shù)[11]。通過對不確定度的評定，一方面可以給出測量結果的可信程度，另一方面，可以使測量結果在國際和國內不同檢測機構間進行量值比對和實驗室間數(shù)據(jù)共享。GB/T 27025—2008《檢測和校準實驗室能力的通用要求》指出，當檢測結果處于標準要求的臨界值，有可能判定被檢產(chǎn)品不合格時，應給出測量不確定度。目前，有關食品中EDTA-2Na的測量不確定度評定，國內外未見相關報道。本文根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》要求，通過分析檢測過程中影響檢測結果穩(wěn)定性的主要影響因素，評定測定過程中不確定度的來源，建立了HPLC測定八寶粥罐頭食品中EDTA-2Na含量的不確定度評定方法。旨在為食品企業(yè)測定EDTA-2Na含量進行質量控制提供理論基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純)，德國Merck 公司；10%四丁基氫氧化銨(分析純)，上海展云化工；三氯化鐵(分析純)，天津科密歐化學試劑；EDTA-2Na標準品(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；磷酸(分析純)，南京奧佳化工。

1.2 儀器與設備

Waters HPLC(配有四元泵、柱溫箱、自動進樣器、可變波長紫外檢測器及Empower 3化學工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國Waters公司；Beckman Avanti J-26XP 高速冷凍離心機，美國Beckman；Milli-Q Advantage A10超純水機，美國密理博公司；Sartorius電子天平(CP225D)，德國賽多利斯公司；IKA T25組織搗碎機，德國IKA公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：稱取1.15 g磷酸二氫銨，加水溶解至900 mL，加入8 mL 10%四丁基氫氧化銨溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾后加100 mL的乙腈，用磷酸調pH至2.42；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

1.4 試劑與標準溶液配制

EDTA-2Na標準溶液：準確 0.1 gEDTA-2Na固體標準品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，此溶液轉移至儲液瓶中4 ℃下儲存。

EDTA-2Na標準系列溶液：分別吸取 50、100、200、400、800、1000 μL的EDTA-2Na標準溶液于10 mL 容量瓶中，加入1 mL濃度為0.02 mol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，于超聲條件下超聲20 min，冷卻至室溫后，用水定容至刻度，充分混合均勻后，過0.45 μm濾膜，供上機檢測。

1.5 樣品前處理

準確稱取2.0 g左右經(jīng)均質器粉碎混勻的八寶粥罐頭樣品，加4 mL水稀釋后加入1 mL濃度為0.02 mol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，于超聲條件下超聲20 min，冷卻至室溫后，用水定容至刻度，充分混合均勻后，以8 000 r/min離心5 min，過0.45 μm濾膜，供上機檢測。

2 結果與討論

2.1 數(shù)學模型的建立

本實驗中，八寶粥罐頭中EDTA-2Na含量的測量數(shù)學模型：

式中：X為樣品中EDTA-2Na的含量，mg/kg；A為樣液中EDTA-2Na衍生物的峰面積；C為標準工作液中EDTA-2Na衍生物的濃度，mg/L；V為樣液最終定容體積，mL；f為回收率校準因子；As為標準工作液中EDTA-2Na衍生物的峰面積；m為試樣稱樣量，g。

依照以上數(shù)學模型，本測量結果的不確定度主要來源有：配制EDTA-2Na標準溶液引入的不確定度ur(x1)、樣品稱量產(chǎn)生的不確定度ur(x2)、樣品定容體積引入的不確定度ur(x3)、樣品重復測定產(chǎn)生的不確定度ur(x4)、樣品處理過程中回收率引入的不確定度ur(x5)和最小二乘法擬合標準曲線求樣品質量濃度所引入的不確定度ur(x6)。

2.2 各不確定度分量的評定

2.2.1 配制EDTA-2Na標準溶液產(chǎn)生的相對不確定度ur(x1)

2.2.1.1EDTA-2Na標準物質引入的不確定度ur(x1.1)

2.2.1.2 EDTA-2Na標準物質稱量引入的相對不確定度ur(x1.2)

2.2.1.3 EDTA-2Na標準工作溶液配制過程中器量校準引起的相對標準不確定度ur(x1.3)

因此，EDTA-2Na標準工作溶液配制過程中器量校準引起的相對標準不確定度：

因此，EDTA-2Na標準物質配制引入的不確定度ur(x1)為：

2.2.2 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度ur(x2)

2.2.3 樣品定容體積引入的不確定度ur(x3)

樣品最終定容體積使用10mL容量瓶，其所引入的相對標準不確定度為：

2.2.4 樣品重復測定產(chǎn)生的不確定度ur(x4)

重復性測定不確定度主要是由實驗操作人員技能水平、檢測儀器的分辨率和穩(wěn)定性、樣品的混合均勻程度等因素引起的。按上述實驗方法平行測定樣品6次，測定結果及計算數(shù)據(jù)見表1。

表1 樣品重復測量結果

2.2.5 樣品處理過程中回收率引入的不確定度ur(x5)

回收率可以用來確定樣品處理方法、分析方法等產(chǎn)生的偏差。本實驗通過加標回收率來進行不確定度的評定。分別完成0.8、1.0、1.2倍的目標物含量3個水平的添加，每個添加水平做2個重復，計算回收率?；厥章史秶?97.3%～100.67%，平均回收率為 98.51%，見表2。

表2 樣品回收率測定值

標準不確定度采用平均值的標準偏差，標準不確定度和相對標準不確定度分別為：

同時，必須對平均回收率進行顯著性檢驗，以確定回收率校正因子f是否在計算公式中采用[14]。t檢驗是用t分布理論來推論差異發(fā)生的概率，從而比較兩個平均數(shù)的差異是否顯著。本實驗用t-檢驗確定加標平均回收率與100%有無顯著性差異，設顯著水平為α=0.05，t1-0.05(n-1)=1.943(n=6)，則，

由于平均回收率與100%差異顯著，因此必須考慮回收率引入的不確定度。

2.2.6 最小二乘法擬合標準曲線求樣品濃度產(chǎn)生的相對標準不確定度ur(x6)

測定過程中采用了1 000mg/L的標準儲備液配制了6種濃度(5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L)的標準溶液，分別上機測定3次，得到相應的峰面積，檢測結果見表3。根據(jù)檢測結果，采用最小二乘法擬合，得出標準工作曲線的線性回歸方程為y=3 269x-29 207，斜率b和截距a分別23 269和-29 207，相關系數(shù)R2=0.999 8。

標準曲線引入的標準不確定度由下式求得:

則EDTA-2Na標準曲線擬合引入的相對不確定度：

2.2.7 計算合成不確定度和擴展不確定度

2.2.8 測量不確定度報告

因此，依據(jù)本文所建立的方法，所測定的八寶粥罐頭樣品中EDTA-2Na的含量檢測結果為：(162.600±3.578)mg/L。

2.2.9 不確定度的分析

將各不確定度分量值按比例繪成圖1，可以看出，標準溶液配制引入的不確定度最大，其次是樣品處理過程中回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標準曲線求樣品質量濃度所引入的不確定度。由于樣品稱量引入的不確定度極小，因此可忽略不計。

圖1 測量不確定度分量分布示意圖

3 結論

采用本文建立的方法，當取樣量為2 g時，k=2(95%置信度)，所測定的八寶粥罐頭中EDTA-2Na的含量檢測結果為：(162.600±3.578) mg/L。

測定過程中不確定度分析表明，標準溶液配制過程引入的不確定度最大，其次是樣品處理過程中回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標準曲線求樣品質量濃度所引入的不確定度。因此，在檢測過程中要按規(guī)范配制標準溶液，盡可能保證標準溶液配制的準確性和實驗結果的穩(wěn)定性，盡可能的減少測量結果誤差，來降低不確定度。本研究對八寶粥罐頭食品中EDTA-2Na檢測不確定度進行評定，為HPLC法測定食品中EDTA-2Na含量的質量控制提供了理論依據(jù)。

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Uncertainty evaluation for the determination of ethylenediamine tetraacetic acid disodium saltin in canned eight-ingredient porridge by HPLC

Liu Silei, Zhao Yun, Dai Xuanli, Wu Ping

Hangzhou Wahaha Group Company Limited (Hangzhou 310018)

Based on JJF1059.1—2012 “EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement”, a mathematical model was established to assess the uncertainty of analyzing ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) in canned eight-ingredient porridge by high performance liquid chromatography (HPLC). Factors contributing to the uncertainty were analyzed, quantified and synthesized. The expanded uncertainty of EDTA-2Na determination for 2.0 g of samples was 3.578 mg/L. The results show that the uncertainty of measurement is mainly caused by the preparation of standard solution, recovery of sample during processing and the establishment of the standard curve. The evaluation method is reasonable, clear, simple, accurate, and references for the reliability and consistency of the laboratory testing data．

ethylenediamine tetraacetic acid disodium (EDTA-2Na); uncertainty; high performance liquid chromatography (HPLC); canned eight-ingredient porridge

2017-02-09

劉四磊，男，1987年出生，碩士研究生，工程師，研究方向為食品質量檢測與安全控制。

TS297

A

1672-5026(2017)03-065-06