杜迎春++時曉++陳春山++李博++劉寧

摘 要 采用PCR-SSCP（聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性）方法直接提取細菌DNA進行分子生物學(xué)檢測，通過擴增細菌16S rDNA的V3區(qū)保守序列，擴增產(chǎn)物變性后，進行SSCP分析，建立殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的SSCP特異性圖譜。該方法可快速準確地檢測出養(yǎng)殖水體及病魚體上的致病菌，在生產(chǎn)實踐上有重要意義。

關(guān)鍵詞 PCR-SSCP；殺鮭氣單胞菌；嗜水氣單胞菌；溫和氣單胞菌

中圖分類號：S941 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.06.051

細鱗魚又稱細鱗鮭，屬鮭形目、鮭科、細鱗魚屬，該魚在中國僅1屬1種，是一種名貴的鮭科陸封型冷水魚。在細鱗魚的馴養(yǎng)繁育過程中，各種疫病成為制約其發(fā)展的瓶頸問題，其中，氣單胞菌是引起魚類疾病的重要病原菌。

殺鮭氣單胞菌主要是鮭、鱒魚的病原菌，但近年來也有感染大菱鲆、鰈等其他魚類的報道；嗜水氣單胞菌在水體中廣泛存在，可引起魚類及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的多種病害。溫和氣單胞菌也能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染發(fā)病，且大多情況下是多種細菌混合感染。

傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法雖較為經(jīng)典，使用廣泛，但操作繁瑣，周期較長，而水生動物致病菌多為條件性致病菌，快速準確地檢測出致病菌對于病原的確定及診治尤為重要。本研究就是利用分子生物學(xué)的方法，建立殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的PCR-SSCP快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗魚是北京市水生野生動植物救護中心馴養(yǎng)繁育的細鱗魚。

1.1.2 試劑儀器

普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；2× Es Taq Master Mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自北京康為世紀公司；DL2000 DNA Marker，購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

病魚鰓蓋、鰭基及魚體兩側(cè)出血、充血，嚴重的病魚體表充血甚至出血（如見圖1所示）。腹腔內(nèi)有淡黃色透明或紅色渾濁腹水。無菌采取患病細鱗魚病灶、肝臟、脾臟、腸等器官，用接種環(huán)劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂上。挑取單個典型菌落接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，25 ℃過夜培養(yǎng)。

圖1 患病細鱗魚

1.2.2 病原菌PCR擴增

取分離培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)物，提取基因組DNA。用提取的DNA作為模板，擴增細菌16S rRNA V3區(qū)保守序列基因?；驍U增通用引物27F和1492R，引物序列如下。

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；

1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

PCR 擴增反應(yīng)體系為25 μL：上游引物1 μL，下游引物1 μL，2× Es Taq Master Mix：12.5 μL，模板1 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性

5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，PCR產(chǎn)物純化回收后，由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.3 病菌SSCP圖譜建立

將PCR產(chǎn)物98 ℃變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子。變性產(chǎn)物利用10% PAGE膠電泳。通過放射性自顯影、銀染、溴化乙錠分析SSCP電泳圖譜。

2 結(jié)果

2.1 細菌培養(yǎng)

嗜水氣單胞菌在普通營養(yǎng)瓊脂上，長成圓形光滑、邊緣整齊、隆起、半透明或不透明、灰白色的菌落。殺鮭氣單胞菌在普通營養(yǎng)瓊脂上24 h生長成菌落直徑0.3～0.4 mm灰白色、較不透明、隆起、邊緣整齊的菌落。

2.2 PCR擴增

PCR擴增得到171 bp目的條帶。將擴增產(chǎn)物進行純化回收后，送華大公司測序。將測序序列提交NCBI進行BLAST比對分析，確定目的基因片段分別是殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌。

2.3 SSCP

PCR變性產(chǎn)物經(jīng)多次重復(fù)電泳后，確定每種細菌圖譜的特異性、重復(fù)性及準確性。殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單細胞菌的SSCP圖譜見圖3，建立了特異性PCR-SSCP快速檢測方法。

3 討論

氣單胞菌引發(fā)的疫病是細鱗魚人工養(yǎng)殖中的高發(fā)疫病，其中嗜水氣單胞菌、溫和氣單細胞菌、殺鮭氣單胞菌等氣單細胞菌引起的疫病最為常見，危害也最為嚴重，一旦發(fā)病常常會帶來毀滅性損失。因此建立氣單胞菌病源的快速檢測方法，對于疫病的早期防控和治療尤為重要。而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生理生化等基礎(chǔ)檢測手段，由于靈敏度低、特異性差、費時耗工，已不適應(yīng)當前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對疫病早期防控及時治療的需要。本研究采用SSCP方法直接提取細菌DNA進行分子生物學(xué)檢測，通過擴增細菌16S rDNA的V3區(qū)保守序列，進行變性電泳后，建立3種氣單胞菌的特異性SSCP圖譜，可用于病源的快速檢測分析。PCR-SSCP快速檢測方法的建立，可將病源的檢測時間控制在2 d以內(nèi)，重復(fù)率可達到95%以上，準確率可達到90%以上，該方法所需儀器簡單、操作方便、適宜在普通實驗室推廣應(yīng)用。

（責任編輯：劉昀）