□ 高光普 本刊記者

諾如病毒分析檢測方法

□ 高光普 本刊記者

諾如病毒感染性腹瀉是在全世界范圍內(nèi)的流行疾病，全年均可發(fā)生感染，感染對象主要是成人和學(xué)齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)狀態(tài)。諾如病毒感染性強(qiáng)，近些年國內(nèi)外也爆發(fā)過多次由諾如病毒引起的病毒感染事件。為了讓大家更好地了解諾如病毒，北京良潤生物科技有限公司總經(jīng)理劉磊老師來到了食安大講堂，向觀眾分享了他多年來從事諾如病毒研究的相關(guān)認(rèn)知。

諾如病毒感染事件

近年來，國內(nèi)爆發(fā)了多次諾如病毒感染事件：2010年12月，廣州從化有429人發(fā)病，調(diào)查后最終確認(rèn)是由水污染引起的諾如病毒感染；2013年4月，揭陽市某學(xué)院有近400人患感染性腹瀉，經(jīng)當(dāng)?shù)丶部刂行幕炁袛?，主要是諾如病毒傳播引起的；2014年2月，嘉興市有400多名學(xué)生感染就醫(yī)，累計報告發(fā)病人數(shù)511人；2014年12月，廣州越秀區(qū)某小學(xué)21人發(fā)病，波及217人；2015年1月深圳有140名發(fā)病，經(jīng)檢測已確定引發(fā)此癥狀的原因系諾如病毒；2016年3月，北京市衛(wèi)計委公布數(shù)據(jù)顯示，2016年1~2月，北京市報告了31起急性胃腸炎聚集性疫情，其中有28起是由諾如病毒引發(fā)。以上每次事件波及的人數(shù)眾多，對我國人民的生命財產(chǎn)安全造成了很大損失。

諾如病毒檢測方法

Avidin Immunoassy）以及酶聯(lián)免疫法（ELISA）。RIA的靈敏度要比IEM高10~100倍，但需要使用放射元素進(jìn)行標(biāo)記，且時間較長（6d）；Biotin-Avidin Immunoassy是美國疾病預(yù)防控制中心基于RIA建立的簡化方法，靈敏度與RIA相近；ELISA具有靈敏度高、耗時少、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，便于廣泛推廣，但株型特異性太強(qiáng)，應(yīng)用范圍較狹窄。

諾如病毒（Norovirus，NoV），又稱諾瓦克病毒，是一組形態(tài)類似、抗原略有不同的病毒顆粒?？筛腥救嘶騽游?，引發(fā)急性腸胃炎、冬季嘔吐性疾病、胃腸性流感等病癥，主要臨床表現(xiàn)為頭痛、發(fā)熱、惡心、腹痛腹瀉等，是非細(xì)菌性胃腸炎的主要病原體之一。隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，對于諾如病毒的檢測也出現(xiàn)了越來越多的方法，其中代表性的方法有電鏡法、免疫法、RT-PCR 3種（對比見表1）。

諾如病毒最初是通過電鏡檢測發(fā)現(xiàn)的，因此最初的諾如病毒診斷方法主要是電鏡法（EM）與免疫電鏡法（IEM）。通過電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)來確認(rèn)諾如病毒，需要的病毒濃度較高，因此靈敏度與特異性相對較低，并且只能夠在比較專業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)才能進(jìn)行，無法普及。

隨著人們對諾如病毒研究的不斷深入，免疫法逐漸被用來檢測諾如病毒。免疫法主要有放射免疫法（RIA）、生物素-親和素免疫法（Biotin-

表1 諾如病毒檢測方法對比

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，市場上出現(xiàn)了更加靈敏、特異、快速的核酸檢測方法，包括等溫核酸擴(kuò)增（NASBA）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、熒光染料RT-PCR、熒光探針RT-PCR、多重RT-PCR等。RT-PCR方法是目前檢測諾如病毒應(yīng)用最廣泛的方法，被稱為檢測諾如病毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。NASBA直接擴(kuò)增RNA來進(jìn)行檢測，儀器相對簡便，通過瓊脂糖凝膠電泳、印跡雜交或者熒光檢測來鑒定結(jié)果，靈敏度低于RT-PCR；RTPCR通過逆轉(zhuǎn)錄RNA模板、PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物，使用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定結(jié)果；熒光染料RT-PCR通過向RT-PCR反應(yīng)體系中添加非特異性的熒光染料，可以在反應(yīng)過程中監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的生成量，但需要做熔解曲線分析來確定反應(yīng)的特異性；熒光探針RT-PCR通過特異性的熒光探針與引物，可實時監(jiān)控反應(yīng)過程中特異性產(chǎn)物的變化，并且可以實現(xiàn)同一管中多個基因的檢測（多重），特異性較好，假陽性率低，檢測靈敏度可達(dá)10~100拷貝/反應(yīng)，可用于取代普通RT-PCR。