董建輝++徐晴++周容++盛敏++溫亮++龍小玲++樊軍++陳明

摘要：氫離子焦磷酸化酶（H+-PPase）是一類H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它以焦磷酸（PPi）水解底物，水解PPi產(chǎn)生的自由能與H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相藕聯(lián)，將細(xì)胞質(zhì)中的H+泵入液泡中，建立跨液泡膜電化學(xué)梯度，形成質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，為無機(jī)離子及其他溶質(zhì)進(jìn)出液泡提供動(dòng)力，有利于植物維持細(xì)胞離子平衡和滲透平衡，增強(qiáng)植物的抗逆性?；谇捌趯?duì)披堿草（Elymus dahuricus）H+-PPase基因EdHP1克隆的基礎(chǔ)，對(duì)其表達(dá)譜及基因功能進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，通過Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，該基因在披堿草中受干旱、低溫非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。通過對(duì)轉(zhuǎn)EdHP1基因煙草在干旱、低溫環(huán)境下的功能分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)EdHP1基因可以提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱、冷脅迫的抗性。

關(guān)鍵詞：披堿草（Elymus dahuricus）；焦磷酸化酶基因；表達(dá)分析；干旱；低溫

中圖分類號(hào)：Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）10-1963-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.041

Functional Analysis of H+-Pyrophosphatase Gene，EdHP1 of Elymus dahuricus

DONG Jian-hui1，XU Qing1，ZHOU Rong1，SHENG Min1，WEN Liang1，LONG Xiao-ling1，F(xiàn)AN Jun1，CHEN Ming2

（1.Hubei Academy of Agriculture Sciences，Wuhan 430064，China；2.Chinese Academy of Agricultural Sciences（CAAS），Beijing 100081，China）

Abstract： H（+）-pyrophosphatase （H+-PPase） is an H+ transporter and taking the pyrophosphate （PPi） as substrate for hydrolysis. The free energy that produced by hydrolysis of pyrophosphate coupled with the trans-membrane transport of the H+ is able to pump the H+ from the cytoplasm into the vacuole，and form the electro-chemical gradient across the tonoplast and the proton motive force to promote the import and export of the inorganic ions and to maintain the ion balance and osmotic potential，finally to enhance the plant tolerance to stress. Based on the H+-PPase gene（EdHP1） had been cloned from E. dahuricus in previous studies，a further analysis of this gene，which including the expression and functional analysis of this gene under various stress conditions were performed in this study. Northern-blot analysis results showed that the expression of EdHP1 was induced by different abiotic stresses such as drought and cold of E. dahuricus. The functional analyses indicated that over-expression of EdHP1 enhanced the tolerance of transgenic tobacco plants to drought and cold in comparison with wild type plants.

Key words： Elymus dahuricus； H+-PPase； expression analysis； drought； cold

焦磷酸化酶（H+-PPase）既是H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶[1]，也是以焦磷酸（pyrophosphate，PPi）為底物的水解酶。該酶普遍存在于植物和少數(shù)光合細(xì)菌中，是植物液泡膜上的組分，約占膜蛋白的1%～10%[2]，參與合成糖類、核酸和蛋白質(zhì)等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解[3]。H+-PPase水解PPi產(chǎn)生自由能與H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相耦聯(lián)，形成質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，與H+-ATPase將H+從細(xì)胞質(zhì)泵入液泡中，為離子和其他溶質(zhì)的次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)提供動(dòng)能[4]；還可以建立跨液泡膜電化學(xué)梯度，為無機(jī)離子及其他溶質(zhì)出入液泡提供驅(qū)動(dòng)力[5，6]，既可以維持細(xì)胞離子平衡和滲透平衡，又能減輕一些無機(jī)離子（如Na+和Cl-）對(duì)細(xì)胞質(zhì)的毒害；還能使液泡酸化和細(xì)胞質(zhì)堿化，有助于細(xì)胞質(zhì)中生理生化反應(yīng)的順利進(jìn)行。Davies等[7]和Obermeyer等[8]發(fā)現(xiàn)H+-PPase還參與K+向液泡內(nèi)的運(yùn)輸，用膜片鉗手段分別檢測(cè)甜菜（Beta vulgaris）和東亞市藜（Chenopodium rubrum） H+-PPase，結(jié)果表明，H+-PPase可能作為H+/K+共向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，介導(dǎo)K+向液泡內(nèi)的運(yùn)輸，其耦聯(lián)比為1.3H+/1.7K+/1PPi。但這種運(yùn)輸是否是主動(dòng)運(yùn)輸目前還尚有爭(zhēng)議，有些學(xué)者在H+-PPase蛋白重組和42K+示蹤試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)K+的運(yùn)輸過程[9]，Ros等[10]用熒光探針法也沒有檢測(cè)到H+-PPase對(duì)K+的主動(dòng)運(yùn)輸。Li等[11]發(fā)現(xiàn)擬南芥（Arabidopsis thaliana）H+-PPase（AVP1）除了酸化液泡外，還控制植物生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，進(jìn)而影響依賴生長(zhǎng)素的各種發(fā)育過程。AVP1的過量表達(dá)導(dǎo)致植物器官形成時(shí)的細(xì)胞分裂、增生以及生長(zhǎng)素運(yùn)輸加快；相反，avp1-1突變體的根和地上部分發(fā)育都受到削弱，生長(zhǎng)素運(yùn)輸也變慢，其原因是AVP1基因的表達(dá)會(huì)影響與生長(zhǎng)素分布有關(guān)的兩種蛋白（三磷酸腺苷酶和生長(zhǎng)素外流介體PIN1）的分布和數(shù)量。AVP1作用的結(jié)果使生長(zhǎng)素外流變得更加容易，從而促進(jìn)根系發(fā)育和植株地上部分的生長(zhǎng)。目前，從綠藻、擬南芥、大麥[12]等植物中克隆到了H+-PPase基因，功能分析表明，H+-PPase基因的過量表達(dá)可以增加轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽及抗旱性[12]。

披堿草（Elymus dahuricus）是禾本科披堿草屬多年生優(yōu)質(zhì)牧草，須根發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿能力。前期從披堿草中克隆了H+-PPase基因EdHP1[13]，并且構(gòu)建了植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)該基因的表達(dá)模式及其在抗逆性方面進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，EdHP1基因的表達(dá)受干旱、低溫的誘導(dǎo)，過表達(dá)EdHP1基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱、低溫脅迫等逆境的抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 披堿草種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。將披堿草種子4 ℃春化3 d，然后播種在花盆中，取生長(zhǎng)3周后的苗子分別進(jìn)行干旱、ABA（200 μmo1/L）和4 ℃冷處理，處理時(shí)間分別為1、2、5、12、24 h，將處理后的苗子在液氮中冷凍后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌種、載體及試劑 表達(dá)載體pBI121、E. coli菌株DH5α和亞細(xì)胞定位載體163hGFP均為實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T Vector和小量膠回收試劑盒（Gel Extraction Mini Kit）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 EdHPI基因克隆及生物信息學(xué)分析 依據(jù)EdHPI基因cDNA序列的5′端和3′端設(shè)計(jì)引物：EdHPI-R：5′GCTAGGTCTTGACCCTTTCCGATGGC 3′；EdHPI-L：5′GTTACTATGCAAGGTGAAGGAGGTAG3′。提取披堿草RNA，并進(jìn)行純化后備用。利用DNAMAN序列分析軟件和TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk）對(duì)EdHPI甚因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

1）電泳。電泳及轉(zhuǎn)膜用具0.1 mmol/L NaOH浸置過夜，然后用滅菌的0.1%DEPC水沖洗備用。在DEPC水處理過的配膠瓶中加入適量瓊脂糖（1.2%的瓊脂糖），加熱溶解瓊脂糖，冷卻到55 ℃，加入10×MOPS和甲醛，倒膠備用。將50 μL濃度為20 μg/μL的RNA 55 ℃水浴15 min后，置于在冰上，加入10 μL 5×RNA Loading Buffer，點(diǎn)樣。4～5 V/cm電泳，直到溴酚藍(lán)指示劑移出約8 cm，用滅過菌的10×SSC輕輕晃搖15 min去甲醛。

2）轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜過夜后，卸下轉(zhuǎn)膜裝置，用鉛筆標(biāo)記膜號(hào)及點(diǎn)樣順序，紫外交聯(lián)3 min。

3）探針的制備及標(biāo)記。根據(jù)RT-PCR引物（Primer-F：5′GCTATTGCAAGTAGTCTCCGATTAGG 3′；Primer-R：5′CATCATGATTCTGTCTGCTCCATGCTC3′）。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增基因片段做探針。探針的標(biāo)記使用Random Primer DNA Labeling Kit。

4）雜交。將雜交膜先放在水中預(yù)濕，將膜卷成筒狀，RNA面朝里，避免膜重疊用紗布隔開，放入雜交管中；在雜交管中倒入少量的預(yù)雜交液，沿一定方向轉(zhuǎn)動(dòng)雜交管；倒掉預(yù)雜交液再加管預(yù)雜交液，65 ℃預(yù)雜交30 min；加入標(biāo)記好的變性探針65 ℃雜交過夜。然后將雜交膜用洗液Ⅰ（2×SSC/0.1%SDS）和洗液Ⅱ洗后放入磷屏中壓4～5 d，把雜交膜放在沸騰的0.1%SDS溶液里面10 min，再放到2×SSC溶液中，探測(cè)同位素信號(hào)直到探測(cè)不到信號(hào)為止。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將pBI121載體用BamHⅠ、SacⅠ進(jìn)行雙酶切，切除GUS基因，插入兩端引入BamHⅠ、SacⅠ酶切位點(diǎn)的EdHP1基因，獲得植物表達(dá)載體，并將該載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（C58C1）。

1.2.4 EdHP1基因的煙草轉(zhuǎn)化 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草[14]。

1.2.5 轉(zhuǎn)EdHP1基因煙草的抗旱、耐低溫能力分析

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的未轉(zhuǎn)基因煙草植株（Wt）和T0代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系（EdHP1）進(jìn)行無性繁殖，剪成多段帶有葉芽沒有根的莖稈插MS+2%PEG（干旱處理）的培養(yǎng)基上進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是25 ℃，光照培養(yǎng)16 h/暗培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)4周后觀察植株根及地上部分生長(zhǎng)情況。冷處理為生長(zhǎng)兩周左右的未轉(zhuǎn)基因煙草（Wt）和轉(zhuǎn)基因株系（EdHP1）在-4 ℃處理12 h后，轉(zhuǎn)入正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)培養(yǎng)1周，觀察生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行基因的表達(dá)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EdHP1基因生物信息學(xué)分析

EdHP1基因的開放性閱讀框共有2 310 bp，編碼氨基酸770個(gè)（圖1A），蛋白分子質(zhì)量是80.05 ku，等電點(diǎn)為4.89。在TMHMM網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)EdHP1含有14個(gè)跨膜區(qū)（圖1B），并包含3個(gè)保守區(qū)：CS1（226-353 aa）、CS2（452-503 aa）和CS3（659-765 aa），其中CS1中的DVGADLVGKVE 氨基酸序列（圖1A）可能對(duì)EdHP1的催化起關(guān)鍵作用，表明其是一個(gè)典型的跨膜蛋白。

將EdHP1基因與其他高等植物的H+-PPase基因?qū)Ρ确治霭l(fā)現(xiàn)，核苷酸和氨基酸序列具有很高的同源性，跨膜區(qū)的保守性更高。利用DNAMAN軟件對(duì)EdHP1全長(zhǎng)氨基酸序列開展進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，EdHP1與大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、擬南芥（A. thaliana）、甜菜（B. vulgaris）、綠豆（Vigna radiata）、小麥（Triticum aestivum）、西洋梨（Pyrus communis）、苜蓿（Medicago truncatula）、巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）的H+-PPase同源性都是86%以上，特別與大麥的H+-PPase同源性更是高達(dá)98%。與原生動(dòng)物（Protozoa）、海藻類（Marine alga）的同源性只有40%（未列出），這說明H+-PPase在高等植物中具有很高的同源性（圖2）。

2.2 EdHP1基因的Northern blot分析

取不同脅迫條件下處理的披堿草材料，提取總RNA，進(jìn)行Northern blot分析，用EdHP1基因?yàn)樘结樳M(jìn)行雜交。結(jié)果（圖3）表明，EdHP1在高鹽和干旱條件下有明顯誘導(dǎo)，從1 h開始逐漸增強(qiáng)，在24 h達(dá)到最大。在低溫脅迫條件下，EdHP1表達(dá)先增強(qiáng)后減弱，5 h表達(dá)量最高，12 h表達(dá)量下降。在ABA處理?xiàng)l件下沒有響應(yīng)。

2.3 EdHP1轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性功能分析

2.3.1 EdHP1轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性分析 在MS+2%PEG的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，未轉(zhuǎn)基因煙草（Wt）地上和地下部分生長(zhǎng)都受到了嚴(yán)重的抑制，而轉(zhuǎn)基因株系（EdHP1）形成了一定數(shù)目的根，且莖和葉的發(fā)育也明顯優(yōu)于Wt（圖4B）。處理之前Wt和轉(zhuǎn)基因株系地上部分的平均長(zhǎng)度分別為1.2 cm和1.1 cm（圖4C），處理之后轉(zhuǎn)基因株系地上部分的平均長(zhǎng)度（4.5 cm）明顯比Wt（1.5 cm）長(zhǎng)（P<0.01）（圖4D），處理之后轉(zhuǎn)基因株系地下部分的平均長(zhǎng)度（5.5 cm）也明顯比Wt（0.1 cm）長(zhǎng)（P<0.01）（圖4E）。為了進(jìn)一步確定EdHP1基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性的關(guān)系，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中該基因的表達(dá)進(jìn)行了RT-PCR分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中EdHP1基因表達(dá)而在未轉(zhuǎn)基因煙草中沒有EdHP1基因的表達(dá)（圖4G）；對(duì)煙草中的H+-PPase活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草（EdHP1）是未轉(zhuǎn)基因煙草（Wt）的2倍以上（圖4F），這說明由于EdHP1基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性。

2.3.2 EdHP1轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力分析 生長(zhǎng)兩周左右的未轉(zhuǎn)基因煙草（Wt）和轉(zhuǎn)基因株系（EdHP1）在-4 ℃處理12 h后，轉(zhuǎn)入正常生長(zhǎng)條件下恢復(fù)培養(yǎng)過程中，Wt的莖葉逐漸失綠，最終枯死（圖5B），而轉(zhuǎn)基因株系植株沒有受到明顯的影響，生長(zhǎng)恢復(fù)（圖5B）。RT-PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中EdHP1基因表達(dá)，而在Wt中則沒有EdHP1基因的表達(dá)（圖5C）。這說明由于EdHP1基因的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力。

3 討論

H+-PPase具有質(zhì)子泵的功能，可以分解PPi為離子的運(yùn)輸和一些次級(jí)代謝提供能量，在這方面和ATP具有類似的功能，在逆境下H+-PPase還可以提高ATP的活性。目前，H+-PPase基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)方式也有不同看法，Yoshida等[15]報(bào)道綠豆苗H+-PPase在低于10 ℃的溫度下，H+-PPase質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低。但在檢測(cè)2 ℃處理的綠豆懸浮細(xì)胞H+-PPase活性后認(rèn)為，冷處理期間H+-PPase較為穩(wěn)定，48 h以內(nèi)沒有表現(xiàn)出明顯受抑制現(xiàn)象，甚至在處理的最初12 h內(nèi)還稍有促進(jìn)。Carystinos等[16]則發(fā)現(xiàn)冷誘導(dǎo)H+-PPase活性大幅度上升，10 ℃冷處理6 d的水稻苗H+-PPase比活是常溫（25 ℃）下的20倍，同時(shí)免疫反應(yīng)蛋白也顯著增加，說明H+-PPase是冷誘導(dǎo)。在本試驗(yàn)中EdHP1對(duì)4 ℃處理的響應(yīng)是先升高后降低，表明EdHP1基因參與了植物對(duì)低溫的響應(yīng)。Brini等[17]將H+-PPase轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性得到明顯的提高，Park等[18]將AVP1基因轉(zhuǎn)入番茄（Lycopersicon esculentum）的一個(gè)商業(yè)栽培品種中，轉(zhuǎn)基因植株抗旱性明顯增強(qiáng)。Gao等[19]將鹽芥中的H+-PPase轉(zhuǎn)入擬南芥發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性得到明顯的提高?？梢姡琀+-PPase作為一種有效的質(zhì)子泵，在植物對(duì)水分和鹽分脅迫的響應(yīng)中可能扮演著重要的角色。EdHP1能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性和耐低溫能力，推測(cè)可能的作用機(jī)制是EdHP1影響了生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，促進(jìn)了根系和地上部分的生長(zhǎng)，從而提高了植物的抗逆性，由此可見EdHP1可以作為優(yōu)良的基因資源用于改良作物的抗逆性。

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