趙學(xué)梅，徐天嬌，董妙先＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所齊齊哈爾161006）

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清激活Nrf2/ARE信號通路對6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用＊

趙學(xué)梅1，徐天嬌2，董妙先2＊＊

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究所齊齊哈爾161006）

目的：研究鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清對6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法：應(yīng)用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量（8 g·kg-1）、中劑量（16 g·kg-1）和高劑量組（32 g·kg-1）大鼠的含藥血清或空白血清預(yù)處理PC12細(xì)胞1 h后，加100 μM 6-OHDA共孵育24 h后收集細(xì)胞。二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）熒光探針染色法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nuclear Factor-erythroid 2 Related Factor 2，Nfe2l2））基因Nfe2l2、血紅素加氧酶-1（Heme Oxygenase-1，HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（Glutamate-Cysteine Ligase Catalyticsubunit，GCLc）和調(diào)節(jié)亞基（GCLm）mRNA表達(dá)。采用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant Response Element，ARE）活性。結(jié)果：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，上調(diào)了6-OHDA處理細(xì)胞中Nfe2l2、HO-1和GCLc mRNA表達(dá)，但是對GCLm mRNA表達(dá)沒有顯著影響。結(jié)論：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清對6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)Nfe2l2 mRNA表達(dá)，使ARE激活進(jìn)一步誘導(dǎo)其下游II相解毒酶基因和抗氧化酶基因HO-1和GCLc mRNA表達(dá)有關(guān)。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯6-羥基多巴胺活性氧簇Nfe2l2抗氧化反應(yīng)元件含藥血清

帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）是以中腦黑質(zhì)多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元變性死亡為主要病理改變的運(yùn)動障礙性疾病[1]。目前黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性確切的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚。近期研究表明，PD的多種致病因素均可通過氧化應(yīng)激這一共同通路造成神經(jīng)元的損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)是PD的發(fā)病的重要機(jī)制[2，3]。因此，減輕多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激是治療PD的重要策略[4]。許多學(xué)者認(rèn)為某些PD的中草藥療法與其抗氧化作用密切相關(guān)，因而從中藥方劑中研究基于抗氧化活性的PD治療藥物具有重要意義[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PD病機(jī)為“肝腎陰虛為本，肝風(fēng)內(nèi)動為標(biāo)”[6]。中醫(yī)通過辨證與辨病相結(jié)合治療PD取得了顯著療效[7]。本課題組前期在附子湯灌胃聯(lián)合6-OHDA單側(cè)損毀黑質(zhì)法復(fù)制的PD肝陽上亢型大鼠模型上發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯具有顯著改善PD模型動物行為的作用[8]，但其機(jī)制尚不清楚。本研究旨在驗(yàn)證“鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯激活Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)是其抑制PD相關(guān)神經(jīng)毒素致神經(jīng)元氧化應(yīng)激的重要機(jī)制”的假說。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑

Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀（美國Agilent公司）；Safire2全波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

OXiSelect?細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測試劑盒（美國Cell Biolabs公司，批號：59342027）；Dual-Glo?熒光素酶檢測系統(tǒng)（美國Promega公司，批號：0000077661）；Fu-GENE?6轉(zhuǎn)染試劑（Promega公司，批號：0000095764）；PRL-TK Vector（美國Promega公司，批號：0000078004）；PGL4.37[LUC2P/ARE/Hygro]vector（美國Promega公司，批號：0000125536）；TRLzol Reagent（美國Ambion公司，批號：87804）；untra SYBR Mixture（with Rox）Kit（北京康為世紀(jì)公司，批號：00151503）；Prime Script?RT reagent kit（日本TaKaRa Bio株式會社，批號：BK4001）。Nfe2l2上游引物5′-TGC CCC TGG AAG TGT CAA A-3′，下游引物5′-GGC TGT ACT GTA TCC CCA GAA GA-3′；HO-1上游引物5′-TGC TCG CAT GAA CAC TCT G-3′，下游引物5′-TCC TCT GTC AGC AGT GCC T-3；GCLc上游引物5′-GGC AAG ATA CCT TTA TGA CCA GTT-3′，下游引物5′-TGC AGC ACT CAA AGC CAT AA 3′；GCLm上游引物5′-AGA CAA AAC ACA GTT GGA GCA G-3′，下游引物5′CAG TCA AAT CTG GTG GCA TC-3′；GAPDH上游引物5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′，下游引物5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，體重220-240 g，由維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供，用于含藥血清和空白血清的制備。

1.1.3 藥物

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯由懷牛膝（批號：130501）：代赭石（批號：30301）：天冬（批號：13110）：生龍骨（批號：130501）∶生白芍（批號：130401）∶生龜板（批號：140701）∶生牡蠣（批號：140701）∶元參（批號：130601）∶茵陳（批號：130201）∶川楝子（批號：140301）∶生麥芽（批號：130501）∶甘草（批號：130601）比例為60∶60∶30∶30∶30∶30∶30∶30∶12∶12∶12∶9，煎煮2次后將藥液合并濃縮，中藥飲片均購自哈爾濱市盛泰中藥飲片加工廠；6-OHDA（Santa Cruz公司，批號：#D2312）。

1.1.4 含藥血清制備[9]

大鼠隨機(jī)分為空白對照組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低（8 g·kg-1）、中（16 g·kg-1）和高劑量組（32 g·kg-1），每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組大鼠連續(xù)7天灌胃給藥，每天2次；空白血清對照組則給予等體積生理鹽水。大鼠末次給藥1h后經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，3 500 r·min-1離心15 min，收集血清，同組大鼠的血清混合。血清在56℃水浴滅活30 min，0.22 μm millex?GP針頭式過濾器除菌分裝，-20℃凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

PC12細(xì)胞藥物處理24 h后收集細(xì)胞，按照OXiSelect?細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測試劑盒的操作說明，用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，利用熒光酶標(biāo)儀在480 nm激發(fā)波長和530 nm發(fā)射波長下測定DCF的熒光值。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測ARE活性

將PRL-TK Vector和PGL4.37[LUC2P/ARE/Hygro] vector用FuGENE?6轉(zhuǎn)染實(shí)際共轉(zhuǎn)染于PC12細(xì)胞中，24 h后加入10%的鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清或空白血清1 h后，加100 μM 6-OHDA共孵育24 h，用檢測試劑盒Dual-Glo?熒光素酶檢測系統(tǒng)，按照說明書利用全自動酶標(biāo)儀進(jìn)行螢火蟲熒光和海腎熒光檢測，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后熒光素酶的活性。

1.2.3 Real-time PCR檢測Nfe2l2、HO-1、GCLc和GCLmmRNA表達(dá)

PC12細(xì)胞藥物處理24 h后，收集細(xì)胞。采用TRIZOL方法提取總RNA，采用SYBR法按照untra SYBR Mixture（with Rox）Kit說明書在Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用xˉ±s表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激

DCFH-DA熒光探針染色法檢測結(jié)果顯示：與空白血清對照組比較，模型組ROS水平顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清組ROS水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（圖1）。

圖1 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細(xì)胞中ROS水平的影響

2.2 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清上調(diào)了6-OHDA處理的PC12細(xì)胞中Nfe2l2mRNA表達(dá)和ARE轉(zhuǎn)錄活性

實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示：6-OHDA對PC12細(xì)胞Nfe2l2 mRNA表達(dá)無顯著影響，而10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清呈劑量依賴性地上調(diào)了PC12細(xì)胞Nfe2l2 mRNA表達(dá)（P＜0.05）（圖2A）。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示：與空白血清對照組比較，模型組ARE熒光素酶活性代償性升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，10%的低劑量、中劑量和高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清組呈劑量依賴性的增加了ARE熒光素酶的活性（P＜0.05）（圖2B）。

2.3 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)6-OHDA處理的PC12細(xì)胞中Ⅱ相解毒酶的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示：6-OHDA對PC12細(xì)胞HO-1、GCLc和GCLm mRNA表達(dá)無顯著影響，而10%的中劑量和高劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清呈劑量依賴性地上調(diào)了PC12細(xì)胞HO-1和GCLcmRNA表達(dá)（均P＜0.05），10%的低劑量鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清也上調(diào)了PC12細(xì)胞GCLc mRNA表達(dá)（P＜0.05）（圖3）。

圖2 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細(xì)胞中Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)的影響

圖3 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清對6-OHDA處理的PC12細(xì)胞HO-1、GCLc和GCLm mRNA表達(dá)的影響

3 討論

PD的發(fā)病機(jī)制可能涉及遺傳缺陷、興奮性氨基酸毒性作用、環(huán)境毒性作用、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激等因素。已有越來越多的證據(jù)提示，氧化應(yīng)激可能是PD多種致病因素的共同病理基礎(chǔ)[10]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了我們的假說，表明Nrf2-ARE抗氧化系統(tǒng)介導(dǎo)的抗氧化活性可能是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯抗PD的主要機(jī)制。

PD屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇，古代醫(yī)家多從肝、腎、風(fēng)方面治療。例如《素問》云：“腎者，作強(qiáng)之官，伎巧出焉”；《靈樞》有曰：“髓海有余，則輕勁多力，自過其度”。腎藏精生髓，腎精虧虛則腦髓失充，出現(xiàn)肢體運(yùn)動障礙。肝主筋，肝陰不足，筋脈失濡則拘急痙攣。肝腎陰虛動風(fēng)，同氣相求則震顫抖動?，F(xiàn)代多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，PD病機(jī)關(guān)鍵是肝腎陰虛，虛風(fēng)內(nèi)動。因此，滋養(yǎng)肝腎、熄風(fēng)定顫是其治療大法[11]。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯出自清代名醫(yī)張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，功用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，滋陰潛陽，是治療肝陽化風(fēng)證的經(jīng)典方。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中牛膝歸肝腎之經(jīng)，補(bǔ)益肝腎。代儲石、牡蠣和龍骨降逆潛陽，龜板、天冬、白芍和玄參滋陰潛陽。茵陳和川楝子清泄肝陽，生麥芽斂陰。臨床應(yīng)用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可改善陰虛陽亢的客觀癥狀，對PD有一定療效[12]。

許多學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激是PD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一[13]。有研究報(bào)道自由基損害對多巴胺能神經(jīng)元的變性發(fā)揮重要作用[14]。ROS作為氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，首先出現(xiàn)在線粒體中。當(dāng)ROS大量累積時(shí)就會氧化重要的細(xì)胞結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA，通過線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致PD發(fā)生發(fā)展[15]。因此，抑制ROS對阻止PD發(fā)病具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清抑制了6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，表明抗氧化作用可能是其發(fā)揮抗PD的機(jī)制之一。

Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答，是細(xì)胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者[16]。ARE是位于抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因上游調(diào)節(jié)區(qū)的一個(gè)DNA-啟動子結(jié)合序列，而Nrf2是這一序列的激活因子[17]。Nrf2通過與ARE相互作用，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，在細(xì)胞防御保護(hù)中發(fā)揮重要作用[18]。發(fā)現(xiàn)能調(diào)控Nrf2及其下游靶基因的中藥方劑，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用，是防治PD的重要策略。本研究在體外采用6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型，觀察發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯含藥血清具有激活Nrf2/ARE抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)誘導(dǎo)了Ⅱ相酶HO-1和GCLc基因的表達(dá)，從而減少了6-OHDA誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激。

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Protective Effects of Zhen-Gan Xi-Feng Decoction-containing Serum on 6-OHDA-induced Oxidative Stress in PC12 Cells through Nrf2-ARE PathwayActivation

Zhao Xuemei1,Xu Tianjiao2,Dong Miaoxian2
(1.College of Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China; 2.Institute of Medicine,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

This paper was aimed to study the protective effects and related mechanisms of Zhen-Gan Xi-Feng(ZGXF) decoction containing serum on 6-OHDA-induced oxidative stress in PC12 cells.The ZGXF decoction containing rat serum with low-,medium-,and high-dose(8,16,or 32 g·kg-1)or blank serum was used to preprocess PC12 cells for 1 h,and cultured together with 100 μM 6-OHDA for 24 h.And then,cells were collected.The fluorescent probe 2',7'-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)and fluorescence microplate reader were used to detect the level of reactive oxygen species(ROS).Real-time quantitative PCR was used to analyze the mRNA expressions of nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2),Nfe2l2,heme oxygenase-1(HO-1),glutamate-cysteine ligase catalytic subunit(GCLc),and GCL modulatory subunit(GCLm).The luciferase report gene system was used to detect the antioxidant response element (ARE)activation.The results showed that ZGXF decoction-containing serum inhibited the 6-OHDA-induced oxidative stress,upregulated the Nfe2l2,HO-1 and GCLc mRNA expressions in cells processed with 6-OHDA.However,it has no significant effect on GCLm mRNA expression.It was concluded that ZGXF decoction-containing serum had protective effects on 6-OHDA-induced oxidative stress in PC12 cells.Its mechanism may be correlated with the upregulation on Nfe2l2 mRNA expression,which activated ARE and further induced its downstream gene of phase II detoxifying enzyme, as well as the HO-1 and GCLc mRNA expressions of antioxidant enzyme gene.

Zhen-Gan Xi-Feng decoction,6-hydroxydopamine,reactive oxygen species,Nfe2l2,antioxidant response element,drug-containing serum

10.11842/wst.2017.03.017

R285.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-02-20

修回日期：2017-02-00

＊國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81373629）：基于PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的鎮(zhèn)肝熄風(fēng)法抑制帕金森病氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：董妙先。

＊＊通訊作者：董妙先，主任醫(yī)師，主要研究方向：中藥藥理學(xué)研究。