文│李永志（山東省鄒城市城郊畜牧獸醫(yī)工作站）

布魯氏菌病檢測的精細化操作

文│李永志（山東省鄒城市城郊畜牧獸醫(yī)工作站）

布魯氏菌病可以通過消化道、呼吸道、微傷皮膚或黏膜感染。生活中，養(yǎng)殖人員、屠宰人員、食用未熟透羊肉人員、畜牧獸醫(yī)工作人員中有感染者，有到養(yǎng)羊場戶串門而引起的感染者，有自家不喂羊鄰居喂羊的感染者，有放羊戶從院門前經(jīng)常經(jīng)過引起的感染者，布魯氏菌病的傳染顯得十分詭異。因此在開展畜間布病檢測工作時，操作必須精細。

一、采樣人員精細分工

1.采血人。技術要點是一針見血。采血人應按照防護程序做好個人防護，隨保定人員進入采血現(xiàn)場，找到一個人和動物都碰不到的地方，將垃圾袋掛好，垃圾袋用來盛放采血用完的針頭護套、針頭、廢棄藥棉等廢棄物。

在養(yǎng)羊場盡可能選在羊舍外的走道采血，戶主2人保定羊。牛在牛欄內(nèi)用保定繩拴系或頸夾拴系，由飼養(yǎng)員完成，2～3人保定，也可在擠奶廳護欄內(nèi)采血。

待保定好后，從接樣人手中接過藥棉，找到羊、牛的頸靜脈溝，在頸部上1/3與頸部中1/3交界處作為采血點，并對該采血點用藥棉擦拭2～3圈消毒。待采血點消毒完，棉球順手轉入右手拇指與食指之間，左手按住消毒點下端的回血端，待血管膨脹后，右手接過采血針頭，針頭平行于頸靜脈向上刺入0.5～1.0厘米，血液即可流出，接血人接入采血管。待血取出3～5毫升時，右手拔出針頭，交給接血人，左手持干棉球按住針眼2～3分鐘后，待針眼不出血，再以5%碘酊進行局部消毒，完成一個個體的采樣，離開，再采下一個。

2.接血人。要求是適機配合采血人員，安全足量接出原血。接血人按照防護程序做好個人防護，帶著一枚接血管、一套靜脈血樣采集針，帶著藥棉缸（里面含有配好的酒精棉球、碘酊棉球、干棉球），跟隨采血人。待采血人要棉球、采血針時遞上，待血從針頭溢出插入真空管中，真空管中血液達到3～5毫升時，采血人拔出針頭后，將真空管遞給血樣保管人。

3.血樣保管人。血樣保管人接到接血人的真空管后，用記號筆在真空管側壁醒目處填好血樣編號，然后把采血管放入離心管架中。

4.佩戴耳標人。接血人離開采樣動物后，及時佩戴防疫耳標，可用自噴漆在羊、牛身上噴序號，便于撲殺陽性動物時確認。

5.現(xiàn)場記錄人。現(xiàn)場記錄人在采樣單中填好所采樣的血樣編號及與之對應的羊、牛的耳標號等相關信息。

6.現(xiàn)場取證人?，F(xiàn)場取證人隨時將采血全過程真實情況拍攝下來。必須拍攝羊、牛等戴耳標照片、采血管及被采動物的照片、戶主和畜舍背景照片。

二、采樣過程精細操作關鍵點

1.所有采樣工作人員都嚴格按照防護程序做好個人防護，盡量做到不要有皮膚暴露在外。

2.保定人員必須牢固保定好采樣動物，嚴防保定不牢固擊傷采樣人員，或者針頭誤傷采樣人員，否則采樣不能進行。

3.保定羊采用雙人保定較牢固，一人一手抓住羊?qū)鹊亩蚪?，另一手勒住羊的下頜部，用力靠在身上；另一人一手抓住與羊耳、角同側的腹肋部膝前皺襞處，另一手抓住用乳膠管繞圈勒住頸部下端，使頸靜脈暴露凸顯出來。實踐中，這種保定法較好，采血較快。

4.?？刹捎梦察o脈采血，接觸牛尾部，牛不易驚，牛尾神經(jīng)相對遲鈍，疼痛輕，保定省力，只需一人將牛牽好即可，應激小。

5.取完血樣，采血人先拔出輸入血針交給接血人，接血人一手持接血管另一手拔出輸出血針。不能先拔輸出血針再拔輸入血針，這樣容易引起血液噴濺，造成污染。

6.貯存運輸，樣品放入冷藏箱（2～8℃）內(nèi)，防止震蕩，當天連同采樣單送至化驗室檢測。

7.采樣人員必須身體健康，全身無傷口、指甲剪短，年齡30～50歲，采樣前后必須通過醫(yī)院、疫控中心等有相關資質(zhì)單位的檢測，檢測結果布病為陰性的人員。

三、實驗室檢測

用虎紅平板凝集實驗做篩選檢測，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）做確診檢測。按常規(guī)方法分離制備血清，血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血，無腐敗氣味。

1.虎紅平板凝集試驗精細操作關鍵點。對溫度要求嚴格，整個實驗要求室溫在（22±4）℃?？乖c血清在室溫條件下放置30分鐘。判定結果要在白色背景、自然光下觀察，不要在燈光下觀察判定結果。每次試驗應設陰性、陽性血清對照。受檢血清在4分鐘內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判定為陽性，成均勻粉紅色者為陰性。虎紅平板凝集抗原使用前應充分搖勻，方可使用?？乖霈F(xiàn)污染或搖不散的凝集塊者不得使用。

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）精細操作關鍵點。ELISA法敏感性高，特異性強，操作簡便、安全。間接ELISA高度敏感，但不能鑒別牛種布氏桿菌19號疫苗接種所產(chǎn)生的抗體。競爭ELISA可以排除牛種布氏桿菌19號疫苗所產(chǎn)生抗體的影響。

ELISA的靈敏度在1納克/毫升水平以上，要盡量避免標本間的污染。從冰箱取出試劑及冷藏的待檢標本于室溫（18～28℃）下平衡30分鐘再進行測試，剩余試劑及時封存，放入冰箱備用。加樣器要經(jīng)常清洗，定期校準。加樣吸嘴保持潔凈，吸量準確。加酶液時要垂直滴加到反應孔的中央，不要把酶液濺到或滴到反應孔的上部，以免洗板時不能徹底把酶液洗凈而出現(xiàn)假陽性。盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，水的高度以浸過小孔1/3處為宜，孵育溫度為（37±1）℃為宜，時間以試劑說明書為準。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋。洗板時要不時地觀察洗板機針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時糾正，洗板機不用時應用去離子水或蒸餾水沖洗管道，避免堵孔。加樣時保持顯色劑不外流，A、B液應避免接觸金屬器械。酶標儀波長設置要正確。

從養(yǎng)殖場戶采集了牛、羊全血后，畜牧獸醫(yī)行政部門應盡快檢測確診，盡快把確診結果告知養(yǎng)殖場戶，根據(jù)《動物防疫法》《布魯氏菌病防治技術規(guī)范》等相關法律法規(guī)規(guī)定，對患病動物及其流產(chǎn)胎兒、胎衣、排泄物、乳、乳制品等及時進行無害化處理。