劉金山，李迪，武首先

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼028000)

脂聯(lián)素對老化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自發(fā)性骨化的影響

劉金山，李迪，武首先

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古通遼028000)

目的 探討老化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的自發(fā)性骨化過程及脂聯(lián)素在這一過程中的作用。方法 將第2代BMSCs(分離自一小兒畸形斷肢的殘指)分為空白對照組及脂聯(lián)素低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M加入DMEM/F12培養(yǎng)基及10%胎牛血清，脂聯(lián)素低、中、高劑量組分別在此基礎(chǔ)上加入終濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂聯(lián)素，各組均傳代培養(yǎng)至第10代。收集各組第2代和第10代細(xì)胞，茜素紅S染色后計(jì)算鈣化物染色率，qPCR法檢測骨鈣素(OCN)mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果 與第2代細(xì)胞比較，各組第10代細(xì)胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達(dá)量均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細(xì)胞比較，脂聯(lián)素低、中、高劑量組鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達(dá)量均升高，但脂聯(lián)素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 BMSCs在傳代過程中可發(fā)生自發(fā)性骨化，脂聯(lián)素可促進(jìn)這一過程，并呈濃度依賴性。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；脂聯(lián)素；骨鈣素；成骨分化；細(xì)胞傳代

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種具有自我更新和分化潛能的成體干細(xì)胞，可分化為多種成熟細(xì)胞。BMSCs可修復(fù)受損的骨組織，在維持骨組織代謝平衡過程中具有重要作用[1～3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs的分化能力具有在傳代過程中逐漸減弱的趨勢，且伴有自發(fā)性成骨的發(fā)生，其作用機(jī)制尚不明確[4]。脂聯(lián)素是近年來新發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞因子之一，具有增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性、抗炎、促進(jìn)骨發(fā)育和抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)活性，在調(diào)節(jié)機(jī)體糖類和脂類代謝中具有重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，骨外傷患者體內(nèi)脂肪細(xì)胞因子含量明顯升高，且與患者的年齡相關(guān)[6，7]。2016年2～5月，本研究通過多次傳代構(gòu)建老化的BMSCs模型，觀察了脂聯(lián)素在誘導(dǎo)老化BMSCs自發(fā)性骨化過程中的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：QuantiTect Probe RT-PCR Kit試劑盒購自德國凱杰公司，茜素紅S染色試劑盒購自上海中喬新舟生物科技有限公司，0.25%EDTA胰酶購自美國Hyclone公司，TRIzol和α-MEM培養(yǎng)基購自美國GE公司，CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-APC購自美國BD公司；脂聯(lián)素購自美國Sigma-Aldrich有限公司；分析純試劑購自國藥集團(tuán)北京分公司；二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國熱電公司，Allegra 64R低溫高速離心機(jī)、CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自德國Beckman公司，CX51熒光倒置顯微鏡購自日本奧林帕斯公司，MyCycler PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 BMSCs分離及鑒定 經(jīng)患者本人及其家屬同意，經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，取我院骨外科一小兒畸形斷肢的殘指，于超凈工作臺中反復(fù)使用75%乙醇消毒。手術(shù)刀分離斷肢的肌肉、肌腱，取出殘肢內(nèi)的指骨，用咬骨剪剪斷指骨兩端。注射器抽取含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基20 mL，從指骨一端反復(fù)沖洗骨髓腔，并將液體收集于50 mL離心管中。PBS沖洗，1 500 r/min離心5 min，取細(xì)胞懸液用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，半量換液。培養(yǎng)第7天時(shí)，顯微鏡下觀察BMSCs生長情況，取貼壁生長的細(xì)胞進(jìn)行消化并傳代。取消化下來的部分BMSCs，1 500 r/min離心5 min，棄除培養(yǎng)基；使用PBS清洗2次后重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，制備單細(xì)胞懸液。取200 μL單細(xì)胞懸液，分別加入CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44- FITC、CD105-APC不同類型的流式抗體5 μL，避光室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測CD45、CD34、HLA-DR、CD29、CD44和CD105在BMSCs中的表達(dá)。以陽性表達(dá)率>99%定義為陽性，<1%定義為陰性。結(jié)果顯示，細(xì)胞表面CD45、CD34、HLA-DR表達(dá)均為陰性，CD29、CD44、CD105表達(dá)均為陽性，證實(shí)分離的細(xì)胞為BMSCs。

1.3 細(xì)胞分組處理 將BMSCs用0.1%胰酶消化后，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，原代培養(yǎng)至第7 天(第2代)。將第2代BMSCs分為空白對照組及脂聯(lián)素低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M加入DMEM/F12培養(yǎng)基及10%胎牛血清，脂聯(lián)素低、中、高劑量組分別在此基礎(chǔ)上加入終濃度為0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂聯(lián)素。將細(xì)胞按照1∶3的比例每3 天傳代1次，保持脂聯(lián)素在各組培養(yǎng)基中的濃度，融合至90%后進(jìn)行傳代，傳至第10代。

1.4 BMSCs自發(fā)性骨化及脂聯(lián)素對自發(fā)性骨化影響的觀察

1.4.1 細(xì)胞鈣化情況 取各組原代細(xì)胞培養(yǎng)至第2代和傳代培養(yǎng)至第10代的細(xì)胞，分別行茜素紅S染色。方法如下：將細(xì)胞用PBS沖洗兩遍，4%多聚甲醛固定10 min；PBS繼續(xù)沖洗兩遍，加入茜素紅S染液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗兩遍。嚴(yán)格按照茜素紅S染色試劑盒說明書進(jìn)行操作。40倍顯微鏡下觀察鈣鹽沉積情況(茜素紅)可將鈣化物染成紅色，隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用Image Pro Plus6.0軟件分析鈣化物面積。鈣化物染色率=茜素紅S染色面積/低倍鏡視野總面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4.2 細(xì)胞骨鈣素(OCN)mRNA表達(dá) 采用qPCR法。取各組原代培養(yǎng)至第2代和傳代培養(yǎng)至第10代的細(xì)胞，TRIzol裂解后提取總RNA，合成cDNA后，對MIB2和內(nèi)參基因GAPDH mRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR綠色熒光染料10 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、3 min，循環(huán)1次；95 ℃、12 s，62 ℃、60 s，循環(huán)35次；62～95 ℃，每2 s升高0～2 ℃，循環(huán)1次。OCN引物序列：上游引物：5′-TGCAAAGCCCAGCGACTCT -3′，下游引物：5′-AGTCCATTGTTGAGGTAGGG-3′，引物長度：20 bp；GAPDH引物序列：上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，引物長度：19 bp。采用2-ΔΔCt法計(jì)算OCN mRNA相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞鈣化物沉積情況比較 與第2代細(xì)胞比較，各組第10代細(xì)胞鈣化物染色率均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細(xì)胞比較，脂聯(lián)素低、中、高劑量組鈣化物染色率均升高，但脂聯(lián)素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。見表1。

表1 各組鈣化物染色率比較

注：與同組第2代比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與脂聯(lián)素低劑量組比較，△P<0.05。

2.2 各組OCN mRNA相對表達(dá)量比較 與第2代細(xì)胞比較，各組第10代細(xì)胞OCN mRNA相對表達(dá)量均升高(P均<0.05)；與空白對照組第10代細(xì)胞比較，脂聯(lián)素低、中、高劑量組OCN mRNA相對表達(dá)量均升高，但脂聯(lián)素中、高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。見表2。

表2 各組OCN mRNA相對表達(dá)量比較

注：與同組第2代比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05；與脂聯(lián)素低劑量組比較，△P<0.05。

3 討論

骨形成在人體發(fā)育過程中具有一定規(guī)律性：在青年期以前，骨可以由骺軟骨逐漸骨化形成；而成年期以后，骨的來源主要依靠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨組織內(nèi)的代謝平衡完成[8]。BMSCs作為已知成骨細(xì)胞的主要來源，在骨細(xì)胞的自我更新過程中發(fā)揮重要作用。但是隨著傳代數(shù)量的增加，BMSCs的分化和增殖能力逐漸改變，可以發(fā)生自發(fā)性骨化和自發(fā)性脂肪化等不同現(xiàn)象，其原因目前尚不明確。

脂肪細(xì)胞因子是上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的由脂肪細(xì)胞分泌的補(bǔ)體因子，最初是由Friedman研究組在1994年首先克隆出肥胖基因的表達(dá)產(chǎn)物——瘦素，從而開啟了脂肪細(xì)胞因子的新時(shí)代[10]。隨后脂肪細(xì)胞因子家族中的其他成員逐漸被發(fā)現(xiàn)，包括脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α和IL-6等，目前已經(jīng)確認(rèn)的脂肪細(xì)胞因子有20多種。脂聯(lián)素是由體內(nèi)脂肪組織和脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子之一，其基因定位于染色體3q27，蛋白質(zhì)分子量為30 kDa，由244個(gè)氨基酸組成，在人體血液中以三聚體、六聚體和多聚體的形式微量存在，其濃度為2～25 mg/L，在女性血液中的含量較男性高[11，12]。脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)機(jī)體糖類和脂類代謝中發(fā)揮重要作用，其在體內(nèi)可以通過激活A(yù)MPK、PPAR-α和p38MAPK等信號通路，發(fā)揮增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性、抗炎、促進(jìn)骨發(fā)育和抗動脈粥樣硬化等生物學(xué)活性[13，14]。研究顯示，骨外傷患者體內(nèi)脂肪細(xì)胞因子含量明顯增高，推測脂肪細(xì)胞因子可能與骨組織的修復(fù)有關(guān)[9]；老年人在骨折愈合的過程中體內(nèi)脂聯(lián)素含量明顯升高[15]。說明脂聯(lián)素可能在骨形成的過程中發(fā)揮一定作用。

鈣化物沉積及OCN表達(dá)升高是BMSCs發(fā)生自發(fā)性骨化的特異性標(biāo)志。骨骼在形成的過程中，鈣化物不斷沉積在骨小梁表面，是形成骨密質(zhì)的主要成分。因此，鈣化沉積可以反映出骨組織的形成情況。OCN是成骨細(xì)胞特異分泌的一種蛋白質(zhì)，可促進(jìn)骨骼的鈣化過程，被認(rèn)為是骨組織形成過程中的重要標(biāo)志蛋白之一。本研究結(jié)果顯示，各組第2代細(xì)胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是由于在BMSCs分化的早期，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)而分化能力相對較弱，因此并未出現(xiàn)分化現(xiàn)象。本研究各組第10代細(xì)胞鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達(dá)量均明顯高于第2代細(xì)胞，說明BMSCs在傳代過程中分化能力增強(qiáng)，發(fā)生了自發(fā)性骨化。本研究第10代細(xì)胞脂聯(lián)素低、中、高劑量組鈣化物染色率、OCN mRNA相對表達(dá)量均高于空白對照組，但脂聯(lián)素中、高劑量組升高更明顯，說明脂聯(lián)素可促進(jìn)BMSCs在傳代過程中的自發(fā)性骨化過程，并呈濃度依賴性。

本研究結(jié)果有助于揭示BMSCs自發(fā)性骨化的機(jī)制，為臨床骨代謝過程的研究提供依據(jù)。通過監(jiān)測骨質(zhì)疏松患者血液中脂聯(lián)素水平， 并分析其骨代

謝情況，在預(yù)防老年性骨質(zhì)疏松等方面具有一定的參考價(jià)值。

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內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(NJZY173)。

武首先(E-mail: wushouxian@yeah.net)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.012

R329

A

1002-266X(2017)16-0041-03

2016-10-11)