紀(jì)巧，周顯禮，凌耿強(qiáng)，王曉蕾，韋虹，杜琳瑤

超聲微泡造影劑攜帶PE38生物毒素殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的實驗研究

紀(jì)巧，周顯禮，凌耿強(qiáng)，王曉蕾，韋虹，杜琳瑤

目的研究超聲微泡造影劑 PLGA-COOH 聯(lián)合生物毒素PE38 對內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

方法制備超聲微泡造影劑 PLGA-COOH，包裹生物毒素PE38 后形成復(fù)合物，將血管內(nèi)皮細(xì)胞分為空白對照組、輻照微泡組、PE38 組、復(fù)合物組、輻照復(fù)合物組，以 TUNEL實驗檢測凋亡指數(shù)，以 Western blot 實驗檢測 cleaved caspase-3，并進(jìn)行組間比較。

結(jié)果TUNEL 結(jié)果顯示：輻照微泡組細(xì)胞凋亡與空白對照組無顯著差異（P = 0.946）；PE38 組細(xì)胞凋亡較空白對照組顯著增加（P ＜ 0.001）；復(fù)合物組細(xì)胞凋亡較 PE38 組顯著下降（P ＜ 0.001），較空白對照組顯著增加（P ＜ 0.001）；輻照復(fù)合物組細(xì)胞凋亡較 PE38 組顯著增加（P ＜ 0.001）。蛋白檢測結(jié)果與凋亡檢測相符。

結(jié)論超聲造影劑微泡復(fù)合物聯(lián)合生物毒素殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的安全性、特異性及有效性，是一種具有前景的腫瘤血管殺傷方法。

超聲微泡造影劑； 生物毒素； 內(nèi)皮細(xì)胞

抗血管生成療法在多種腫瘤的治療中起著重要的作用，其主要機(jī)制之一是抑制腫瘤血供從而“餓死”腫瘤細(xì)胞[1]。抑制腫瘤血供主要有兩種方式，即阻止內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血管和殺傷腫瘤血管結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血管的信號通路極其復(fù)雜，阻斷單一通路難以達(dá)到徹底抑制腫瘤血供的效果[2]。而殺傷腫瘤血管結(jié)構(gòu)是一種直接有效的方法，目前已有研究證實應(yīng)用重組免疫毒素能夠抑制腫瘤血供[3]。由于重組免疫毒素造價高昂，短時間內(nèi)大規(guī)模應(yīng)用于治療對患者負(fù)擔(dān)巨大，因此需要探索一種造價相對低廉的特異性切斷腫瘤血供的方法。

超聲微泡造影劑是一種造價低廉、可大規(guī)模生產(chǎn)的藥劑，且其具有包裹攜帶藥物的功能。通過超聲輻照，微泡造影劑可以在特定的組織器官內(nèi)破裂，釋放出攜帶的藥物，使藥物在局部的濃度明顯增高，達(dá)到更好的治療目的[4]。目前對于超聲微泡攜帶生物毒素殺傷腫瘤血管的研究很少。因此，在本研究中我們首次嘗試應(yīng)用超聲微泡造影劑包裹非特異性生物毒素形成復(fù)合物，并觀察其安全性，以及在超聲輻照前后其殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自中科院上海細(xì)胞庫；一抗兔抗人 cleaved caspase-3抗體為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗人GAPDH 抗體為 LSBio 公司產(chǎn)品；TUNEL 試劑盒為美國 Roche 公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器 聲振儀購自愛德森電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含 5 ng/ml bFGF 和 5% FBS 的 HE-SFM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱設(shè)置條件為 37 ℃、5% CO2。細(xì)胞株分 5 組分別為空白組（未處理）、輻照微泡（陰性對照）組（僅添加超聲微泡造影劑，超聲輻照）、PE38 組（僅含 PE38 蛋白）、復(fù)合物（微泡 + PE38）組（含微泡復(fù)合物，不輻照）、輻照復(fù)合物（輻照 +微泡 + PE38）組（含微泡復(fù)合物，超聲輻照）。

1.2.2 PLGA-COOH 超聲造影劑的制備 將 1 g聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH）加入 20 ml二氯甲烷中充分?jǐn)嚢?，加?4 ml 雙蒸水，聲振儀聲振 30 s 成乳化液；將乳化液倒入適量 4% 聚乙烯醇（PVA）溶液中，均質(zhì)機(jī)中均質(zhì) 5 min，加入 200 ml 2% 異丙醇溶液，室溫下攪拌 2 ～ 5 h，使微球表面固化，二氯甲烷盡量自然揮發(fā)；多次雙蒸水與正己烷洗滌、離心，收集微球、冷凍干燥后充入氟碳?xì)怏w，即得 PLGA-COOH 微泡超聲造影劑凍干粉。

1.2.3 制備攜帶 PE38 生物毒素的超聲造影劑顆粒 通過將前期我們獲得的重組質(zhì)粒pDsRed-PE38-N1 轉(zhuǎn)染 E.coli BL21 感受態(tài)細(xì)胞，化學(xué)裂解法提取包涵體，獲得 PE38 表達(dá)蛋白，然后用 PBS 溶解，調(diào)整濃度為 0.2 mg/ml，有效殺傷細(xì)胞的最低毒素濃度為 0.1 mg/ml；將PLGA-COOH 造影劑凍干粉與 PBS 相混合制成造影劑微泡混懸液（濃度為 12.5 mg/ml）；將兩種溶液 1∶1 混合均勻，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 超聲輻照 培養(yǎng)瓶置于水槽內(nèi)，探頭距培養(yǎng)瓶底部約 30 mm，超聲機(jī)械指數(shù) 1.4，輻照時間為 60 s。

1.2.5 TUNEL 法計算凋亡細(xì)胞數(shù) 各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，應(yīng)用 TUNEL 試劑盒，按說明書進(jìn)行試驗，在光學(xué)顯微鏡下每組隨機(jī)取 3 ～ 5 個視野，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)（%）= TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) × 100%。實驗重復(fù) 2 次。

1.2.6 Western blot 檢測 cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞加入 4 ℃ RIPA 中充分裂解。4 ℃ 下 12 000 × g 離心 15 min，上清總蛋白用BCA 法定量。每組 10 μg 總蛋白經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜。室溫下封閉 1 h，加入一抗（兔抗人 cleaved caspase-3 抗體，兔抗人 GAPDH 抗體體積稀釋比均為 1∶1000），4 ℃ 過夜；洗膜后加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（體積稀釋比均為 1∶500），室溫1 h，洗膜；ECL 試劑顯色、采圖，Image J 2x 掃描灰度值。實驗重復(fù) 2 次。以（cleaved caspase-3 灰度值/GAPDH 灰度值）× 100% 表示蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD-t 檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲微泡造影劑通過胞吞作用進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞

如圖 1 所示，在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加微泡造影劑后，細(xì)胞將造影劑吞噬至胞內(nèi)，說明超聲微泡造影劑制作成功，可用于攜帶生物毒素進(jìn)行細(xì)胞殺傷。

圖 1 細(xì)胞將造影劑微泡吞噬至胞內(nèi)Figure 1 The microbubbles were phagocytosed into cells

圖 2 各組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（*P ＜ 0.001）Figure 2 The comparison of cells apoptotic index between groups (*P ＜ 0.001)

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞在各組條件下的凋亡數(shù)測定

如圖 2 所示，TUNEL 檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞凋亡指數(shù)平均值分別為空白對照組（5.05 ± 1.08）、輻照微泡（陰性對照）組（5.44 ± 1.13）、PE38 組（36.19 ± 3.84）、復(fù)合物（微泡 + PE38）組（13.64 ± 2.30）、輻照復(fù)合物（輻照 + 微泡 + PE38）組（49.67 ± 5.70），組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異（F = 327.065，P ＜ 0.001）。陰性對照組與空白組無顯著差異（P = 0.946），表明微泡造影劑及超聲輻照對細(xì)胞無毒性作用；PE38 組細(xì)胞凋亡較空白組顯著增加（P ＜ 0.001），表明 PE38 毒素對內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的殺傷作用；將微泡造影劑包裹 PE38 毒素形成復(fù)合物后（微泡 + PE38），其對細(xì)胞的非特異性殺傷作用較 PE38 組顯著下降（P ＜ 0.001），表明微泡造影劑可以保護(hù)細(xì)胞免受毒素殺傷，但較空白組顯著增加（P ＜ 0.001），表明仍有少量 PE38 無法被造影劑包裹；當(dāng)利用超聲輻照將微泡造影劑破壞后（輻照 + 微泡 + PE38），PE38 重新得到釋放，同時由于細(xì)胞形成微孔，毒素進(jìn)入胞內(nèi)增多，該組的細(xì)胞凋亡較 PE38 組顯著增加（P ＜ 0.001）。

2.3 細(xì)胞凋亡標(biāo)志物 cleaved caspase-3 蛋白水平檢測

如圖 3 所示，Western blot 檢測結(jié)果顯示，各組 cleaved caspase-3 灰度值占 GAPDH 灰度值的百分比分別為空白組（7.90% ± 0.85%）、輻照微泡（陰性對照）組（8.23% ± 0.91%）、PE38 組（21.63% ± 1.20%）、復(fù)合物（微泡 + PE38）組（11.50% ± 0.92%）、輻照復(fù)合物（輻照 + 微泡 + PE38）組（74.10% ± 2.89%），組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異（F = 976.124，P ＜ 0.001）。陰性對照組與空白組無顯著差異（P = 0.799）；PE38 組表達(dá)較空白組顯著增加（P ＜ 0.001）；微泡 + PE38 組表達(dá)較 PE38組顯著下降（P ＜ 0.001），但對空白組顯著增加（P = 0.018 ＜ 0.05）；輻照復(fù)合物組的表達(dá)較 PE38 組（P ＜ 0.001）及復(fù)合物組（P ＜ 0.001）均顯著增加。

圖 3 各組 cleaved caspase-3 表達(dá)比較（A：各組 cleaved caspase-3 Western blot 條帶圖；B：各組 cleaved caspase-3 比較柱狀圖；*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.001）Figure 3 The comparison of cleaved caspase-3 expression among groups (A: Western blot band of cleaved caspase-3 in each group; B: Histogram of comparison of cleaved caspase-3 among groups;*P ＜ 0.01,**P ＜ 0.001)

3 討論

生物毒素是一類由植物或細(xì)菌產(chǎn)生的天然毒性蛋白，有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。綠膿桿菌外毒素（pseudomonas extoxin，PE）是目前研究和應(yīng)用比較廣泛的毒素之一[5]。其主要包含 3 個功能性結(jié)構(gòu)域，即細(xì)胞膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域和核糖化酶活性結(jié)構(gòu)域，既往的研究中將除去細(xì)胞膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 PE 毒素稱為 PE38[6]。毒素分子通過細(xì)胞膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后被細(xì)胞內(nèi)吞，在吞飲泡內(nèi)毒素的細(xì)胞膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域被降解從而暴露出轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域，在轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域的作用下毒素分子從吞飲小泡轉(zhuǎn)位至胞漿并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過對真核細(xì)胞延長因子-2（EF-2）的不可逆性二磷酸核糖化修飾使其失活，從而阻斷靶細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過程。此毒性過程為一種酶促反應(yīng)過程，具有高效性，理論上僅一個毒素分子進(jìn)入細(xì)胞就可將其殺死[7]。但是，如何能夠引導(dǎo)毒素特異性地殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞是要解決的關(guān)鍵問題。

超聲造影劑作為血池顯像劑能夠切實反映組織的血供情況，良好地反映組織的微循環(huán)灌注[8]，目前已被成熟應(yīng)用于肝臟、腎臟、膽囊等臟器局灶性病變的定性診斷[9]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)超聲造影劑微泡可以作為靶向治療的載體。微泡可以以多種方式攜帶基因或藥物，當(dāng)微泡復(fù)合物在“感興趣區(qū)”聚集時，增強(qiáng)該區(qū)域聲壓使微泡破裂、引發(fā)藥物的定點定時釋放，微泡破裂時產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波及高速微射流在血管壁或生物屏障上形成暫時性微孔，可以增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染或藥物傳輸[10]。Nakaya等[11]在兔類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射微泡與氨甲蝶呤混合物，證實在超聲暴露下微泡能增強(qiáng)氨甲蝶呤對兔滑膜細(xì)胞的抗炎作用。因此，超聲造影劑微泡作為向細(xì)胞內(nèi)輸送藥物的載體為我們應(yīng)用生物毒素提供了條件。聚乳酸羥基乙酸共聚物PLGA-COOH 是一種具有良好生物相容性的高分子材料，可在體內(nèi)緩慢降解，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，被廣泛用于藥物、基因的傳遞與控釋中，是近年來發(fā)展起來的一種新型造影劑[12]。

本次實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用 PLGA-COOH 制作的超聲微泡造影劑對細(xì)胞幾乎無毒性，當(dāng)其包裹PE38 形成復(fù)合物后，復(fù)合物的生物毒性明顯下降。當(dāng)應(yīng)用超聲輻照將復(fù)合物振蕩破碎后，PE38 毒素大量釋放，且由于細(xì)胞受輻照后造影劑破裂影響形成許多微孔，使釋放的毒素能更多地進(jìn)入胞內(nèi)，比單純應(yīng)用 PE38 對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生了更顯著的殺傷作用，這表明超聲微泡造影劑包裹 PE38 后，復(fù)合物安全性更高，對殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性更明顯，有效性亦有所增高。為充分驗證各組細(xì)胞凋亡水平，我們進(jìn)一步檢測了 caspase-3 裂解產(chǎn)物cleaved caspase-3 的表達(dá)。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，它的激活需要被剪切產(chǎn)生有活性的 17 kD 亞基[13]。蛋白檢測結(jié)果和TUNEL 檢測的結(jié)果基本相符，從分子水平驗證了我們的猜想。但是，復(fù)合物在體內(nèi)實驗中能否達(dá)到體外實驗的效果，需要后續(xù)動物實驗的進(jìn)一步驗證。

綜上，超聲微泡復(fù)合物聯(lián)合生物毒素殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞具有較高的安全性、特異性及有效性，是一種具有前景的腫瘤血管殺傷藥物。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):227-231

關(guān)于公布協(xié)會2015 – 2016年度分支機(jī)構(gòu)評估結(jié)果的通知

為規(guī)范協(xié)會分支機(jī)構(gòu)管理，促進(jìn)分支機(jī)構(gòu)工作，協(xié)會組織開展了 2015 – 2016 年度分支機(jī)構(gòu)評估。按照《中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會分支機(jī)構(gòu)評估辦法》規(guī)定，對協(xié)會各分支機(jī)構(gòu)工作進(jìn)行評分，本次評估設(shè)優(yōu)秀獎 1 名、先進(jìn)獎 6 名。評估結(jié)果已經(jīng)協(xié)會理事長辦公會審議通過，現(xiàn)將獲獎名單公布如下：

一、優(yōu)秀獎

組織生物樣本庫分會

二、先進(jìn)獎

1．骨組織庫分會

2．醫(yī)藥生物技術(shù)臨床應(yīng)用專業(yè)委員會

3．生物診斷技術(shù)分會

4．再生醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會

5．心電學(xué)技術(shù)分會

6．精準(zhǔn)醫(yī)療分會

Experimental study on killing vascular endothelial cells of biological toxin PE38 carried by an ultrasound microbubble contrast-enhanced agent

JI Qiao, ZHOU Xian-li, LING Geng-qiang, WANG Xiao-lei, WEI Hong, DU Lin-yao

ObjectiveTo study the killing effect on endothelial cells of biological toxin PE38 carried by an ultrasound microbubble contrast-enhanced agent PLGA-COOH.

MethodsAn ultrasound contrast-enhanced agent PLGA-COOH was prepared and encapsulated biological toxin PE38. Thevascular endothelial cells were divided into control group (untreated), irradiation microbubble group (only added contrast-enhancedultrasound agent, ultrasonic irradiation), PE38 group (only contained PE38 protein), compound group (contained microbubble compound, no irradiation) and irradiation compound group (contained microbubble compound, ultrasonic irradiation). TUNEL was used to test the apoptotic rate. Western blot was used to test the cleaved caspase-3. The results of both tests were compared among groups.

ResultsThere was no significant difference between the control group and irradiation microbubble group (P = 0.946). The apoptotic rate of PE38 group was significantly higher than that of the control group (P ＜ 0.001). The apoptotic rate of the compound group was significantly lower than that of the PE38 group (P ＜ 0.001), while higher than that of the control group (P ＜ 0.001). The apoptotic rate of the irradiation compound group was significantly higher than that of the PE38 group. The results from Western blot assays were similar to that from the TUNEL assays.

ConclusionThe biological toxin carried by an ultrasound microbubble contrast-enhanced agent has high safety, specificity and effectiveness in killing vascular endothelial cells, and is a promising method in killing tumor blood vessels.

Contrast-enhanced ultrasound microbubble; Biological toxin; Endothelial cells

ZHOU Xian-li, Email: zhouxianli@ems.hrbmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.006

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題資助項目（2013056）

150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院處超聲科（紀(jì)巧、周顯禮、王曉蕾、韋虹、杜琳瑤）；150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)心肌缺血教育部重點實驗室（凌耿強(qiáng)）

周顯禮，Email：zhouxianli@ems.hrbmu.edu.cn

2017-03-16

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(3):227-231

Author Affiliation: In-Patient Ultrasound Department, The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China (JI Qiao, ZHOU Xian-li, WANG Xiao-lei, WEI Hong, DU Lin-yao); Key Laboratory of Myocardial Ischemia, Harbin Medical University, Ministry of Education, Harbin 150086, China (LING Geng-qiang)