李霓，王瀟，許艷妮，韓小婉，劉鵬，司書毅

重組蛋白AdipoR1-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

李霓，王瀟，許艷妮，韓小婉，劉鵬，司書毅

目的構(gòu)建重組 pEGFP-N1-AdipoR1 真核表達(dá)質(zhì)粒并于HEK293T 細(xì)胞中瞬時表達(dá)。

方法提取 HepG2 細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以其為模板，PCR 擴增 AdipoR1 基因，將其插入到 pEGFP-N1質(zhì)粒中，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，采用酶標(biāo)儀測定熒光強度，Western blot 方法鑒定融合蛋白 AdipoR1-EGFP 的表達(dá)情況。

結(jié)果Western blot 結(jié)果顯示，融合蛋白 AdipoR1-EGFP在分子量約 70 kD 處可見明顯的目的條帶；同時，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照組相比，轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 和pEGFP-N1-AdipoR1 的細(xì)胞中熒光強度都有明顯升高，表明融合蛋白 AdipoR1-EGFP 在 HEK293T 細(xì)胞中成功表達(dá)，并且 EGFP 的熒光強度測定能很好地反映細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)論構(gòu)建并表達(dá) AdipoR1-EGFP 融合蛋白，所采用的EGFP 融合蛋白表達(dá)方法簡單高效，重復(fù)性好，為今后AdipoR1 蛋白的表達(dá)及功能研究提供了重要參考。

受體，脂聯(lián)素； 綠色熒光蛋白質(zhì)類； 膜融合蛋白質(zhì)類

脂聯(lián)素是一種由脂肪組織分泌的脂肪因子，具有抗動脈粥樣硬化以及降低血糖等作用[1-3]。已有研究表明，在肥胖、胰島素抵抗和 2 型糖尿病等人群中，血漿中脂聯(lián)素水平呈顯著降低[4]。脂聯(lián)素受體（adiponectin receptors，AdipoR）是機體內(nèi)脂聯(lián)素的主要受體，包括 AdipoRl 和 AdipoR2 兩個亞型，是含有 7 個跨膜結(jié)構(gòu)域的受體蛋白。Yamauchi等[5]于 2003 年首次克隆出人和小鼠的脂聯(lián)素受體基因，為今后研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了重要基礎(chǔ)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，AdipoRl 的表達(dá)涉及激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）通路，而 AdipoR2 的表達(dá)與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）信號通路的激活相關(guān)，從而它們參與葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理過程的調(diào)控。

隨著研究內(nèi)容不斷豐富，有研究人員發(fā)現(xiàn)，AdipoR1 主要在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，與 AMPK 和PPARγ 的共激活因子（PGC）-1α 以及 Ca2+信號通路密切相關(guān)，并且能夠明顯降低與肥胖直接相關(guān)的 2 型糖尿病的發(fā)生[6-7]。為了進(jìn)一步探討 AdipoRl的分子生物學(xué)特性，本實驗通過構(gòu)建人 AdipoR1全基因與增強型綠色熒光蛋白（enhanced green flourence protein，EGFP）融合的真核表達(dá)質(zhì)粒，成功在 HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得到帶有 EGFP標(biāo)簽的融合蛋白，為探討 AdipoR1 蛋白的生物學(xué)功能及參與機體代謝機制的研究奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株 pEGFP-N1 真核表達(dá)質(zhì)粒，人肝癌細(xì)胞 HepG2 細(xì)胞株和人胚腎細(xì)胞HEK293T 細(xì)胞株均由本實驗室保存；大腸桿菌E coli. DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司。

1.1.2 試劑 DNA marker、膠回收試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；各種限制性內(nèi)切酶購自日本 Takara 公司；DNA 連接酶購自美國Promega 公司；DNA 聚合酶 2 × Es Taq MasterMix和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；胎牛血清購自美國 Gibco BRL 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000、細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM 和轉(zhuǎn)染用 opti-MEM 培養(yǎng)基均購自美國 Invitrogen 公司；小鼠抗 GFP 單克隆抗體購自美國 Abmart 公

司；小鼠抗 Actin 單克隆抗體和化合物羅格列酮（rosiglitazone）購自美國 Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 購自北京中杉金橋公司；RIPA裂解液、電轉(zhuǎn)移緩沖液以及其他 Western blot 實驗相關(guān)試劑均購自北京普利來公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國 Corning 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自美國 ThermoFisher 公司。

1.1.3 主要儀器 EnVision 2104 型酶標(biāo)儀為美國 PerkinElmer 公司產(chǎn)品；Tanon5200 型 ECL 發(fā)光儀為北京天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 我們在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中查到 AdipoRl（NM_015999.5）基因全長為1128 bp，共編碼 375 個氨基酸，蛋白分子量約為43 kD。根據(jù)其編碼序列設(shè)計引物，上游引物：5' TC CGCTCGAG ATGTCTTCCCACAAAGGAT 3'（下劃線部分為 Xho I 酶切位點）；下游引物：5' TCGGG ATCCCAGAGAAGGGTGTCATCAGTAC 3'（下劃線部分為 BamH I 酶切位點），擴增全長片段，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 AdipoRl 基因的擴增 提取 HepG2 細(xì)胞總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成總 cDNA，以該 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴增 AdipoRl 基因。反應(yīng)體系為：模板 cDNA（100 ng/ml）2 μl，上下游引物（10 μmol/L）各 2 μl，DNA 聚合酶 2 × Es Taq MasterMix 25 μl，補足 ddH2O 至總體系為 50 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1的構(gòu)建 將 AdipoRl 的 PCR 產(chǎn)物及質(zhì)粒pEGFP-N1 分別進(jìn)行 Xho I 和 BamH I 雙酶切反應(yīng)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的基因片段及載體片段，經(jīng) T4 DNA 連接酶于 25 ℃ 連接 3 h，之后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落 PCR 鑒定為陽性克隆后，提取質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-N1-AdipoR1。

1.2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染和細(xì)胞給藥處理 HEK293T 細(xì)胞用含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于 5% CO2孵箱中 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，消化細(xì)胞，按 2.5 × 105個/ ml 接種至 6 孔板中。待第二天細(xì)胞貼壁后，需要轉(zhuǎn)染組的每個孔按照如下方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將 4 μg 的pEGFP-N1-AdipoR1 質(zhì)粒溶于 250 μl opti-MEM 培養(yǎng)液中，之后將 10 μl 轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000與 240 μl opti-MEM 培養(yǎng)基混合，室溫孵育 5 min，再將上述兩種溶液混合，并室溫孵育 20 min，之后每孔再補加 2 ml 含 10% 胎牛血清的 DMEM完全培養(yǎng)基。同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組作為空白對照組，與 pEGFP-N1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組都于 37 ℃ 培養(yǎng)6 h。之后，加藥組的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 6 h 后，更換為含有終濃度為 10 μmol/L 羅格列酮的 DMEM 培養(yǎng)基；不加藥組細(xì)胞更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.2.5 Western blot 法對融合蛋白進(jìn)行鑒定 收集上述轉(zhuǎn)染后 18 h 的細(xì)胞，用RIPA 裂解液于冰上裂解 30 min，提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，并采用 BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測。按照每孔7.5 μg 總蛋白量上樣，經(jīng) 10% SDS-PAGE 電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，用含有 5% 脫脂奶粉的封閉液于室溫振蕩，封閉 1 h，相應(yīng)蛋白分別加入各自對應(yīng)抗體，小鼠抗 GFP 單克隆抗體（1∶2000 稀釋），小鼠抗 β-actin 單克隆抗體（1∶5000 稀釋），4 ℃ 孵育過夜。第二天，用 TBST溶液洗膜 3 次，每次 15 min，隨后加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶2000 稀釋），室溫振蕩 2 h，用 TBST 溶液洗膜 3 次，每次 15 min，之后利用 ECL 發(fā)光儀進(jìn)行成像檢測。

1.2.6 利用酶標(biāo)儀檢測融合蛋白的表達(dá) 收集上述轉(zhuǎn)染后 18 h 的細(xì)胞，用 RIPA 裂解液冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，并采用 BCA 蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測。將蛋白樣品按照每孔20 μl 加入 384 孔板黑板中，避光，利用酶標(biāo)儀檢測其熒光密度，激發(fā)波長為 480 nm，發(fā)射波長為535 nm。讀取數(shù)值，并根據(jù)蛋白濃度得到其相對強度，鑒定細(xì)胞內(nèi) AdipoR1-EGFP 重組蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用 GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件分析，采用表示，計量組間比較用 one-way ANOVA 檢驗，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人 AdipoRl 全長基因的擴增

以 HepG2 的 cDNA 為模板，擴增 AdipoRl全長基因片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，在 800 ～ 1500 bp 之間有一特異性明亮條帶，其大小與預(yù)期值 1128 bp 相符，如圖 1 所示。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 的構(gòu)建

對 pEGFP-N1 載體和回收的 AdipoR1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行 Xho I 和 BamH I 雙酶切反應(yīng)，切膠回收酶切后的載體及目的基因片段，經(jīng) T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取陽性克隆進(jìn)行菌落 PCR 驗證（圖 2），菌株 1 ～ 4 號均擴增出與預(yù)期大小一致的目的基因條帶。挑取其中菌株 1 和 2 保菌并且提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 進(jìn)行 Xho I 和BamH I 雙酶切驗證，結(jié)果見圖 3?？蛰d體pEGFP-N1 并未見有目的條帶被切下，而陽性克隆的質(zhì)粒 1 和 2 號的酶切結(jié)果中均有與目的基因大小一致的條帶。同時，將這兩個陽性克隆測序，結(jié)果與目標(biāo)基因片段完全一致，我們將此重組表達(dá)質(zhì)粒命名為 pEGFP-N1-AdipoR1。

2.3 融合蛋白 AdipoR1-EGFP 在 HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)

我們將重組表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 轉(zhuǎn)染至 HEK293T 細(xì)胞后，提取蛋白進(jìn)行 Western blot 檢測。結(jié)果顯示，在分子量約 70 kD 大小處可見明顯的目的蛋白條帶，與融合蛋白 AdipoR1-EGFP預(yù)期值相符；而只轉(zhuǎn)染了 pEGFP-N1 對照質(zhì)粒的細(xì)胞中，EGFP 熒光蛋白大小為 27 kD（圖 4A），說明重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 成功在HEK293T 細(xì)胞中表達(dá)。

同時，分別提取細(xì)胞中蛋白，進(jìn)行相對熒光強度檢測。結(jié)果如圖 4B 所示，與未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對照組相比，轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1 和 pEGFP-N1-AdipoR1的細(xì)胞中熒光強度都有明顯升高（P ＜ 0.001），說明帶有熒光標(biāo)記的 EGFP 和融合蛋白 AdipoR1-EGFP均在 HEK293T 細(xì)胞中成功表達(dá)。

圖 1 AdipoR1 PCR 擴增產(chǎn)物結(jié)果Figure 1 PCR product of human AdipoR1 gene

圖 2 重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 的菌落 PCR 電泳結(jié)果Figure 2 PCR product of pEGFP-N1-AdipoR1 in E.coli DH5α

圖 3 重組質(zhì)粒 pEGFP-N1-AdipoR1 的酶切結(jié)果Figure 3 Product of pEGFP-N1-AdipoR1 digested with Xho I /BamH I

2.4 羅格列酮對融合蛋白 AdipoR1-EGFP 表達(dá)的影響

AdipoR1 在參與糖代謝和脂代謝等生理過程中起到重要作用，但目前研究尚未發(fā)現(xiàn)其與核受體PPARγ 之間是否存在直接關(guān)聯(lián)。羅格列酮是目前公認(rèn)的 PPARγ 激動劑，在我們實驗中，分別加入不同濃度的羅格列酮處理轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過對細(xì)胞中熒光值的檢測，判斷是否能夠上調(diào) AdipoR1-EGFP融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與未加入化合物的對照組相比，1 或 10 μmol/L 羅格列酮處理后的細(xì)胞中熒光強度并沒有發(fā)生明顯改變（P ＞ 0.05），說明羅格列酮不會上調(diào) AdipoR1-EGFP 的表達(dá)，因此初步推測 PPARγ 與 AdipoR1 并不直接相關(guān)（圖 5）。

圖 4 融合蛋白 AdipoR1-EGFP 表達(dá)的檢測結(jié)果[A：HEK293T 細(xì)胞中，融合蛋白 AdipoR1-EGFP 表達(dá)的 Western blot 結(jié)果；B：HEK293T 細(xì)胞中，融合蛋白 AdipoR1-EGFP 表達(dá)的熒光強度檢測結(jié)果（***P ＜ 0.001 vs.對照組）]Figure 4 The expression of AdipoR1-EGFP [A: Western blot result of AdipoR1-EGFP in HEK293T cells; B: Relative flourescence intensity of AdipoR1-EGFP in HEK293T cells (***P ＜ 0.001vs. control)]

圖 5 羅格列酮對 AdipoR1-EGFP 蛋白表達(dá)的影響（***P ＜0.001；N.S. 無顯著差異）Figure 5 The influence of AdipoR1-EGFP expression treating with rosiglitazone (***P ＜ 0.001；N.S. no significance)

3 討論

脂聯(lián)素作為機體中重要的脂肪細(xì)胞因子，對機體能量代謝有著重要調(diào)節(jié)作用，尤其在胰島素抵抗、肥胖和 2 型糖尿病中，其表達(dá)量明顯降低。脂聯(lián)素受體能夠與脂聯(lián)素結(jié)合，通過一系列生物機制介導(dǎo)后，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝和改善胰島素敏感性的作用，以及抗炎、抗動脈粥樣硬化等特性[8]。2015年，Tanabe 等[9]將 AdipoR1 及 AdipoR2 的全新晶體結(jié)構(gòu)破譯。AdipoR1/R2 由 N 端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、7 次跨膜結(jié)構(gòu)域以及 C 端胞外結(jié)構(gòu)域組成，其跨膜部分包含鋅離子結(jié)合位點和脂聯(lián)素結(jié)合面，其結(jié)構(gòu)和功能均區(qū)別于經(jīng)典的受體蛋白 G-蛋白偶聯(lián)受體，該結(jié)構(gòu)的揭示為新的脂聯(lián)素受體激動劑的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)化提供了新的途徑。

EGFP 作為一種新型熒光報告分子，具有表達(dá)穩(wěn)定、便捷、直觀、易操作等優(yōu)點。本實驗圍繞 AdipoR1 的相關(guān)功能，基于人的 AdipoR1 全長基因，構(gòu)建了帶有 EGFP 熒光標(biāo)記的真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，成功表達(dá)了AdipoR1-EGFP 融合蛋白，其表達(dá)既可通過 EGFP的抗體檢測，同時也可以通過酶標(biāo)儀測定熒光值確定細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量，具有靈敏度高、操作簡便等優(yōu)點。

脂聯(lián)素受體的表達(dá)調(diào)控還與胰島素水平及胰島素抵抗、核受體 PPARγ、腫瘤壞死因子-α 等密切相關(guān)。Tsuchida 等[10]和 Felder 等[11]認(rèn)為鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病鼠和肥胖鼠的骨骼肌和脂肪組織中，體內(nèi)胰島素水平與 AdipoR1 和 AdipoR2 呈負(fù)相關(guān)。目前對于參與糖代謝過程中，PPARγ 與AdipoR1 是否直接相關(guān)仍有待研究。在本實驗中，我們加入羅格列酮處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的AdipoR1-EGFP 蛋白表達(dá)并無明顯上調(diào)，這與部分研究結(jié)果相符合，但仍需要進(jìn)一步研究及深入探討[12-13]。但 Tan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮治療2 型糖尿病的受試者 12 周后與安慰劑對照組比較，AdipoR1 表達(dá)上調(diào)，AdipoR2 表達(dá)無改變，推測可能是由于羅格列酮降低了高胰島素血癥受試者胰島素的濃度，從而削弱體內(nèi)由胰島素下調(diào)所引起的 AdipoR1 表達(dá)的作用。同時，也有研究者發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可上調(diào) 2 型糖尿病大鼠血清脂聯(lián)素及骨骼肌 AdipoR1 的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素抵抗[15]。

目前，針對 AdipoR1 表達(dá)的研究主要集中在不同受體類激動劑對于 AdipoR1 內(nèi)源表達(dá)水平的影響，因此本實驗中構(gòu)建的帶有 EGFP 標(biāo)記的融合蛋白將為 AdipoR1 在細(xì)胞中表達(dá)及相關(guān)通路研究提供新的途徑。綜上所述，本實驗將 EGFP作為報告基因，成功構(gòu)建并表達(dá)真核重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AdipoR1，該方法的建立為 AdipoR1 相關(guān)通路的機制研究提供了新方法，為以 AdipoR1為靶點的新型篩選模型建立以及 AdipoR1 小分子上調(diào)劑的篩選奠定了基礎(chǔ)，同時為糖尿病等代謝性疾病藥物的研發(fā)提供了新的手段和思路。

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Construction and expression of eukaryotic expression vector for AdipoR1-EGFP recombinant protein

LI Ni, WANG Xiao, XU Yan-ni, HAN Xiao-wan, LIU Peng, SI Shu-yi

ObjectiveTo construct an eukaryotic recombinant expression vector for AdipoR1 gene and express it in human HEK293T cells.

MethodsTotal RNA was extracted from HepG2 cells and reversely transcribed to cDNA, which was used as a template for amplification of AdipoR1 gene by RT-PCR. The amplified AdipoR1 gene was inserted to vector pEGFP-N1, then the constructed recombinant vector pEGFP-N1-AdipoR1 was transfected to HEK293T cells using Lipofectamine. The expression of fusion protein AdipoR1-EGFP was determined by Western blot and the fluorescence intensity was measured by a microplate reader.

ResultsIn Western blot assay, the fusion protein AdipoR1-EGFP was expressed with the 70 kD molecular weight. Furthermore, compared to the blank group without transfection, the relative fluorescence intensity of pEGFP-N1 and pEGFP-N1-AdipoR1 group increased significantly. These indicated that the fusion protein AdipoR1-EGFP was successfully expressed in HEK293T cells, and the expression level of fusion protein could be determined by measuring the fluorescence intensity of EGFP.

ConclusionRecombinant eukaryotic expression vector pEGFP-N1-AdipoR1 is constructed and the fusion protein is successfully expressed in HEK293T cells. This method is simple, efficient and reproducible, which provides a reference for further study on the expression and function of AdipoR1.

Receptors, adiponectin; Green fluorescent proteins; Membrane fusion proteins

: SI Shu-yi, Email: sisyimb@hotmail.com

國家自然科學(xué)基金（81503065）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室（李霓），醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室（李霓、王瀟、許艷妮、韓小婉、劉鵬、司書毅）

司書毅，Email：sisyimb@hotmail.com

2017-02-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.004

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):215-220

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Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica

(LI Ni), National Center for Microbial Drug Screening, Institute of Medicinal Biotechnology (LI Ni, WANG Xiao, XU Yan-ni, HAN Xiao-wan, LIU Peng, SI Shu-yi), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China