趙瓊，蔣建東，張靖溥

人肝細(xì)胞核因子4基因II型啟動子的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特性

趙瓊，蔣建東，張靖溥

目的探討人肝細(xì)胞核因子 4α 基因 II 型啟動子（hHNF4α-P2）雙向調(diào)控基因表達(dá)的作用。

方法克隆 hHNF4α-P2 –23 ～ –1291（1268 bp）序列；構(gòu)建由該段正、反序列驅(qū)動的熒光蛋白真核表達(dá)載體；將其通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和顯微注射導(dǎo)入細(xì)胞或斑馬魚體內(nèi)，考察其表達(dá)的時空特性。通過 DNA 缺失實驗和序列預(yù)測分析尋找hHNF4α-P2 的正、反向核心啟動序列。

結(jié)果hHNF4α-P2 的正向和反向 DNA 序列（–23 ～ –1291）均可驅(qū)動其下游報告基因在人正常肝細(xì)胞 L02 及肝癌細(xì)胞 Huh7 中表達(dá)；在斑馬魚體內(nèi)正向啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白基因可在耳石、嗅泡和神經(jīng)丘等感覺器官中高表達(dá)，在肝區(qū)可見較弱的紅色熒光。反向啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白基因可在血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、體節(jié)及脊索等組織表達(dá)。該啟動子正鏈存在一段核心序列，反鏈存在兩段核心序列。

結(jié)論首次發(fā)現(xiàn) hHNF4α-P2 的 –23 ～ –1291 序列具有雙向調(diào)控基因在不同組織表達(dá)的功能。

肝細(xì)胞核因子 4α； 基因表達(dá)； 斑馬魚；雙向啟動子

肝細(xì)胞核因子 4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）位于人基因組第 20 號染色體上，是一類高度保守的核受體超家族成員，對于肝細(xì)胞分化和功能[1]、胰腺 β 細(xì)胞功能的維持[2]等發(fā)揮重要的調(diào)控作用。HNF4α 基因座含有相距約 46 kb 的兩個啟動子區(qū)域 P1 和 P2，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有明顯的時空差異性。在小鼠胚胎肝臟中，P2 轉(zhuǎn)錄的 HNF4α亞型水平遠(yuǎn)高于 P1 的產(chǎn)物[3-4]，而成年肝細(xì)胞中則以 P1 表達(dá)的 HNF4α 為主[3-5]，兩者在胃、腎臟、小腸、胰臟 β 細(xì)胞等組織的表達(dá)也有差異[4]。這兩種啟動子的差異性調(diào)控還表現(xiàn)在諸多的腫瘤中[6-7]。因此，研究 HNF4α 啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性對于全面了解該蛋白在胚胎發(fā)育及病理過程中的作用具有重要意義。另外，雙向啟動子是基因調(diào)控多樣性和協(xié)調(diào)性的重要機(jī)制，這種基因現(xiàn)象在脊椎動物中普遍存在[8]，但實驗證據(jù)相對較少。本文報道了人 HNF4α II 型啟動子（HNF4α-P2）區(qū)域約 1.3 kb序列在斑馬魚胚胎中的雙向啟動子功能。

1 材料與方法

1.1 試劑及材料

胰蛋白胨及酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；瓊脂糖和轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 購自美國 Invitrogen 公司；DNA 片段凝膠回收試劑盒、Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DTT、dNTP、T4 DNA 連接酶、pMD19-T 載體均購自日本Takara 公司；質(zhì)粒中提試劑盒及細(xì)胞基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)所需的 DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自德國 Nunc 公司；人肝細(xì)胞系 HepG2 細(xì)胞、L02 細(xì)胞和缺失了 CMV啟動子序列的 pdCMVP-EGFP-N1 由本實驗室保存；pIRES2-DsRed 由杭州師范大學(xué)張亮惠贈；斑馬魚（Daniorerio）AB 系由清華大學(xué)生命科學(xué)院孟安明教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank 中hHNF4α-P2 啟動子序列設(shè)計相關(guān)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司北京合成部合成，序列如表 1 所示。所克隆的 hHNF4α-P2 啟動子序列約為 1.3 kb。

1.2.2 hHNF4α-P2 啟動子的克隆與表達(dá)載體的連接 按基因組 DNA 提取試劑盒說明書提取HepG2 細(xì)胞基因組 DNA。以 HepG2 細(xì)胞基因組DNA 為模板，以 hHNF4α-P2-F 和 hHNF4α-P2-R為引物（表 1），通過 touch down PCR 方法擴(kuò)增得到約 1.3 kb 的目的片段。PCR 條件為 95 ℃ 30 s，68 ～ 50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，每兩個循環(huán)退火溫度降低 2 ℃；然后 95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán) 30 次。將獲得的目的片段連入 pMD-19T 載體，經(jīng)測序確認(rèn)得到目的啟動子序列。利用pMD-19T 載體酶切位點 Hind III、BamH I 和pdCMVP-EGFP-N1 上相同酶切位點構(gòu)建反向表達(dá)載體；利用 pMD-19T 載體 Hind III、BamH I 兩個酶切位點和 pdCMVP-EGFP-N1 上 Hind III 和Bgl II 兩個酶切位點，構(gòu)建正向表達(dá)載體。通過PCR 方法，以 pIRES2-DsRed 為模板擴(kuò)增 DsRed基因片段，并通過 Hind III 和 Bgl II 兩個酶切位點連入已構(gòu)建的反向表達(dá)載體，構(gòu)建雙向表達(dá)載體（圖 1）。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取無內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒備用。用帶 BamH I 酶切位點及其保護(hù)堿基的正向引物及帶 Hind III 酶切位點及其保護(hù)堿基的反向引物，以 pMD-19T-hHNF4α-P2 重組質(zhì)粒為模板，通過 PCR 方法擴(kuò)增截短的目的片段，并以與克隆的 1.3 kb 啟動子區(qū)域相同的酶切位點將截短片段連入相應(yīng)的表達(dá)載體，獲得 P2 DNA 系列缺失的報告基因表達(dá)構(gòu)件。

表 1 引物序列Table 1 Sequences of primers

圖 1 hHNF4α-P2 啟動子雙向轉(zhuǎn)錄基因構(gòu)件示意圖及其細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果[A：hHNF4α 基因座結(jié)構(gòu)及 hHNF4α-P2 雙向啟動子基因構(gòu)件示意圖；B：分別轉(zhuǎn)染正向（pP2f-EGFP）或反向（pP2r-EGFP）hHNF4α-P2 驅(qū)動的真核表達(dá)基因構(gòu)件到 L02 細(xì)胞和 Huh7 細(xì)胞中，培養(yǎng) 24 h 后的熒光顯微圖片]Figure 1 Schemes of bidirectional expression constructs of hHNF4α-P2 promoter with EGFP or/and DsRed reporter genes and their expression in cell lines [A: Schemes of hHNF4α gene locus structure and constructs of fluorescent reporter gene expression driven by hHNF4α-P2 bidirectional promoter; B: Fluorescence microscope images of L02 and Huh7 cells transfected with pP2f-EGFP or pP2r-EGFP for 24 h, respectively]

1.2.3 啟動子活性檢測 在含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng) L02和 Huh7 細(xì)胞。傳至 48 孔板培養(yǎng) 24 h，用轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 推薦的方法瞬時轉(zhuǎn)染 6 h，其中構(gòu)建的單向啟動子表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為 100 ng/孔。轉(zhuǎn)染 24 h 后，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)情況。

1.2.4 啟動子表達(dá)圖譜檢測 將 hHNF4α-P2 啟動子雙向表達(dá)構(gòu)件注射到 0 ～ 4 細(xì)胞期的斑馬魚胚胎，并從受精后 12 h（12 hpf）開始觀察紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白表達(dá)情況至受精后 10 d（10 dpf）。用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.2.5 核心啟動子區(qū)域預(yù)測 在 http://www. fruitfly.org/ 上輸入目標(biāo)啟動區(qū)域序列進(jìn)行核心啟動子區(qū)域預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 hHNF4α-P2 啟動子的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù) NCBI 上 hHNF4α 基因座序列（Homo sapiens chromosome 20, GRCh37.p5 Primary Assembly）設(shè)計引物，如表 1，以人肝癌細(xì)胞系HepG2 基因組為模板，克隆得到 hHNF4α-P2 啟動子區(qū)域 –23 ～ –1291（1268 bp）。分別以BamH I 和Hind III 兩個酶切位點分別以正向（5' → 3'）和反向（3' → 5'）連入經(jīng)實驗室改造啟動區(qū)域缺失的pdCMVP-EGFP-N1，基于 hHNF4α 基因轉(zhuǎn)錄方向，將同 hHNF4α 方向（5 '→ 3'）插入 EGFP 報告基因的基因表達(dá)構(gòu)件命名為 pP2f/hnf4-EGFP（pP2f-EGFP），將在 hHNF4α 方向的上游反向（3' → 5'）插入 EGFP 的基因表達(dá)構(gòu)件命名為pP2r/hnf4-EGFP（pP2r-EGFP）。將 EGFP 和 DsRed（編碼紅色熒光蛋白基因）分別插入到 P2 序列的上游和下游，構(gòu)成雙向報告基因表達(dá)構(gòu)件，命名為 pP2bi/hnf4-EGFP/DsRed（pP2bi-EGFP/DsRed）（圖 1A）。將上述兩個單向表達(dá)構(gòu)件分別轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞 L02 及肝癌細(xì)胞 Huh7，均可見報告基因 EGFP有效表達(dá)（圖 1B），證明了這段序列的雙向啟動轉(zhuǎn)錄的功能。

2.2 hHNF4α-P2 啟動子驅(qū)動的報告基因在斑馬魚胚胎中的表達(dá)

將 hHNF4α-P2 雙向報告基因表達(dá)構(gòu)件pP2bi-EGFP/DsRed 注射到 0 ～ 4 細(xì)胞期的斑馬魚受精卵中并觀察 DsRed 和 EGFP 兩種熒光蛋白表達(dá)情況。正向啟動子驅(qū)動紅色熒光蛋白 DsRed的表達(dá)，在 3 dpf 可見耳石（聽覺和體位感受器前體）處有明顯的紅色熒光信號，如圖 2A 白色箭頭所示。斑馬魚發(fā)育 5 dpf 時，嗅泡（嗅覺器官前體）和側(cè)線神經(jīng)丘（含豐富的毛細(xì)胞，感受水流和聽覺）可見明顯紅色熒光；在肝芽區(qū)也可見紅色熒光（圖 2B 和 2C）。直至 10 dpf，在耳石、嗅泡和側(cè)線神經(jīng)丘仍可觀察到明顯的紅色熒光信號。

圖 2 hHNF4α-P2 啟動子在斑馬魚胚胎中正向表達(dá)的圖譜[A：3 dpf 幼體的耳石（白色箭頭，右側(cè)面觀）；B：5 dpf 幼體的嗅泡（綠色箭頭）和側(cè)線神經(jīng)丘（白色箭頭）（背面觀）；C：5 dpf 幼體的嗅泡（綠色箭頭）、肝芽（黃色箭頭）和側(cè)線神經(jīng)丘毛細(xì)胞（白色箭頭）（右側(cè)面觀）]Figure 2 Expression patterns of hHNF4α-P2 promoter in the forward transcriptional direction in zebrafish larvae [A: Otoliths (3 dpf, white arrows, right lateral view); B: Olfactory bulbs (green arrows) and neuromasts (white arrows) (5 dpf, dorsal view); C: Olfactory bulb (green arrow), liver bud (yellow arrow) and neuromasts of hair cells (white arrows) (5 dpf, right lateral view)]

斑馬魚胚胎注射 pP2r-EGFP（P2 啟動子上游反向插入的綠色熒光蛋白編碼序列的表達(dá)構(gòu)件）后，于 16 hpf 開始在胚胎的腦部、心臟、脊索和表皮等部位表達(dá)。隨著斑馬魚胚胎發(fā)育，綠色熒光信號明顯出現(xiàn)在多個組織器官：表皮細(xì)胞、神經(jīng)管、腦神經(jīng)細(xì)胞、體節(jié)（肌節(jié)為主）、脊索細(xì)胞和血液細(xì)胞（圖 3）。這些部位的綠色熒光信號可以持續(xù)至 10 dpf。此結(jié)果提示，反向啟動子所驅(qū)動的基因可能主要在中胚層和外胚層來源的早期組織器官表達(dá)。

圖 3 hHNF4α-P2 啟動子在斑馬魚胚胎中反向表達(dá)的圖譜[A：24 hpf 的血細(xì)胞（白色箭頭）和心臟（淺藍(lán)色箭頭）；B：24 hpf 的心臟（淺藍(lán)色箭頭）、神經(jīng)管（紅色箭頭）和脊索（白色箭頭）；C：24 hpf 的表皮（黃色箭頭）和脊索細(xì)胞（粉紅色箭頭）；D：24 hpf 的體節(jié)（黃色箭頭）和血細(xì)胞（白色箭頭）；E：48 hpf 的表皮（黃色箭頭）和脊索細(xì)胞（粉紅色箭頭）；F：48 hpf 腦部神經(jīng)元（紅圈）和表皮細(xì)胞（淺藍(lán)色圈）；G：48 hpf 腦部神經(jīng)元（紅圈）；F 與 G 分別為同一視野的熒光圖像（激發(fā)光波長：488 nm）和可見光圖像]Figure 3 Expression patterns of hHNF4α-P2 promoter in the reverse transcriptional direction [A: Haemocytes (white arrow) and heart (light-blue arrow), 24 hpf; B: Neural tube (red arrows), notochordal cells (white arrow) and heart (light-blue arrow), 24 hpf; C: Epiderm cells (yellow arrow) and notochordal cells (pink arrow), 24 hpf; D: Somites (yellow arrow) and haemocytes (white arrow), 24 hpf; E: Epiderm (yellow arrow) and notochordal cells (pink arrow), 48 hpf; F: Brain cells (red circle) and epiderm cells (light-blue circle), 48 hpf; G: Brain cells (red circle), 48 hpf; G is the same view of the fluorescent (Ex: 488 nm) image with F under the white light]

2.3 hHNF4α-P2 正向啟動子核心啟動序列分析

為尋找 P2 啟動子的核心啟動序列，我們對P2 序列進(jìn)行了系列缺失突變，并將截短的啟動子序列以相同的酶切位點連入雙向表達(dá)載體中。通過斑馬魚體內(nèi)暫態(tài)基因表達(dá)實驗發(fā)現(xiàn) P2 DNA –529～ –587 序列（僅 58 個堿基）的正向序列具有轉(zhuǎn)錄功能。對此段正向啟動區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄元件分析，發(fā)現(xiàn)該段啟動區(qū)域無典型的 TATA box 元件，但存在典型的轉(zhuǎn)錄起始元件（initiator element，INR）[9]，推測此段序列可能是正向轉(zhuǎn)錄的核心序列，將此基因表達(dá)構(gòu)件命名為 pP2bi/f.Core-EGFP/DsRed（圖 4）。進(jìn)一步連續(xù)觀察此基因構(gòu)件在斑馬魚 1 ～5 dpf 的表達(dá)情況，可觀察到 4 dpf 在胚胎的耳石、肝芽區(qū)（圖 4B）和嗅泡（圖 4C）有明顯的紅色熒光信號，且表達(dá)持續(xù)時間與 1.3 kb 正向啟動子表達(dá)構(gòu)件相當(dāng)，可持續(xù)至10 dpf。

對該基因構(gòu)件反向表達(dá)情況的觀察，未發(fā)現(xiàn)GFP 表達(dá)現(xiàn)象。說明此段反向序列不具有獨立轉(zhuǎn)錄功能。

2.4 hHNF4α-P2 反向啟動子核心啟動序列分析

同樣，我們進(jìn)一步通過序列缺失實驗和序列預(yù)測軟件分析尋找反向 P2 的核心啟動序列，發(fā)現(xiàn)P2 反向啟動子序列存在兩段核心啟動區(qū)域，分別命名為 hnf4α-r-Core1 和 hnf4α-r-Core2；隨后分別構(gòu)建了以這兩段序列為啟動子序列，指導(dǎo) GFP 基因表達(dá)的載體（圖 5A 和 5D），并檢測了其在斑馬魚幼體內(nèi)的表達(dá)分布。如圖 5C 所示，位于 –797～–976 反向 DNA 序列中存在 179 bp 的反向核心啟動區(qū)域 1，其表達(dá)圖譜與克隆的 P2 反向啟動子表達(dá)圖譜類似，GFP 可在表皮、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液細(xì)胞、體節(jié)和脊索細(xì)胞表達(dá)（圖 5B）。就表達(dá)時間而言，該核心啟動序列可驅(qū)動 GFP 在器官發(fā)育的早期表達(dá)（12 ～ 16 hpf 開始表達(dá)）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該核心區(qū)域并沒有典型的核心啟動子序列，但存在 TFII B 識別元件[10]、INR 及下游啟動子元件（圖 5C）[11]。

如圖 5F 所示，P2 –355 ～ –529 序列之間存在175 bp 的反向核心啟動區(qū)域 2；其驅(qū)動的綠色熒光信號也主要出現(xiàn)在血液細(xì)胞、腦部神經(jīng)元、表皮、體節(jié)和脊索細(xì)胞等中胚層來源的組織（圖 5E），且僅在 2 dpf 的斑馬魚胚胎中可以觀察到綠色熒光信號，提示其轉(zhuǎn)錄活性主要在胚胎發(fā)育的中后期。對該段序列的啟動子結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示該段序列具有典型的核心啟動子序列，并存在兩個 BRE 位點（圖 5F）。上述結(jié)果提示，這兩段反向轉(zhuǎn)錄核心序列均具有獨立啟動轉(zhuǎn)錄的作用，且其表達(dá)部位或組織靶向性類似。

對這兩個基因構(gòu)件以及其他 P2 系列缺失基因構(gòu)件的正向表達(dá)報告蛋白 DsRed 的觀察，斑馬魚胚胎到幼體階段未見紅色熒光出現(xiàn)的現(xiàn)象。說明這些正向序列不具有獨立轉(zhuǎn)錄功能。

圖 4 hHNF4α-P2 正向核心啟動子區(qū)域（–587 ～ –529）的轉(zhuǎn)錄功能[A：hHNF4α-P2 正向核心啟動域（–587 ～ –529）雙向表達(dá)構(gòu)件（pP2bi/f.Core-EGFP/DsRed）示意圖；B：hHNF4α-P2 正向核心啟動域（–587 ～ –529）介導(dǎo)的紅色熒光蛋白 DsRed 在 4 dpf 斑馬魚幼體的耳石（白色箭頭）和肝芽區(qū)（黃色箭頭）處表達(dá)；C：hHNF4α-P2 正向核心啟動域（–587 ～ –529）介導(dǎo)的紅色熒光蛋白 DsRed 在 4 dpf斑馬魚幼體的嗅泡（白色箭頭）處表達(dá)；D：P2 正向啟動子核心啟動區(qū)域（–587 ～ –529）的 DNA 序列和 INR 位點圖]Figure 4 Transcription action of hHNF4α-P2 forward core region sequence (–587 - –529) [A: Construct scheme of bidirectional fluorescent reporter gene expression driven by hHNF4α-P2 promoter core region (pP2bi/f.Core-EGFP/DsRed); B: DsRed protein driven by the truncated P2 sequence (–587 -–529) in the forward transcriptional direction expressed at otolith (white arrows), liver bud (yellow arrow) in zebrafish embryos at 4 dpf; C: DsRed protein driven by the truncated P2 sequence (–587 - –529) in the forward transcriptional direction expressed at olfactory bulb (white arrows) in zebrafish embryos at 4 dpf; D: Sequence of promoter core region and INR site in P2 forward DNA sequence]

3 討論

HNF4α 作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可激活上百個基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，不僅參與糖、脂肪和膽汁酸等物質(zhì)的代謝，還對組織器官的早期分化和功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]。在胚胎發(fā)育過程中，HNF4α 的P1 和 P2 啟動子所介導(dǎo)的 HNF4α 不同亞型具有時間和組織表達(dá)特異性[13]，例如由 P2 啟動子介導(dǎo)的亞型 HNF4α7 在胚胎發(fā)育早期在肝臟中具有較高的表達(dá)量，而在成年的肝臟中卻難以檢測到。但該亞型在成年的胃、小腸和胰腺等器官中有穩(wěn)定的表達(dá)。由 HNF4α-P1 啟動的 HNF4α1 則具有較強(qiáng)的成體肝組織表達(dá)的特異性[5,14-15]。然而，對于HNF-4α 兩個啟動子在早期胚胎中的表達(dá)圖譜尚無系統(tǒng)的研究。本文對 HNF4α-P2 1.3 kb 的啟動序列在早期胚胎中的表達(dá)圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該段序列具有顯著的組織特異性，主要在斑馬魚外胚層來源的感官神經(jīng)細(xì)胞有較強(qiáng)的表達(dá)，提示 P2 啟動子所介導(dǎo)表達(dá)的 HNF4α 亞型可能對外胚層來源的神經(jīng)感覺器的早期發(fā)育和分化具有重要的調(diào)控功能。

圖 5 hHNF4α-P2 反向核心啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄功能[A：hHNF4α-P2 反向核心啟動域 1（–797 ～ –976）雙向表達(dá)構(gòu)件（pP2bi/r.Core1-EGFP/DsRed）示意圖；B：hHNF4α-P2 反向核心啟動域 1 介導(dǎo)的綠色熒光蛋白 EGFP 在 2dpf 斑馬魚胚胎的血細(xì)胞（黃色箭頭）、表皮（粉色箭頭）、神經(jīng)管細(xì)胞（紅色箭頭）以及在 3 dpf 胚胎的脊索細(xì)胞（白色箭頭）中的表達(dá)；C：hHNF4α-P2 反向核心啟動域 1（–797 ～ –976）的序列和 BRE、INR 及 DPE位點；D：hHNF4α-P2 反向核心啟動域 2（–355 ～ –529）雙向表達(dá)構(gòu)件（pP2bi/r.Core2-EGFP/DsRed）示意圖；E：hHNF4α-P2 反向核心啟動域 2 介導(dǎo)的綠色熒光蛋白 EGFP 在 2 dpf 斑馬魚胚胎的腦神經(jīng)元（紅色箭頭）、脊索細(xì)胞（白色箭頭）、血細(xì)胞（黃色箭頭）和 3 dpf 胚胎的體節(jié)細(xì)胞（淺藍(lán)色箭頭）中的表達(dá)；F：P2 反向核心啟動域 2（–355 ～ –529）的序列和BRE及核心啟動子位點]Figure 5 Transcription action of hHNF4α-P2 promoter reverse core region sequences [A: The scheme of bidirectional expression driven by hHNF4α-P2 promoter reverse core region 1 (–797 - –976) (pP2bi/r.Core1-EGFP/DsRed); B: EGFP driven by the P2 core promoter region 1 in the reverse transcriptional direction expressed at haemocytes (yellow arrows), epidermis (pink arrows), neural tube (red arrow) in zebrafish embryos at 2 dpf, and expressed at notochord (white arrows) in zebrafish embryos at 3 dpf; C: Sequence of the reverse core promoter core region 1 (–797 - –976) in P2 reverse-directional DNA and sites of BRE, INR and DPE; D: The scheme of bidirectional fluorescent reporter gene expression driven by hHNF4α-P2 promoter reverse core region 2 (–355 - –529) (pP2bi/r.Core2-EGFP/DsRed); E: EGFP driven by the P2 core promoter region 2 (–355 - –529) in reverse transcriptional direction expressed at brain cells (red arrows), notochordal cells (white arrows), haemocytes (yellow arrow) at 2 dpf, and expressed at somites (myotomes) (light-blue arrows) in zebrafish embryos at 3 dpf; F: Sequence of the reverse promoter core region 2 (–355 - –529) in P2 reverse-directional DNA and sites of BRE and core promoter]

雙向啟動子是位于兩個相鄰基因之間的具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的 DNA 序列。在一定條件下，雙向啟動子可以分別驅(qū)動或指導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄，這兩個相鄰基因編碼序列分別位于對方編碼鏈（正義鏈）的互補(bǔ)鏈上，因而它們的轉(zhuǎn)錄方向相反。雙向啟動子在哺乳動物基因組中并不少見，約有 10%的蛋白編碼基因的啟動子具有雙向啟動活性[11]，且大多數(shù)雙向啟動區(qū)序列小于 500 bp[16]。在人類基因組中，約有 76% 的啟動子核心序列缺少典型的TATA box 樣元件，并且這一類啟動子所啟動的基因通常為管家基因；而僅有 10% 的啟動序列具有典型的 TATA box，該類啟動子啟動的表達(dá)通常受到嚴(yán)格的調(diào)控[9]。本研究第一次發(fā)現(xiàn)了人的 HNF4α II 型啟動子序列的雙向轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。我們的研究結(jié)果提示，該雙向啟動子調(diào)控功能有明確的分工，或者說這段啟動子 DNA 序列的正、反向作用靶位具有明顯的組織特異性/靶向性的差異。該正向啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄的基因可能參與了神經(jīng)感官組織受器官和肝臟的發(fā)育和分化相關(guān)的基因表達(dá)，而其反向啟動子則活化與表皮、脊索和血液等發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。通過對所克隆的 P2 正、反鏈 DNA 序列進(jìn)行核心啟動序列預(yù)測和體內(nèi)缺失實驗，證明該P(yáng)2 正、反向序列具有雙向啟動子的序列特征。P2啟動序列所顯示的雙向時空表達(dá)的差異性，也提示P2 雙向驅(qū)動功能對于胚胎階段的不同器官的同時發(fā)生和發(fā)育具有協(xié)調(diào)作用。

雖然在斑馬魚胚胎中的這段 hHNF4α-P2 序列的表達(dá)圖譜并不一定完全反映該段啟動序列在人胚胎發(fā)育中的情況，但是就基因結(jié)構(gòu)與功能的保守性而言，可能存在一些相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本文在一定程度上豐富了對 hHNF4α-P2啟動子的理解，也為該基因功能的研究提供了新的思路。

志謝 感謝孟杰技師在實驗動物斑馬魚的提供和管理方面的有力保障。

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Characterization of bidirectional transcription of human hepatocyte nuclear factor 4 alpha P2 promoter

ZHAO Qiong, JIANG Jian-dong, ZHANG Jing-pu

ObjectiveTo explore the bidirectional transcriptional function of human hepatocyte nuclear factor 4 alpha (hHNF4α) P2 promoter.MethodsThe P2 promoter partial sequence of hHNF4α from –23 to –1291, totally 1268 bp was cloned. Bidirectional transcription vectors were constructed in eukaryotic expression vectors via linking the fluorescent protein genes, EGFP and DsRed, to both the upstream or/and downstream of the P2 DNA sequence, respectively. They were named pP2f/hnf4-EGFP (pP2f-EGFP) for the forward transcription, pP2r/hnf4-EGFP (pP2r-EGFP) for the reverse transcription and pP2bi/hnf4-EGFP/DsRed (pP2bi-EGFP/DsRed) for the bidirectional transcription. Then, pP2f-EGFP and pP2r-EGFP were separately transfected into L02 and Huh7 cells, and pP2bi-EGFP/DsRed was microinjected into zebrafish embryos to profile the time- and tissue-specific expression patterns of P2 promoter at both transcriptional directions in zebrafish embryonic development. Core promoter regions were identified by a series of P2 sequence deletion experiments and combining with sequence prediction of promoter core regions by http://www. fruitfly.org/ online.

ResultsFluorescent reporters was expressed driven by either the forward or the reverse directional transcription of hHNF4α-P2 promoter in human normal hepatocyte cell line L02 and hepatoma cell line Huh7. Furthermore, transcriptional patterns in the forward and reverse directional transcription of the P2 promoter were examined in zebrafish embryos by the P2 bidirectional transcription construct pP2bi-EGFP/DsRed. The results showed that EGFP, as the reverse-directional reporter, started to express at the stage of 16 hpf in embryonic organs derived from mesoderm and ectoderm, such as blood cells, neurons, epidermis, somites and notochord cells; meanwhile, DsRed, as the forward-directional reporter, expressed intensively in otolith, olfactory bulb and hair cells of neuromasts in the lateral lines which developed from ectoderm, and also expressed moderately in liver bud which originated from endoderm. The expressions of both forward- and reverse-directional transcriptions sustained to at least 10 dpf. Only one core promoter region (–529 - –587) was found in the P2 sequence of forward transcriptional direction, and its expression pattern was as same as that of pP2f-DsRed construct. Also, two core promoter regions existed in the complementary strand sequence of P2 promoter (–23 - –1291), and one of them (–797 - –976) showed the same expression pattern as pP2r-EGFP pattern, while the other one (–355 -–529) lacked signal in neurons and showed relatively delayed expression compared to pP2r-EGFP pattern.

ConclusionThis is the first report on the bidirectional transcription of hHNF4α-P2 promoter (–23 - –1291) in developmental stageand tissue-specific manner in zebrafish.

Human hepatocyte nuclear factor 4 alpha; Gene expression; Zebrafish; Bidirectional promoter

ZHANG Jing-pu, Email: zhangjingpu@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.001

國家自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金（81321004）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81373453）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（趙瓊、張靖溥），藥物研究所（蔣建東）

張靖溥，Email：zhangjingpu@imb.pumc.edu.cn

2017-03-16

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(3):193-200

Author Affiliations: Institute of Medicinal Biotechnology (ZHAO Qiong, ZHANG Jing-pu), Institute of Materia Medica (JIANG Jian-dong), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):193-200