馬鑫，譚松林，邢虎成，2，3*，廖少波

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學苧麻研究所，長沙 410128；2.湖南省種質(zhì)資源創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)研究所，長沙 410128）

苧麻實時定量 PCR體系的建立

馬鑫1，譚松林1，邢虎成1，2，3*，廖少波1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學苧麻研究所，長沙 410128；2.湖南省種質(zhì)資源創(chuàng)新與資源利用重點實驗室，長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)研究所，長沙 410128）

熒光定量 PCR技術目前應用比較廣泛，但是 RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、擴增效率和內(nèi)參基因的選擇等都會影響實時熒光定量 PCR技術的準確性。研究以 3個苧麻品種為材料，采用 actin作為內(nèi)參基因，利用 2個苧麻基因進行實時定量 PCR體系的建立。結果表明，采用試劑盒法提取的 RNA可以滿足 RT－qPCR技術的要求，擴增曲線和熔解曲線都符合實驗要求，actin基因可以作為內(nèi)參進行苧麻相對定量分析研究。相對定量分析表明，研究建立的 RT－qPCR方法可以應用于基因表達水平的研究。該研究為實時定量 PCR在苧麻中的應用提供了參考。

苧麻；實時定量 PCR；RNA

熒光定量 PCR技術（也叫 RT－qPCR技術）的概念是在 1992年提出的［1］。1995年，美國 PE（Perkin Elmer）公司開發(fā)了 TaqMan熒光探針定量技術，提高了檢測的特異性和靈敏度，使熒光定量 PCR 實 現(xiàn) 了 “實時”（real－time）［2］。1996年又 推 出了首 臺熒光 定量 PCR檢 測系 統(tǒng)，自 此real－time PCR技術才得以真正的推廣和應用［3］。實時熒光定量 PCR與傳統(tǒng)的定量技術（如半定量 PCR）相比，具有重復性好、特異靈敏、定量準確、操作簡便，以及對樣品污染小和自動化程度高等優(yōu)點。該技術現(xiàn)已在基礎科學研究、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和食品安全檢測、醫(yī)學診斷、藥物研發(fā)、海關檢驗檢疫等科研和實踐領域得到廣泛應用［2，3－8］。

實時熒光定量分析包括絕對定量和相對定量。相對定量不是測定樣品的絕對拷貝數(shù)，而是通過比較樣品之間同一目的基因的相對表達量，來分析樣品之間目的基因的表達差異。該技術在基因表達差異分析方面具有巨大優(yōu)勢。而 RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率、擴增效率和內(nèi)參基因的選擇等都會影響實時熒光定量 PCR技術的準確性［9］。

苧麻（Boehmeria nivea（L.）Gaud）是起源于中國的多年生草本植物，主要以收獲纖維為目的來栽培，還可以用于造紙，做飼料，生產(chǎn)工業(yè)酒精，以及入藥等［10］。苧麻含有大量的多糖、色素、酚類等物質(zhì)，RNA提取難度較大，目前已報道的方法有 CTAB法［11］，Trizol試劑法［12］，RNAplant試劑法［13］，這些方法耗時、人力成本較高，且前期準備工作復雜，實驗難度大，初學者很難掌握?，F(xiàn)如今植物 RNA的提取也越來越商業(yè)化，有些公司開始推出一些試劑盒，能夠較為簡單方便的提取植物體內(nèi) 的 RNA［14］。本 研 究 通 過 試 劑 盒 法 對 苧 麻 不 同 品 種 不 同 部 位 進 行 RNA 的 提 取，并 就real－time PCR體系的建立進行探索，以期為苧麻實時熒光定量 PCR技術的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

苧麻材料為彎子苧麻、園青 5號、大葉綠 MS1的莖尖、葉、皮和骨。所有苧麻材料均于 2016年5月取自湖南農(nóng)業(yè)大學耘園試驗基地。所取材料經(jīng)自來水和蒸餾水洗凈后，將莖尖、葉、皮和骨分離后用液氮迅速冷凍，保藏于 －80℃超低溫冰箱，用作 RNA提取的材料。

植物 RNA提 取 試 劑 盒 （Transgen），cDNA合成 試劑 盒 （Transgen），熒 光 定 量 PCR試劑 盒（Transgen），其他生化試劑均購自全式金（Transgen）生化試劑公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，real－time PCR使用的引物見下表 1。

表1 引物列表Tab.1 The primers used in this paper

1.2 RNA提取

將相應質(zhì)量（見樣品要求）植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，按照植物 RNA提取試劑盒（Transgen）說明書的要求提取 RNA，提取的 RNA置于 －80℃保存。

1.3 RNA純度、產(chǎn)率和完整性檢測

取 1 uLRNA樣品，微量分光光度計（NANO 100，中國）測其230、260、280 nm下的吸光度值，并計算 A260／A280和 A260／A230比值及濃度。根據(jù)檢測的濃度值，按照每克植物材料提取的 RNA總量算出其產(chǎn)率。

取所得的 RNA約 2μL，加 2μL無 RNAase的水和 1μL 6×loading buffer后于 1.2%的瓊脂糖膠、l×TBE電泳緩沖液中電泳檢測總 RNA的完整性。電壓為 6 V／cm，電泳 15～20 min后，凝膠成像儀照相分析（Kodak GL2002，美國）觀察和拍照。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及 real－time PCR體系的建立

分別取 3個不同苧麻種質(zhì)的各組織 RNA 1 ug，按照 cDNA合成試劑盒（TransgenAT311貨號）上的說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄。反應體系為 20μL，反轉(zhuǎn)錄完成后再加無菌水稀釋 8倍成 160μL。

實時熒光定量 PCR采用 ABI7500熒光定量 PCR儀，試劑采用 Transgen公司的熒光定量 PCR試劑盒。按照說明書進行操作，參照基因為苧麻 actin基因序列。首先對引物的特異性進行普通PCR驗證，PCR體系按照 EASY Taq酶（Transgen公司）說明書的要求設置，擴增程序為 95℃預變性 3 min，38個循環(huán)的程序為 95℃變性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s。然后用驗證后的引物在上進行 Realtime PCR，體系為 20μL，擴增程序 95℃預變性 3 min，40個循環(huán)的程序為 95℃變性30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 excel進行統(tǒng)計和分析。熔解曲線、擴增曲線由 ABI 7500分析軟件制作。相對表達量的計算以 actin為內(nèi)參基因，計算 Ct值（Ct代表目標擴增產(chǎn)物達到設定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），參照魏敏［15］計算方法，得到 RQ值（表達量變化倍數(shù)）。即通過計算△Ct（△Ct＝Ct目的基因 －Ct內(nèi)參），然后獲得△△Ct（△△Ct＝△Ct（實驗組）－△Ct（對照組），再計算 RQ值（RQ＝2－△△Ct），用 Ct3次重復的平均值作為該基因在該處理組的表達量，并計算 RQ的誤差。

2 結果與分析

2.1 RNA提取率

由表 2可以看出，本試驗提取出的苧麻 RNA濃度最大值為1759.81 ng／μL，最小值為137.31 ng／μL，提取出的 RNA質(zhì)量最大的為 79191.36 ng，質(zhì)量最小的為 5492.4 ng，而提取率最大為 58.23%，最小值為 5.42%。從圖 1可以看出，提取出的 RNA的量與取樣量有直接的關系，但是苧麻部位不同取樣量之間也有差距。例如骨的取樣，在 0.1～0.13 g時取樣越多，提取出的 RNA濃度越高，但是到了 0.14 g與 0.17 g時又會降低，在取最大值 0.2 g時，濃度達到最高。皮則和骨有差異，在 0.1～0.14 g時，隨著取樣量的增加提取的 RNA濃度也變大，而在取樣量達到最大值0.15 g時，提取的 RNA濃度又降到最低。葉在 0.1～0.11 g和 0.13～0.14 g時濃度較高，且呈遞增順序，而在 0.12 g和 0.15 g時提取出的 RNA濃度較低。莖尖取樣量在 0.14 g時提取出的苧麻總 RNA達到最大值，取樣量在 0.11 g時提取出的苧麻總 RNA較多，而取樣量在 0.12～0.13 g和0.17 g時濃度最少也超過了 400 ng／μL。由圖 1可以看出，苧麻取樣量并不是越多越好，除骨以外，皮、葉、莖尖隨著取樣量的增加，在到達一個峰值后，提取出的苧麻總 RNA會隨著取樣量的增加而降低。

表2 苧麻不同品種不同部位提取出的 RNA濃度、質(zhì)量和提取率Tab.2 RNA concentration，quality and extraction rate from different parts of ramie

種質(zhì) 部位 RNA濃度（ng／μL） RNA提取率（%） A260／A280 A260／A230骨園青5號634.03 21.61 1.04 0.32 205.12 7.27 1.76 0.54皮137.31 5.42 1.02 0.28莖尖 1759.81 58.23 1.88 0.95葉

由圖 1和表 2可以看出，苧麻不同部位的 RNA提取率以莖尖最大，達到 29.9%；其次是葉，提取率為 17.9%；最后是皮和骨，提取率較低。皮的提取率為 6.7%，骨的提取率為 7.0%。苧麻提取出的總 RNA的平均質(zhì)量與提取率相同，都是以莖尖最多。從以上數(shù)據(jù)可以看出，提取出的苧麻總 RNA的數(shù)量與苧麻的部位有關，像莖尖和葉等 RNA含量較高的部位提取出的苧麻 RNA量也較高，而骨和皮等 RNA含量較低的部位提取出的 RNA量也較低。

圖1 苧麻不同組織 RNA提取效率及取樣量與 RNA濃度的關系Fig.1 Relationship between RNA extraction efficiency and sampling amount and RNA concentration in different tissues of ramie

2.2 RNA的純度和完整性

由表 2可知，12個組織材料中只有 7個組織 RNA提取純度較好，A260／A280都大于 1.8，其他提取的組織有蛋白質(zhì)或酚污染。對比 A260／A230的值可以知道，所有樣品的 RNA均有鹽或異硫氰酸胍的污染，使得 A260／A230的值都小于 1.5。因此該方法提取的苧麻雖總 RNA提取率高，但純度不夠，不僅不能將所有苧麻內(nèi)的蛋白質(zhì)完全分離，而且提取過程中用到的異硫氰酸胍也有殘留。取 1μL RNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析，RNA都能夠正常的跑出條帶，28S rRNA的亮度是18S rRNA的兩倍，完整性較好。

圖2 苧麻 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ramie RNA

2.3 實時定量 PCR擴增曲線和熔解曲線分析

實時熒光定量 PCR技術整個反應過程可分為熒光背景信號、熒光信號指數(shù)擴增和平臺期3個階段。由圖 3可知，3對引物 RT－qPCR擴增曲線都存在背景信號階段，此時 PCR擴增產(chǎn)生的熒光信號弱，無法檢測產(chǎn)物量的變化，在圖上表現(xiàn)為高低起伏的雜亂線。而進入平臺期后，擴增產(chǎn)生的熒光信號穩(wěn)定，不再增加，在圖上表現(xiàn)為平行于 X軸的線；在熒光背景信號和平臺期之間的是熒光信號指數(shù)擴增階段，擴增產(chǎn)物量的指數(shù)與模板數(shù)呈線性關系，在圖 3中表現(xiàn)為指數(shù)曲線。因此 3對引物在3個苧麻品種的不同器官組織中都進行了有效的擴增。

為了檢測擴增產(chǎn)物的特異性，避免 qPCR擴增過程中非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號造成假陽性結果，本文對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析。由圖 4可知，18197、15247和 actin基因在不同苧麻品種的不同器官中的擴增產(chǎn)物熔解曲線較一致，無非特異性擴增產(chǎn)生，說明設計的引物符合試驗要求，擴增體系、退火溫度及循環(huán)程序都適合。按照本試驗的研究方法可以對苧麻的基因進行 RT－qPCR分析。

圖3 3對引物 RT－qPCR擴增曲線圖Fig.3 RT－qPCR amplification curve of 3 pairs of primers

圖4 3個基因擴增產(chǎn)物熔解曲線圖Fig.4 Dissolution curve of 3 gene amplification products

2.4 實時定量 PCR相對表達量分析

理想的內(nèi)參基因應具備下列特性：在所有組織和細胞類型中表達，在所有的環(huán)境和試驗條件下穩(wěn)定表達，具有與目標基因相似的穩(wěn)定表達水平［17］。本研究利用苧麻肌動蛋白（ACTIN）基因作為內(nèi)參，該基因在苧麻麻骨，麻皮，葉片和莖尖等不同部位都可以表達。從表 3來看，該基因在不同品種的不同器官間標準誤較?。?.20～0.520），變異率也較小（1.099～2.427）；在同一品種不同器官間的表達也表現(xiàn)為較小的標準誤（0.10～0.52）和變異率（0.514～2.447）。因此 ACTIN基因可以作為內(nèi)參進行苧麻 RT－qPCR相對定量分析研究。

采用表達量變化倍數(shù)（RQ值）對 18197和 15247兩個基因在 3個苧麻品種不同器官間的表達情況進行分析。以彎子苧麻麻骨的表達作為對照，及設定兩個基因在彎子苧麻麻骨中的表達量都是 1。由圖 5可知，18197和 15247兩個基因在苧麻不同品種不同器官間的表達量不同，在莖尖的表達量最高，而在其他部位的表達則較少，另外 15427基因的表達水平要高于 18197基因。因此本研究建立的 RT－qPCR方法可以進行基因表達水平的研究。

表3 內(nèi)參基因 ACTIN在不同品種不同器官中的表達穩(wěn)定性Tab.3 The expression stability of reference gene ACTIN in different organs in different varieties

圖5 2個基因在 3種苧麻不同器官中 RT－qPCR表達圖Fig.5 RT－qPCR expression of2 genes in different organs of3 ramie varieties

3 結論與討論

3.1 結論

本研究對苧麻不同品種不同部位進行 RNA的提取，發(fā)現(xiàn) RNA的提取量與取樣量和部位有直接的關系。苧麻不同部位的提取率以莖尖最大，達 29.9%；其次是葉，提取率為 17.90%。電泳分析表明提取的RNA完整性較好。擴增曲線分析表明2對引物在3個苧麻品種的不同器官組織中都進行了有效的擴增。熔解曲線分析表明 18197、15247和 actin基因在不同苧麻品種的不同器官中的擴增產(chǎn)物熔解曲線較一致，無非特異性擴增產(chǎn)生。對內(nèi)參基因 actin Ct值分析表明，該基因在不同品種和器官間標準誤、變異率較小，可以作為內(nèi)參進行苧麻相對定量分析研究。對 18197和15247兩個基因在苧麻不同品種不同器官間的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)兩個基因在莖尖的表達量最高，而在其他部位的表達則較少。

3.2 討論

RNA質(zhì)量是進行植物分子生物學某些方面研究的必要保證。程超華［11］報道了采用 CTAB發(fā)提取苧麻野生近緣種懸鈴葉苧麻花序 RNA的方法，RNA提取前所有器具和耗材都需要用 0.1%的DEPC水處理 15 h以上后再高溫滅菌，RNAplant［13］，pBIOZOL［16－21］，Trizol［12，22］和 Invitrogen公司的Plant RNA Reagent和 ConcertTM PlantRNA Reagent［25，27］試劑提取 RNA都需要采用同樣的辦法處理。而本試驗中采用試劑盒法提取，所有耗材均采用試劑盒提供的無核酸酶的離心管，不僅避免了使用有毒的 DEPC，又節(jié)約了時間。目前報道可以成功提取苧麻的 RNA的試劑盒有 Promega公司 SVTotal RNA Isolation System試劑盒［23，24］，OMEGA公司 Plant RNA Kit［26］，Ambiogen公司的植物RNA提取試劑盒［28］，這些試劑盒均為進口，與本研究使用的試劑盒相比成本較高。因此本研究使用試劑盒法，既可以節(jié)約人力和時間成本，價格又較低，對于需要提取多個材料進行熒光定量 PCR分析經(jīng)濟又方便。從提取所需樣品量和提取的濃度來看，CTAB法提取 0.4～0.5 g懸鈴葉苧麻葉片的 RNA得率在 13% ～15%，而使用本試驗提取的苧麻只需 0.1 g材料，獲得的 RNA濃度大于100 ng／uL，得率最低的為 5.42%，基本上可以滿足實時定量 PCR實驗對 RNA濃度的要求，這與其他人［16－28］的報道結果相似。

苧麻實時定量 PCR技術體系已有很多報道［16－25］，目前反轉(zhuǎn)錄 cDNA體系大都是 20～50 uL體系，如果檢測基因多，則 cDNA模板量不足，本實驗經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)，cDNA模板稀釋 8倍的擴增結果與不稀釋沒有顯著性差別，因此實驗選擇模板 cDNA稀釋 8倍進行熒光定量 PCR分析。

熒光定量 PCR檢測靈敏度很高，引物的優(yōu)劣對實驗影響較大，一般要求引物無非特異擴增，無引物二聚體。本實驗采用 NCBI網(wǎng)站提供的 primer－BLAST進行特異引物設計，一般引物的長度都控制在 100～300 bp［24，25］，因為產(chǎn)物越長，越容易出現(xiàn)假陽性，同時使得 Ct值出現(xiàn)較晚。但是對于有多個同源序列的基因檢測，如何避免引物形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構，錯配及避免基因組的擴增是需要考慮的，在本試驗中，引物設計時考慮了引物的長度在 18～25 bp，Tm值在 60℃左右、GC含量 40% ～60%，跨兩個外顯子等要求，所有引物擴增片段長度都在 300～500 bp，Tm值都大于 55℃，經(jīng)過熔解曲線分析表明，本試驗設計的引物可以進行熒光定量 PCR分析，這為熒光定量 PCR引物的設計提供了參考。

熒光定量 PCR分析方法有絕對定量分析法和相對定量分析法，馬雄風等［25］和劉建新等［27］都對絕對定量法進行了研究，以 cDNA和相應引物進行普通 PCR擴增，然后將 PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋用于制備標準曲線，并獲得擬合方程用于后期目的基因定量分析。本研究采用的相對定量方法與他人報道的方法相同［17－24，29］，采用的都是 2－ΔΔCt方法計算基因相對表達量。相對定量分析中內(nèi)參基因的選擇會影響 RT－qPCR的結果，用表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因進行校正和標準化可以減少樣品之間和樣品內(nèi)部的差異，從而減少樣本之間的誤差。一般來說管家基因常常作為內(nèi)參基因。在苧麻研究中，actin基因［16－20，22－24，27］，18S rRNA和 histone3基因［25，29］都可以用來做內(nèi)參基因，尤其是 actin基因使用的頻率較高。actin基因在各種類型的細胞中都能進行恒定表達，本研究也發(fā)現(xiàn) actin基因在不同品種和同一品種的不同部位表達差異都較小，作為苧麻 RT－qPCR分析的內(nèi)參是可以的，但是否有更好的內(nèi)參基因，需要進一步研究確定。

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Establishment of Real－time Quantitative PCR System for Ram ie

MA Xin1，TAN Songlin1，XING Hucheng1，2，3*，LIAO Shaobo1
（1.Ramie Institute of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Corp Germplasm Innovation and Utilization，Changsha 410128，China；3.Grass Research Institute of Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

The application of real－time quantitative PCR technology iswidely used at present.The accuracy of real－time quantitative PCR is affected by RNA quality and reverse transcription efficiency，amplification efficiency and reference gene.In this study，real－time quantitative PCR system was established using 3 ramie varieties，2 ramie gene sequence，and actin gene sequence as the reference gene. The results showed that RNA extracted by RNAkits canmeet the requirements of RT－qPCR.The amplification curve and melting curve were consistentwith the experimental requirements.Actin gene can be used as a reference for research on relative quantitative analysis of ramie.Relative quantitative analysis shows that the RT－qPCR method established in this study can be used to study gene expression level. This study can provide reference for the application of real－time quantitative PCR in ramie.

ramie；real－time PCR；RNA；

S563.1

A

1671－3532（2017）03－0111－09

2016－12－19

湖南省自然科學基金項目（2015JJ2083）

馬鑫（1989－），女，在讀碩士，主要從事麻類作物種質(zhì)資源及遺傳育種工作。E－mail：348554662＠qq.com

邢虎成（1978－），男，副教授，主要從事麻類作物種質(zhì)資源及遺傳育種工作。E－mail：xhcsoldier＠163.com