牛夢(mèng)娜, 馬紅彥, 胡 飛, 王世革, 劉 璐, 常海洲, 黃明賢

(上海理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系, 上海 200093)

研究論文

模板法制備大孔硅膠微球及其在高效液相色譜蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用

牛夢(mèng)娜, 馬紅彥, 胡 飛, 王世革, 劉 璐, 常海洲, 黃明賢*

(上海理工大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系, 上海 200093)

以弱陽(yáng)離子交換聚合物微球(WCX)為模板、N-三甲氧基硅基丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(TMSPTMA)為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑、四乙氧基硅烷(TEOS)為硅膠前驅(qū)體,在三乙醇胺弱堿催化作用下,水解縮合形成有機(jī)聚合物與二氧化硅復(fù)合微球,將此復(fù)合微球煅燒后得到大孔二氧化硅微球。探索了不同反應(yīng)條件對(duì)二氧化硅微球的形貌、表面結(jié)構(gòu)和分散性的影響;當(dāng)TMSPTMA、TEOS與三乙醇胺的體積比為1∶2∶2時(shí)可以得到孔徑在50～150 nm之間、粒徑在2 μm左右的硅膠微球。對(duì)所制備的大孔硅膠微球表面進(jìn)行C18(十八烷基二甲基氯硅烷)鍵合修飾,然后將鍵合的填料裝填到50 mm×4.6 mm的色譜柱中,考察了其對(duì)常見的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和市售大豆分離蛋白質(zhì)的分離效果,結(jié)果顯示這種填料在高效液相色譜蛋白質(zhì)分離中具有一定的潛力。

模板法;結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑;大孔二氧化硅微球;高效液相色譜;蛋白質(zhì)分離

高效液相色譜(HPLC)已發(fā)展成為生物醫(yī)學(xué)、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中最常用的分離分析手段之一。色譜柱和色譜柱填料常常被認(rèn)為是HPLC的核心,它決定著色譜分析分離的最終效果。以硅膠為基質(zhì)的固定相是目前應(yīng)用最為廣泛的高效液相色譜填料[1-3]。這主要是因?yàn)楣枘z具有良好的機(jī)械強(qiáng)度,穩(wěn)定的形貌、孔結(jié)構(gòu)和比表面積,以及其表面含有豐富的硅羥基可以很容易地進(jìn)行表面化學(xué)鍵合和修飾等特點(diǎn)。硅膠的粒徑大小、孔徑分布、比表面積等是影響HPLC分離效果的重要因素;色譜填料的孔徑尤其會(huì)影響色譜填料對(duì)不同大小分子的分離性能。近年來(lái),高壓液相色譜填料的發(fā)展主要集中在5 μm以下甚至亞微米(1.5～2 μm)級(jí)多孔[4-8]和核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球[9-11]以及毛細(xì)管整體柱[12,13]等方面,這些色譜填料在生物大分子的分離分析方面由于其快速和高效的特點(diǎn)而受到青睞。使用小粒徑填料和較長(zhǎng)的毛細(xì)管柱可以極大地提高色譜柱對(duì)多肽分子和蛋白質(zhì)的峰容量[14,15]。整體柱由于其通透性好以及傳質(zhì)速率快等優(yōu)點(diǎn)而在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用備受關(guān)注[16,17]。大孔核殼結(jié)構(gòu)硅膠微球用于蛋白質(zhì)分離既有傳質(zhì)速率快的優(yōu)點(diǎn)又避免了小粒徑填料柱壓過(guò)大的問(wèn)題[18]。粒度為1～3 μm的無(wú)孔硅膠填料可用于快速分析生物大分子[19-22];這類固定相由于表面無(wú)孔,消除了溶質(zhì)在固定相上的滯留流動(dòng),因而分離速率明顯加快;但它的不足之處在于柱容量較小。一般來(lái)講,針對(duì)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離,在填料設(shè)計(jì)上除了采用上述最新發(fā)展的某些策略外,還應(yīng)該使其具有較大的孔徑[23,24],使這些生物大分子容易擴(kuò)散到孔內(nèi)與其中的固定相發(fā)生作用,達(dá)到較高的分離度。另外,目前常用的用于蛋白質(zhì)分析的高效凝膠滲透色譜(SEC)填料主要是基于大孔硅膠[25,26]。鑒于此,本研究著力探索制備2 μm左右大孔二氧化硅(SiO2)微球的有效方法,以滿足日益增長(zhǎng)的生物醫(yī)藥大分子高效液相色譜分離分析的需求。

模板法在合成形貌可控的無(wú)機(jī)材料方面具有非常廣泛的應(yīng)用。在合成介孔二氧化硅材料領(lǐng)域,使用的模板主要有離子型表面活性劑[27-30]、非離子型表面活性劑[31,32]、有機(jī)聚合物微球[33,34]等。模板法結(jié)合不同的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑,將無(wú)機(jī)氧化物前驅(qū)體引入模板內(nèi)進(jìn)行水解聚合等反應(yīng)可以形成結(jié)構(gòu)可控的無(wú)機(jī)材料。用模板法制備的有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)合材料通過(guò)不同的方法除去模板劑,保留無(wú)機(jī)骨架,可得到不同孔結(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)材料。Meyer等[35]用經(jīng)過(guò)親水改性的多孔聚苯乙烯-二乙烯苯微球做模板合成了二氧化鈦和二氧化硅微球。He等[36]以乙二胺修飾的聚甲基丙烯酸酯微球[poly(glycidyl methacrylate-ethylene glycol dimethacrylate) (PGMA-EDMA)]作模板,利用在四正丁基溴化銨作用下產(chǎn)生的硅溶膠反應(yīng),制備了直徑為6～7 μm的單分散多孔硅膠微球,所得硅膠微球基本保持了原來(lái)聚合物微球的尺寸。最近,Xia等[37]對(duì)He等[36]的方法進(jìn)行了一些修改,他們用四乙烯五胺代替乙二胺,得到較大孔(52 nm)硅膠微球,并且在十八烷基二甲基氯硅烷 (C18)鍵合修飾后得到了較好的蛋白質(zhì)分離效果。

上述工作所采用的模板微球都是大孔微球,這樣形成的硅膠微球反而具有較小的孔徑和較大的粒徑。在本工作中,我們采用了高交聯(lián)度的弱陽(yáng)離子交換聚甲基丙烯酸酯類微球,這種微球幾乎是無(wú)孔的,但是仍然可以溶解有機(jī)物并存在一定程度的溶脹。同時(shí),這種微球含大量羧基基團(tuán),可以利用帶正電的硅烷與模板微球中羧基的靜電吸附,從而使其更容易滲透到模板微球內(nèi)部,同時(shí)有助于引入四乙氧基硅烷,通過(guò)水解和縮合等硅溶膠反應(yīng)制備聚合物與硅膠的復(fù)合微球。在這些復(fù)合微球的煅燒過(guò)程中由于硅膠骨架網(wǎng)絡(luò)的塌陷和縮聚,會(huì)形成比原來(lái)聚合物模板粒徑小很多的大孔硅膠微球。在新制備的硅膠微球表面鍵合C18后,通過(guò)考察其對(duì)蛋白質(zhì)的分離效果來(lái)評(píng)價(jià)其在高效液相色譜上的適用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

弱陽(yáng)離子交換聚合物微球(WCX)購(gòu)自鄭州英諾生物科技有限公司。甲基三乙氧基硅烷(99%)和Pluronic F127(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);四乙氧基硅烷(TEOS, 純度>99%)、三乙醇胺(分析純)和異丙醇(分析純)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲苯、鹽酸、咪唑、三氯甲烷、乙醇、氨水、十二烷基三甲基溴化銨、四甲基氯化銨、三乙胺(以上均為分析純)、四甲基氫氧化銨(25%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))和十六烷基三甲基氯化銨(化學(xué)純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-三甲氧基硅基丙基-N,N,N-三甲基氯化銨(TMSPTMA, 50%,甲醇溶液)和C18購(gòu)自美國(guó)Gelest公司。

P230II高壓恒流泵,UV230II紫外-可見檢測(cè)器,EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站(大連依利特分析儀器有限公司);VEGA3掃描電子顯微鏡(SEM) (泰思肯貿(mào)易上海有限公司), SBC-12離子濺射儀(北京中科儀器股份有限公司), TGA-50熱重分析儀(日本島津公司), ASAP 2460孔徑分析儀(上海麥克默瑞提克儀器有限公司), 50 mm×4.6 mm色譜柱管和液相色譜裝柱機(jī)(深圳正大流體機(jī)電設(shè)備有限公司), KSL箱式高溫?zé)Y(jié)爐(合肥科晶材料技術(shù)有限公司), KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)NUAIRE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔二氧化硅微球的制備

在500 mL三角瓶中,加入15 g WCX、12.5 mL TMSPTMA、25 mL三乙醇胺、200 mL去離子水和125 mL乙醇,超聲1 h;然后放入恒溫水浴鍋中于30 ℃磁力攪拌10 min,之后,在攪拌狀態(tài)下用滴液漏斗逐滴加入25 mL TEOS和75 mL乙醇的混合溶液,控制滴加速度,于30 min內(nèi)滴加完畢,繼續(xù)攪拌24 h;反應(yīng)完畢后,取出三角瓶,靜置,待顆粒自然沉降后,過(guò)濾除去清液,并用乙醇離心洗滌固體顆粒3次,80 ℃干燥12 h后在空氣氣氛中以1 ℃/min的升溫速率升溫到600 ℃,并維持在600 ℃煅燒10 h。

圖 1 大孔二氧化硅微球的制備過(guò)程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the synthesis of large-pore silica microspheres

1.2.2 表面鍵合

取2 g所得SiO2微球,用1 mol/L鹽酸浸泡攪拌2 h,并分別用水和乙醇離心洗去鹽酸,于80 ℃干燥;稱取酸化并干燥的SiO2微球1.5 g,研磨后置于250 mL三頸圓底燒瓶中,并加入100 mL干燥甲苯,于油浴鍋中磁力攪拌,升溫至120 ℃使甲苯回流10 min除水,然后加入0.6 g咪唑,攪拌10 min后用滴液漏斗在15 min內(nèi)加入1.3 g C18和50 mL甲苯的混合溶液,繼續(xù)回流攪拌懸浮液8 h。冷卻至室溫,待沉降后,過(guò)濾除去清液,加入150 mL新鮮甲苯洗滌固體顆粒,再用甲醇,甲醇/水混合液和乙醇分別離心洗滌。最后,于60 ℃真空干燥12 h,得到鍵合C18的硅膠固定相。

1.2.3 裝柱及測(cè)試

配制體積比為1∶1的異丙醇和三氯甲烷的混合液200 mL,作為勻漿液備用;取上述鍵合好的硅膠1.2 g,加入適量勻漿液,超聲3 min,然后在液壓為3.45×107Pa下裝入50 mm×4.6 mm色譜柱中,并進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離測(cè)試。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的色譜分離條件:流動(dòng)相A相為90%水-10%乙腈-0.1%三氟乙酸(均為體積分?jǐn)?shù));B相為90%乙腈-10%水-0.1%三氟乙酸(均為體積分?jǐn)?shù));流速為0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm;梯度洗脫程序:0～15.0 min, 5%B～65%B; 15.0～30.0 min,65%B。

大豆分離蛋白的色譜分離條件:流動(dòng)相A相為90%水-10%乙腈-0.1%三氟乙酸(均為體積分?jǐn)?shù));B相為90%乙腈-10%水-0.1%三氟乙酸(均為體積分?jǐn)?shù));流速為0.6 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;梯度洗脫程序:0～20.0 min, 0～70%B; 20.0～30.0 min,70%B。把市售大豆蛋白粉與流動(dòng)相A按1∶1(質(zhì)量比)混合,超聲5 min,用0.45 μm親水過(guò)濾膜(針頭注射器)濾出清液,進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔硅膠微球的制備過(guò)程和反應(yīng)機(jī)理

本研究制備的大孔二氧化硅微球的形成過(guò)程見圖1。以弱陽(yáng)離子交換聚合物微球?yàn)槟０?TMSPTMA為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑,TEOS為硅膠前驅(qū)體,在三乙醇胺弱堿催化作用下,水解縮合形成有機(jī)聚合物與二氧化硅的復(fù)合微球,然后通過(guò)煅燒得到大孔二氧化硅微球。

圖 2 微球的掃描電子顯微鏡(SEM)照片F(xiàn)ig. 2 Scanning electron microscopy (SEM) images of microspheres a. templating polymer microspheres (WCX); b. polymer/silica hybrid microspheres before calcination; c. calcination under N2 at 400 ℃; d. calcination under air at 600 ℃.

本文所使用的WCX模板的形貌如圖2a所示,可以看出,這些模板微球雖然表面有些塌陷,但基本是無(wú)孔的。所形成的聚合物-二氧化硅雜化微球煅燒之前的形貌如圖2b所示,與原來(lái)WCX微球比較,復(fù)合微球體積增大并且表面變得粗糙。圖2c是復(fù)合微球在氮?dú)獗Ｗo(hù)下400 ℃煅燒后的結(jié)果,此時(shí)有機(jī)聚合物經(jīng)過(guò)碳化和硅膠骨架塌陷,顆粒粒徑縮小,表面出現(xiàn)皺褶結(jié)構(gòu),微球呈現(xiàn)黑色。當(dāng)在空氣氣氛中煅燒溫度為600 ℃時(shí)(見圖2d),微球進(jìn)一步縮小,并呈現(xiàn)白色,說(shuō)明有機(jī)聚合物都已經(jīng)去除。

以TMSPTMA作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑,分子一端帶正電,可以與聚合微球中的羧基陰離子通過(guò)靜電引力結(jié)合,進(jìn)入有機(jī)聚合物內(nèi)部;另一端有三甲氧基硅基,水解后形成硅羥基,可以與進(jìn)入微球內(nèi)的TEOS在水解后產(chǎn)生相互縮聚反應(yīng),形成聚合物與二氧化硅的復(fù)合微球。圖3為所涉及的化學(xué)反應(yīng)方程。

圖 3 制備中所涉及的反應(yīng)方程Fig. 3 Chemical equations in the synthesis

2.2 大孔硅膠微球的制備及條件優(yōu)化

首先,我們考察了不同堿性催化劑的影響,圖4為所得到的硅膠產(chǎn)物的SEM照片,各硅膠產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的堿性催化劑如下:A1,三乙胺;A2,四甲基氫氧化銨;A3,氨水;其他(B1、B2、B3、C1和C2),三乙醇胺。從圖4可以看出,只有三乙醇胺作催化劑才能形成均勻的硅膠微球。使用其他幾種催化劑時(shí)均生成多種納米級(jí)的細(xì)小顆粒,這些納米顆粒的一部分附著于已經(jīng)形成的相對(duì)較大的顆粒上,使得樣品黏結(jié)在一起,不利于微米級(jí)二氧化硅成球。據(jù)文獻(xiàn)[38,39]報(bào)道,三乙醇胺會(huì)與硅羥基作用,限制硅羥基之間的縮合反應(yīng),降低其反應(yīng)速率,有利于均勻球形結(jié)構(gòu)的形成。

圖 4 合成的硅膠產(chǎn)物的SEM照片F(xiàn)ig. 4 SEM images of the products of synthesis Base catalysts: A1, trimethylamine; A2, tetramethylammonium hydroxide; A3, NH35H2O; B1, B2, B3, C1 and C2, triethanolamine. Structure directing agents: A1, A2, A3, C1, C2 and B3, TMSPTMA; B1, TMAC and DTAB; B2, F127 and CTAC. Silica precursors: A1, A2, A3, B1, B2, B3 and C1, TEOS; C2, methyltriethoxysilane (MTEOS).

其次,我們考察了不同結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑的影響。B1所用的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑為四甲基氯化銨(TMAC)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)的混合表面活性劑,B2是F127和十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)的混合表面活性劑;B3為TMSPTMA。B1、B2使用了體積較大的陽(yáng)離子表面活性劑分子,其結(jié)果都是產(chǎn)生殼層結(jié)構(gòu)?？赡苡袃煞N解釋:一種是由于F127、 DTAB和CTAC等分子疏水鏈較長(zhǎng),不容易進(jìn)入聚合物內(nèi)部,導(dǎo)致其在聚合物表面形成硅膠涂覆層;另一種是陽(yáng)離子表面活性劑在溶液里形成膠束,TEOS水解產(chǎn)物在膠束中共同縮聚,然后吸附到WCX表面,因此只能在表面形成殼層結(jié)構(gòu)的硅球。而TMSPTMA本身帶正電且分子較小,可以進(jìn)入WCX內(nèi)部,與其中的羧基作用的同時(shí),形成二氧化硅骨架;這樣更有利于TEOS及其水解產(chǎn)物進(jìn)入到聚合物微球內(nèi)部,進(jìn)一步在其內(nèi)部和表面縮聚形成聚合物-硅膠復(fù)合微球。

最后,我們考察了不同硅膠前驅(qū)體的影響。C1為TEOS, C2為甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)。從圖4可以看出,使用MTEOS得到的硅膠微球分散性好,所得顆粒表面較光滑;而使用TEOS所得的硅膠微球有較深的表面皺褶和大孔結(jié)構(gòu)。我們推測(cè)四乙氧基硅烷形成剛性硅膠骨架,煅燒時(shí)原位塌陷使其表面出現(xiàn)皺褶結(jié)構(gòu)。甲基三乙氧基硅烷形成較柔性骨架,加熱過(guò)程中不斷收縮,最終形成比較致密的結(jié)構(gòu)而使其表面比較光滑。我們通過(guò)孔徑分析儀測(cè)定C1硅膠的孔徑,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的孔徑峰值,只是在50～150nm區(qū)間有一個(gè)鼓包,說(shuō)明其孔徑分布不規(guī)則。另外,測(cè)得的BET比表面積為230 m2/g。

對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化后發(fā)現(xiàn):當(dāng)TMSPTMA作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑,TEOS作為硅膠前驅(qū)體,三乙醇胺作為催化劑,并且控制他們之間的體積比為1∶2∶2時(shí),可以重復(fù)得到均勻、大孔、2 μm左右的硅膠微球。

圖 5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的色譜圖Fig. 5 Chromatogram of a standard protein mixture 1. trypsin inhibitor; 2. insulin; 3. cytochrome c; 4. lysozyme; 5. α-lactalbumin.

2.3 大孔硅膠微球的色譜性能評(píng)價(jià)

本研究的目標(biāo)是制備2 μm左右的大孔硅膠微球,用于高效液相色譜蛋白質(zhì)的分離。圖5是幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的色譜圖,可以看出所合成的硅膠微球經(jīng)C18表面鍵合修飾后,可以高效分離蛋白質(zhì)。需要指出的是本方法所制備的液相色譜填料為表面多皺褶,屬于大孔深孔型,并且孔徑分布不規(guī)則,這些孔在一定程度上會(huì)產(chǎn)生渦流擴(kuò)散項(xiàng)和溶質(zhì)的滯留效應(yīng),對(duì)色譜柱的柱效產(chǎn)生不利影響;但對(duì)于大分子化合物的分離,這些效應(yīng)有所減緩,并且大孔對(duì)大分子化合物的滲透具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖 6 大豆分離蛋白樣品的色譜圖Fig. 6 Chromatogram of a soybean protein isolation sample

大豆分離蛋白(soybean protein isolation, SPI)是將大豆除去大豆油和水溶性非蛋白質(zhì)成分后得到的一種高蛋白質(zhì)含量的混合物[40];它既可作為營(yíng)養(yǎng)食品,又可以用來(lái)制備環(huán)境友好的天然高分子材料[41]。由于其組分復(fù)雜,加上不同的原料來(lái)源以及不同的加工過(guò)程,導(dǎo)致大豆原蛋白降解的程度不同,大豆分離蛋白的組成也不盡相同。圖6為市面上一種大豆分離蛋白的色譜分離結(jié)果。這種分離雖然不能給出完全的分離和各組分的定性分析,但是可以給出部分組成和含量分布信息,從而對(duì)其質(zhì)量控制有一定的參考意義。

3 結(jié)論

本研究發(fā)展了一種利用模板法制備均勻、大孔和粒徑為2 μm左右硅膠微球的方法。以掃描電子顯微鏡為表征方法對(duì)所制備的新型硅膠微球進(jìn)行了測(cè)試表征和制備條件的優(yōu)化,提出了硅膠微球形成的機(jī)理。并對(duì)所制備的硅膠微球進(jìn)行了C18鍵合修飾和高效液相色譜蛋白質(zhì)分離評(píng)價(jià)。本工作的意義在于揭示了可以采用高度交聯(lián)的聚合物微球模板來(lái)合成亞微米級(jí)大孔硅膠微球?？梢栽O(shè)想,通過(guò)對(duì)聚合物模板進(jìn)行質(zhì)量控制和使用更均勻的聚合物模板,以及對(duì)所制備的大孔硅膠微球進(jìn)行篩分精制和水熱后處理,完全可以制備出高質(zhì)量的高效液相色譜用硅膠微球;使用不同尺寸、不同交聯(lián)度和含不同官能團(tuán)的聚合物微球可以制備出不同粒徑、不同孔徑和不同形貌的硅膠基質(zhì)微球以及相應(yīng)的色譜固定相,從而滿足不同高效液相色譜分離分析應(yīng)用的需要和促進(jìn)高效液相色譜固定相的發(fā)展。

[1] Kohler J, Kirkland J J. J Chromatogr A, 1987, 385: 125

[2] Yang X L, Wang J D, Xiong B H. Chinese Journal of Chromatography, 2000, 18(4): 308

楊新立, 王俊德, 熊博暉. 色譜, 2000, 18(4): 308

[3] Zhao B B, Zhang Y, Tang T, et al. Progress in Chemistry, 2012, 24(1): 122

趙貝貝, 張艷, 唐濤, 等. 化學(xué)進(jìn)展, 2012, 24(1): 122

[4] Gallis K W, Araujo J T, Duff K J, et al. Adv Mater, 1999, 11: 1452

[5] Unger K K, Kumar D, Grün M, et al. J Chromatogr A, 2000, 892: 47

[6] Fekete S, Olah E, Fekete J. J Chromatogr A, 2012, 1228: 57

[7] Guiochon G, Gritti F. J Chromatogr A, 2011, 1218: 1915

[8] Wang Y, Ai F, Ng S, et al. J Chromatogr A, 2012, 1228: 99

[9] Dong H J, Brennan J D. J Mater Chem, 2012, 22: 13197

[10] Hayes R, Ahmed A, Edge T, et al. J Chromatogr A, 2014, 1357: 36

[11] Sun Y S, Qu Q S, Yu S X, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(12): 1250

孫元社, 瞿其曙, 于淑新, 等. 色譜, 2016, 34(12): 1250

[12] Svec F, Peters E C, Sykora D, et al. J Chromatogr A, 2000, 887: 3

[13] Tanaka N, Kobayashi H, Ishizuka N, et al. J Chromatogr A, 2002, 965: 35

[14] MacNair J E, Patel K D, Jorgenson J W. Anal Chem, 1999, 71: 700

[15] Shen Y, Zhang R, Moore R J, et al. Anal Chem, 2005, 77: 3090

[16] Zou H F, Wu M H, Wang F J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2009, 27(5): 526

鄒漢法, 吳明火, 王方軍, 等. 色譜, 2009, 27(5): 526

[17] Wienkoop S, Glinski M, Tanaka N, et al. Rapid Commun Mass Spectrom, 2004, 18: 643

[18] Chen W, Jiang K, Mack A, et al. J Chromatogr A, 2015, 1414: 147

[19] Unger K K, Jilge G, Janzen R, et al. Chromatographia, 1986, 22(7): 379

[20] Nimura N, Itoh H, Kinoshita T. J Chromatogr, 1991, 585: 207

[21] Chong B E, Lubman D M, Miller F R, et al. Rapid Commun Mass Spectrom, 1999, 13: 1808

[22] Wu N, Liu Y, Lee M L. J Chromatogr A, 2006, 1131: 142

[23] Li Y Y, Cheng S Y, Dai P C, et al. Chem Commun, 2009, 1085

[24] Ma Y R, Qi L M, Ma J M, et al. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp, 2003, 229: 1

[25] Edouard S P, Bouvier E S P, Koza S M. TrAC-Trends Anal Chem, 2014, 63: 85

[26] Fekete S, Beck A, Veuthey J L, et al. J Pharm Biomed Anal, 2014, 101: 161

[27] Huo Q, Margolese D I, Stucky G D. Chem Mater, 1996, 8: 1147

[28] Lin H P, Mou C Y. Acc Chem Res, 2002, 35: 927

[29] Kim T W, Chung P W, Lin V S Y. Chem Mater, 2010, 22: 5093

[30] Qiao Z A, Zhang L, Guo M, et al. Chem Mater, 2009, 21: 3823

[31] Zhao D Y, Huo Q S, Feng J L, et al. J Am Chem Soc, 1998, 120: 6024

[32] Boissière C, Kummel M, Persin M. Adv Funct Mater, 2011, 11: 129

[33] Zhang H F, Hardy G C, Rosseinsky M J, et al. Adv Mater, 2003, 15(1): 78

[34] Zhang H F, Hardy G C, Khimyak Y Z, et al. Chem Mater, 2004, 16: 4245

[35] Meyer U, Larsson A, Hentze H, et al. Adv Mater, 2002, 14: 1768

[36] He J, Yang C L, Xiong X H. J Polym Sci, Part A: Polym Chem, 2012, 50(14): 2889

[37] Xia H J, Wan G P, Zhao J L, et al. J Chromatogr A, 2016, 1471: 138

[38] Zhang K, Xu L L, Jiang J G, et al. J Am Chem Soc, 2013, 135: 2427

[39] Huang M X, Liu L, Wang S G, et al. Langmuir, 2017, 33(2): 519

[40] Tian K, Guan J, Shao Z Z, et al. Progress in Chemistry, 2008, 20(4): 565

田琨, 管娟, 邵正中, 等. 化學(xué)進(jìn)展, 2008, 20(4): 565

[41] Huang J, Zhang L N, Chen F G. J Appl Polym Sci, 2003, 88: 3284

Science and Technology Commission of Shanghai Municipality Project (No. 14440502300); Foundation of Hujiang from University of Shanghai for Science and Technology (No. D15011).

Preparation of large-pore silica microspheres using templating method and their applications to protein separation with high performance liquid chromatography

NIU Mengna, MA Hongyan, HU Fei, WANG Shige, LIU Lu,CHANG Haizhou, HUANG Mingxian*

(DepartmentofChemistry,CollegeofScience,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

Large-pore silica microspheres were synthesized by utilizing weak cation exchange polymer beads as templates,N-trimethoxysilylpropyl-N,N,N-trimethylammonium chloride (TMSPTMA) as a structure-directing agent, tetraethoxysilane (TEOS) as a silica precursor, and triethanolamine as a weak base catalyst. The hydrolysis and condensation of the silica precursors occurred inside the templating polymer beads yielded polymer/silica composite microspheres. After the organic polymer templates were removed in the calcination step, large-pore silica microspheres were produced. The effects of different reaction conditions on the morphology, structure and dispersibility of the formed silica microspheres were investigated. It has been shown that when the volume ratio of TMSPTMA, TEOS and triethanolamine was 1∶2∶2, silica microspheres with pore size range of 50-150 nm and particle size around 2 μm were obtained. The as-prepared silica microspheres were then bonded with chlorodimethyloctadecylsilane (C18), packed into a 50 mm×4.6 mm column, and evaluated for the separations of some common standard proteins and soybean isolation proteins. The results showed that the large-pore silica spheres from this work have potentials for protein separation in HPLC.

templating method; structure-directing agent; large-pore silica microspheres; high performance liquid chromatography (HPLC); protein separation

10.3724/SP.J.1123.2017.03018

2017-03-17

上海市科委項(xiàng)目(14440502300);上海理工大學(xué)滬江基金(D15011).

O658

A

1000-8713(2017)06-0565-07

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:hmx@usst.edu.cn.