張達娟, 張興華, 唐學璽, 畢相東,4*, 宋倫, 張樹林

(1. 天津農學院 水產學院 天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 中國海洋大學 海洋生命學院， 山東 青島 266003；3. 遼寧省海洋水產科學研究院， 遼寧 大連 116023；4. 南開大學 環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

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三角褐指藻與抑食金球藻的競爭及化感作用研究

張達娟1, 張興華2, 唐學璽2, 畢相東1,4*, 宋倫3, 張樹林1

(1. 天津農學院 水產學院 天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 中國海洋大學 海洋生命學院， 山東 青島 266003；3. 遼寧省海洋水產科學研究院， 遼寧 大連 116023；4. 南開大學 環(huán)境科學與工程學院，天津 300071)

為探明三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)對抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)是否具有化感作用，本研究以三角褐指藻和抑食金球藻為實驗材料，研究了抑食金球藻在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下的生長情況及三角褐指藻培養(yǎng)濾液對其生長和葉綠素熒光參數(shù)的影響。結果表明：三角褐指藻對抑食金球藻有明顯的化感抑制作用。在單培養(yǎng)體系中，抑食金球藻的生長曲線可用邏輯斯諦增長模型擬合，隨著起始密度的增加，環(huán)境容量(K)逐漸減小，而抑食金球藻的種群瞬間增長率(r)、進入拐點時間及穩(wěn)定期細胞密度均較為接近；當三角褐指藻與抑食金球藻以不同起始密度比共同培養(yǎng)時，抑食金球藻的生長均受到了顯著地抑制(P<0.05)，但其抑制作用并未與三角褐指藻的密度呈明顯的線性關系；濾液培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，10 mL和15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的加入可對抑食金球藻的生長產生顯著影響(P<0.05)，對其葉綠素熒光參數(shù)沒有影響(P>0.05)，25 mL和35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的加入可對抑食金球藻的生長和葉綠素熒光參數(shù)均產生顯著的抑制作用(P<0.05)，葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha的值降低，Ik的值增加，PSⅡ受到損害。

三角褐指藻；抑食金球藻；褐潮；化感作用

1 引言

抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)隸屬于金藻門，是一種直徑約2 μm，具有單一葉綠體、線粒體、細胞核和胞外多糖的微微型藻類，其大量增殖可形成褐潮(brown tide)。自1985年在美國東海岸首次暴發(fā)以來，逐漸在全球范圍內擴散，1997-1999年持續(xù)在南非的薩爾達尼亞海灣暴發(fā)。我國自2009年開始連續(xù)5年在渤海灣秦皇島附近海域定期(5-8月)發(fā)生抑食金球藻褐潮[1]；2011年起，在山東威海海域亦有暴發(fā)[2]。目前，我國是繼美國和南非之后第三個發(fā)生抑食金球藻褐潮的國家。

抑食金球藻褐潮多發(fā)生在有機氮濃度較高的近岸河口或淺海海灣，這一海域恰是開展貝類和魚類養(yǎng)殖的重點區(qū)域。褐潮暴發(fā)初期，由于抑食金球藻密度顯著升高，造成海水透明度急劇下降，海藻大量死亡，破壞貝類的重要棲息環(huán)境和產卵地；雖然該藻不分泌毒素，但能產生一種類似多巴胺的生物活性物質[3—4]，抑制貝類側纖毛的活動，從而對海灣扇貝(Argopectenirradians)[5]、藍貝(Mytilusgalloprovincialis)、貽貝(Mytilusedulis)[6—7]、文蛤(Meretrixmeretirx)和美洲簾蛤(Mercenariamercenaria)[8—9]等濾食性貝類的攝食、生長產生影響，甚至導致死亡。2010年秦皇島附近海域褐潮最大暴發(fā)面積為3 350 km2，造成直接經(jīng)濟損失2.05億元[1]。褐潮的危害在我國近岸海域不斷的擴大，亟需建立有效的褐藻應急處置技術，以期大幅度降低對近岸貝類養(yǎng)殖的危害。研究人員嘗試采用黏土吸附藻細胞等物理方式[10]及H2O2抑殺藻細胞等化學方法進行消除[11]，但終因耗費高、生態(tài)安全性低等諸多局限，均未規(guī)?；貞糜谪愵愷B(yǎng)殖海域的褐潮應急處置中，因此，尋找一種高效、生態(tài)安全性高的新型控藻技術十分必要。

微藻間的競爭機制分為資源利用性競爭、化感作用和接觸性競爭，其中化感作用研究一直是微藻研究領域的熱點之一。研究表明，一些海洋藻類在生長過程中亦會不斷向周圍環(huán)境中釋放生物活性物質，對其他海藻的生長產生影響[12—13]，為通過生物手段控制抑食金球藻大量暴發(fā)提供了重要的理論基礎。此外，畢相東等[14]研發(fā)出一種餌料微藻濃縮液緩釋儀，使用篩選出的既能強烈抑制抑食金球藻生長又能為養(yǎng)殖微環(huán)境中貝類提供餌料的微藻，并將其濃縮液緩釋于貝類養(yǎng)殖的微環(huán)境中，該技術將能夠有效降低褐潮對貝類養(yǎng)殖的危害，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益，具有廣闊的實用推廣前景。

鑒于上述理論基礎和技術支撐，本研究將探討貝類典型餌料微藻——三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)和抑食金球藻之間的相互作用，闡明三角褐指藻是否可以通過化感作用控制抑食金球藻的生長、繁殖，從而篩選可高效控制抑食金球藻的化感餌料生物，為精確控制褐潮暴發(fā)提供理論基礎和數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實驗藻種

抑食金球藻(CCMP1984)由美國國家海洋浮游植物藻種中心(National Center for Marine Algae and Microbiota, NCMA，原為Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton, CCMP)提供，編號為1984。三角褐指藻來自中國海洋大學生態(tài)學實驗室藻種庫。

2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)用三角瓶經(jīng)HCl浸泡、反復沖洗后滅菌，備用。培養(yǎng)用海水取自青島市魯迅公園，經(jīng)沉淀、脫脂棉過濾、0.22 μm微孔濾膜抽濾后滅菌，備用。藻類培養(yǎng)在250 mL培養(yǎng)瓶中進行，培養(yǎng)液體積為100 mL，采用f/2培養(yǎng)基進行一次性培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：溫度(20±1)℃，光照60 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h，每天搖動藻液3～4次，防止藻細胞附壁下沉。

2.3 藻細胞的計數(shù)方法

采用血球計數(shù)板對三角褐指藻和單培養(yǎng)條件下抑食金球藻的細胞進行計數(shù)。

共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的計數(shù)方法參考畢相東等[15]、宋林生等[16]的方法。培養(yǎng)中，每兩天取1 mL藻液，經(jīng)0.45 μm的纖維素濾膜過濾后，收集膜上的細胞提取DNA，然后將提取的DNA樣品進行熒光定量PCR，獲得Ct值，將其代入已建立藻細胞對數(shù)值與Ct值的標準曲線方程y=-2.671x+42.134，r2=0.952，并換算出藻細胞數(shù)量。每個樣品設3個平行，換算后計算抑食金球藻細胞的平均數(shù)量。

2.4 葉綠素熒光參數(shù)的測定

2.5 實驗內容

2.5.1 抑食金球藻熒光定量PCR監(jiān)測技術的建立

(1) 藻細胞的收集及基因組DNA提取方法：待抑食金球藻細胞達到穩(wěn)定期后進行稀釋，使最終細胞密度分別為8，8×101、8×102、8×103、8×104、8×105、8×106cell/mL，收集的藻細胞作為基因組DNA提取介質。藻細胞基因組DNA提取所用的試劑盒為TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。提取流程按照試劑盒說明進行。

(2) 特異性熒光探針定量PCR反應引物、反應體系和條件參考宋林生等[16]。

(3) 繪制標準曲線：將特異性熒光探針定量PCR反應所得的Ct值與細胞的對數(shù)值通過線性回歸擬合形成標準曲線，并得到標準曲線方程。

2.5.2 抑食金球藻的單培養(yǎng)實驗

接種處于指數(shù)增長期的抑食金球藻，使其起始密度分別達到1×104cell/mL、2×104cell/mL和4×104cell/mL，每個密度組設3個平行，于藻種室培養(yǎng)，每天取出藻液按2.3中所述方法對藻細胞進行計數(shù)。

2.5.3 三角褐指藻和抑食金球藻的共培養(yǎng)實驗

以單種培養(yǎng)作為對照，以不同起始密度的三角褐指藻(以P表示)和抑食金球藻(以A表示)進行共培養(yǎng)實驗，起始密度比分別為1∶4、1∶1和4∶1(表1)，每組設置3個平行。按照2.3中所描述的方法對兩種藻細胞進行計數(shù)，觀察藻細胞密度的變化。

表1 三角褐指藻與抑食金球藻共培養(yǎng)實驗設計

2.5.4 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長及葉綠素熒光參數(shù)的影響實驗

將處于對數(shù)增長期、起始密度為5×104cell/mL的三角褐指藻進行培養(yǎng)，使其達到最大環(huán)境容量；溶液經(jīng)0.22 μm的醋酸纖維素濾膜抽濾，該溶液即為三角褐指藻的培養(yǎng)液濾液，將培養(yǎng)液濾液和滅菌海水均加富至f/2培養(yǎng)基，按不同比例配制抑食金球藻培養(yǎng)液(表2)。以組①為空白對照，每組設3個平行，均接入10 mL處于指數(shù)增長期的抑食金球藻，最后的實驗總體積均為150 mL。自接種之后起，每天同一時間取出藻液，按2.3中所述方法對抑食金球藻藻細胞進行計數(shù)，按2.4中所描述的方法進行葉綠素熒光參數(shù)的測定。

表2 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻生長影響的實驗設計

2.6 數(shù)據(jù)分析

2.6.1 種群瞬時增長率、環(huán)境容量和生長曲線進入拐點時間的計算

利用Logistic方程對微藻種群的增長進行擬合，并根據(jù)其積分形式N=K/(1+e(a-rt))用統(tǒng)計軟件SigmaPlot 12.5進行非線性回歸分析，計算環(huán)境容量(K)和種群瞬時增長率(r)，式中a表示曲線對原點的相對位置，其值取決于N0，N0=K/(1+ea)，t表示時間。根據(jù)公式Tp=a/r計算藻類生長曲線到達拐點的時間。

2.6.2 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010作圖。采用SPSS 17.0進行單因子方差分析和多重比較。P<0.05被認為是在α=0.05水平上差異顯著。

3 結果與分析

3.1 單培養(yǎng)體系中抑食金球藻的生長情況

單種培養(yǎng)條件下不同起始密度抑食金球藻的生長情況見圖1。結果表明，不同起始密度抑食金球藻的生長曲線均呈現(xiàn)出典型的Logistic“S”型增長模式，隨著起始密度的增加，抑食金球藻種群K值顯著降低(P=0.003<0.01)，進入指數(shù)生長期和靜止期的時間亦逐漸縮短，而種群內稟增長率(r)、進入拐點時間(TP)及穩(wěn)定期細胞密度均較為接近。當初始接種密度為1×104cell/mL時，種群生長進入指數(shù)生長期的時間為第7天，環(huán)境容納量(K)為(5 128.989±82.762)×104cell/mL，種群內稟增長(r)為0.673(±0.057)，進入靜止期的時間為第14.933天，生長回歸方程為[N=5 128.989/(1+e(10.049-0.673 t))，×104cell/mL]。當初始接種密度為2×104cell/mL時，種群生長進入指數(shù)生長期的時間為第6天，K值為(4 667.290±147.175)×104cell/mL，r值為0.754(±0.103)，進入靜止期的時間為第15.188天，生長回歸方程為[N=4 667.290/(1+e(11.453-0.754 t))，×104cell/mL]。當初始接種密度為4×104cell/mL時，種群生長進入指數(shù)生長期的時間為第5天，K值為(4 643.836±104.583)×104cell/mL，r值為0.543(±0.044)，進入靜止期的時間為第15.368天，生長回歸方程為[N=4 643.836/(1+e(7.817-0.543 t))，×104cell/mL]。

以邏輯斯諦方程進行擬合，各參數(shù)的估計值以及生長曲線達到拐點的時間見表3。

表3 不同起始密度下抑食金球藻的生長參數(shù)

圖1 不同起始密度下抑食金球藻的生長曲線Fig.1 The growth curve of A. anophageferens under differential initial densities

3.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻的生長及種群增長特點

3.2.1 熒光定量PCR標準曲線結果

在共培養(yǎng)體系中，抑食金球藻計數(shù)時的熒光定量PCR擴增曲線平滑，擴增效果較好(圖2)。根據(jù)藻細胞DNA模板PCR擴增后所得的Ct值與藻細胞數(shù)目對數(shù)值的相關系數(shù)(r2)為0.952，擬合的標準曲線為y=-2.671x+42.134，可適用于本實驗中抑食金球藻細胞數(shù)目的定量分析。

圖2 PCR檢測出熒光定量樣品ΔRn和循環(huán)數(shù)的擴增曲線Fig.2 Amplification of standards from qPCR run on ABI7500 of ΔRn versus the number of cycles

圖3 不同初始接種密度比條件下三角褐指藻和抑食金球藻的生長曲線Fig.3 The growth curve of P. tricornutum and A. anophageferens in the different initial densities proportion

3.2.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻的生長

不同初始接種密度條件下三角褐指藻和抑食金球藻的生長曲線見圖3。在共培養(yǎng)體系中，三角褐指藻的細胞密度均于培養(yǎng)的第16天達到最大，與對照組無顯著差異(處理①、②和③的P=0.979、0.504和0.406)。抑食金球藻的生長受到三角褐指藻的顯著性抑制，沒有出現(xiàn)明顯的指數(shù)性增長，最高細胞密度出現(xiàn)在培養(yǎng)的第16～18天，不過顯著低于對照組(處理①、②和③的P=0.01、0.00和0.009)。此外，抑食金球藻的細胞密度不受接種比例的影響(P=0.935)。

3.2.2 共培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻種群增長特點

不同接種密度條件下，共培養(yǎng)體系中三角褐指藻的環(huán)境容納量K值均出現(xiàn)顯著(P=0.000)下降，比對照組分別下降了17.40%、27.10%和21.30%，但仍然處于較高的水平(圖4)；共培養(yǎng)體系中抑食金球藻的環(huán)境容納量K值極顯著的低于對照組(P=0.000)。不同接種比例對抑食金球藻環(huán)境容納量的影響程度幾乎一致，并沒有隨著三角褐指藻接種比例的增加產生顯著變化(P>0.05)(圖5)。

圖4 不同初始接種密度條件下三角褐指藻的環(huán)境容納量Fig.4 The carrying capabilities of P. tricornutum at three different initial densities ratios

圖5 不同初始接種密度條件下抑食金球藻的環(huán)境容納量Fig.5 The carrying capabilities of A. anophagefferens at three different initial densities ratios

如圖6所示，共培養(yǎng)時，處理①中三角褐指藻種群的內稟增長率與單獨培養(yǎng)體系中三角褐指藻的內稟增長率之間無顯著差異(P=0.534)，當三角褐指藻的接種密度提高后，其內稟增長率均顯著高于單獨培養(yǎng)體系，說明兩種藻的共培養(yǎng)可能對三角褐指藻的生長具有一定的促進作用。抑食金球藻的種群內稟增長率均受到共培養(yǎng)的顯著影響(處理①、②和③的P均為0.000)，這種共培養(yǎng)模式可以有效地抑制抑食金球藻種群的增長(圖7)。不同接種比例對抑食金球藻種群內稟增長率有一定的影響，當三角褐指藻和抑食金球藻接種密度為1∶1時，抑食金球藻的種群內稟增長率顯著高于其他兩種接種密度。

圖6 不同初始接種密度條件下三角褐指藻種群的內稟增長率Fig.6 The intrinsic growth rates of P. tricornutum and at three different initial densities ratios

圖7 不同初始接種密度條件下抑食金球藻種群的內稟增長率Fig.7 The intrinsic growth rates of A. anophagefferens at three different initial densities ratios

與對照相比，共培養(yǎng)體系中三角褐指藻生長曲線到達拐點的時間變化不大，受到共培養(yǎng)的影響較??；抑食金球藻生長曲線達到拐點的時間明顯提前，在3個處理組中均提前5 d左右(表4)，由此可知，共培養(yǎng)對抑食金球藻生長的影響較大，提前進入負加速生長過程。

表4 不同培養(yǎng)體系中三角褐指藻和抑食金球藻生長曲線進入拐點的時間(TP)(單位：d)

圖8 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻的生長及葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.9 Effect of P. tricornutum culture medium filtrate on growth and fluorescence parameters of A. anophageferens

3.3 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

加入不同量的三角褐指藻培養(yǎng)濾液后對抑食金球藻細胞生長的影響見圖8a。結果顯示：與對照組相比，除了加入5 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理②組以外，其他各組對抑食金球藻的生長均產生了不同程度的抑制作用。加入10 mL、15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理③、④組抑食金球藻的細胞生長速率低于對照，受到三角褐指藻培養(yǎng)濾液的抑制作用，培養(yǎng)結束時細胞密度與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，處理③、④組間無顯著性差異(P=0.192)；分別加入25 mL、35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理⑤、⑥組細胞密度并未增加，而是逐漸減少至較低水平(<10×104cell/mL)，抑食金球藻的生長受到了強烈的抑制，培養(yǎng)結束時細胞密度與對照組有顯著性差異(P<0.05)，⑤、⑥組間無顯著性差異(P=0.933)。

三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響見圖8b～g。單因素方差分析結果顯示：在1～7 d內，加入5 mL、10 mL、15 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的②、③、④組各葉綠素熒光參數(shù)的值與對照組①相比基本無顯著性差異(P>0.05)，說明小于等于15 mL三角褐指藻濾液的加入并沒有對抑食金球藻PSⅡ造成不利影響。加入25 mL、35 mL三角褐指藻培養(yǎng)濾液的處理⑤、⑥組各葉綠素熒光參數(shù)的值卻發(fā)生了較大程度的變化。第2天時，三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻的影響凸顯出來，⑤、⑥組的Fv/Fm、ΦPSⅡ、alpha、NPQ的值下降劇烈，幾乎檢測不到熒光信號，與對照差異顯著(P<0.05)；rETRmax的值也出現(xiàn)了一定程度的下降，⑥組Ik的值大幅上升。第3～7天，⑤、⑥組的各葉綠素熒光參數(shù)的值逐漸向正常水平恢復，但培養(yǎng)結束時，F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、alpha、NPQ仍顯著低于對照組(P<0.05)，⑥組Ik的值仍顯著高于對照組(P<0.05)。

4 討論

海洋中一種或幾種浮游植物大量繁殖，占據(jù)絕對優(yōu)勢時，往往會暴發(fā)赤潮災害。迄今為止，赤潮是人類社會面臨的最為嚴重的海洋生態(tài)災害和社會經(jīng)濟問題之一。很多學者從外界環(huán)境、營養(yǎng)鹽、關鍵物理海洋過程等角度探討了赤潮暴發(fā)機制，研究日趨完善。然而在復雜的自然條件下，一些非赤潮種類可以通過營養(yǎng)鹽競爭來抑制赤潮的暴發(fā)，這種競爭對浮游植物種群數(shù)量的消長、群落結構的穩(wěn)定以及演替均有重要的作用[17—21]。不同種群之間的競爭不僅受營養(yǎng)鹽的限制，種間的化感作用對競爭結果也有重要影響，基于該理論，現(xiàn)已開展了大量大型藻類與赤潮種類[22]、有益種類與赤潮種類以及赤潮種類間的化感作用的研究工作[23—26]。為了研究三角褐指藻和抑食金球藻之間的競爭作用，本研究進行了三角褐指藻與抑食金球藻的共培養(yǎng)實驗以及濾液培養(yǎng)實驗。

4.1 共培養(yǎng)對兩種藻類生長的影響

通過共培養(yǎng)實驗可以看出，共培養(yǎng)并未對三角褐指藻的生長及細胞密度產生影響，卻顯著抑制了抑食金球藻的生長，其環(huán)境容納量、瞬時增長率均顯著下降，生長曲線進入拐點時間明顯提前，抑食金球藻種群衰落的較快。將三角褐指藻和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtarmarense)共培養(yǎng)后，二者的生長均受到一定程度的抑制作用，不過對三角褐指藻的影響尤為嚴重，共培養(yǎng)造成其線粒體、葉綠體受到嚴重損壞，并在分子水平上抑制能量代謝、TCA循環(huán)以及碳固定等基因的轉錄表達水平[27]，培養(yǎng)后期，塔瑪亞歷山大藻的生長開始出現(xiàn)輕微下降，可能與三角褐指藻在細胞裂解時釋放的生物活性物質有關。張珍萍[28]指出，三角褐指藻濾出液可以有效的抑制東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的生長，隨著其濾出液濃度的升高，對東海原甲藻細胞密度的抑制效應逐漸增強，在第10天的細胞凈增率減小了99%。另外，瑪氏骨條藻(Skeletonemamarinoi)具有產生多不飽和醛(PUA)及其他氧化酯類等生物活性物質的能力，這些物質能誘導藻類的微管蛋白表達水平的下調，從而抑制共培養(yǎng)種類的生長。在本實驗中，共培養(yǎng)對三角褐指藻也產生了一定的影響，但影響相對較小，其競爭力遠遠大于抑食金球藻，在競爭中占絕對優(yōu)勢。由此可見，藻類的競爭力不僅受與之共培養(yǎng)種類的影響，而且與受試藻類對化感物質的耐受力有密切關系。

通常，化感物質的作用程度與共培養(yǎng)的兩種藻類的密度有關，受試藻類的密度越高，化感作用的程度越低，在低于能夠產生抑制作用的臨界濃度時，化感物質對受試藻類不會表現(xiàn)出抑制作用。本研究中，抑食金球藻受三角褐指藻的抑制作用并未隨接種密度的變化而發(fā)生顯著的變化，說明，三角褐指藻和抑食金球藻在最低密度比(1∶4)時，三角褐指藻分泌的化感物質的有效濃度遠在臨界濃度之上，至于其化感物質主要成分、臨界濃度等還需進一步的研究。

4.2 三角褐指藻培養(yǎng)濾液對抑食金球藻葉綠素熒光參數(shù)的影響

化感物質可對植物的光合作用產生影響，并主要通過降低藻類的葉綠素a和藻膽蛋白含量、破壞PSⅡ等方面對藻類的光合作用產生影響，使其無法通過正常的光合作用獲得物質和能量，從而進一步殺死藻細胞，使藻類細胞數(shù)量顯著減少，生長受到抑制[29]。腸滸苔(Enteromorphaintestinalis)水相提取物可以抑制赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)和海洋原甲藻(Prorocenrummicans)的生長；K?rner和Nicklisch[20]研究發(fā)現(xiàn)穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)分泌的化感物質能抑制多種藍細菌、綠藻和硅藻的PSⅡ和生長；金魚藻(Ceratophyllumdemersum)分泌的化感物質能抑制藻類和藍細菌的PSⅡ及生長。大多數(shù)植物化感物質會對PSⅡ產生影響，主要表現(xiàn)在影響質體醌QA再氧化速率和初級光能捕獲，使光合系統(tǒng)Ⅱ活性中心失活，使單元結構從系統(tǒng)中分離[30]。

Fv/Fm是PSⅡ的最大光化學量子產量，反映PSⅡ的最大光能轉換效率，一般比較穩(wěn)定，但在脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。本研究中，當三角褐指藻濾液加入量小于25 mL時，抑食金球藻Fv/Fm與對照并無差異；當其濾液加入量大于等于25 mL，在培養(yǎng)的第2天開始，其Fv/Fm均出現(xiàn)顯著下降，直至培養(yǎng)結束，兩處理組Fv/Fm的值也沒有恢復到正常水平，這期間細胞密度也沒有出現(xiàn)增長的趨勢而是逐漸降低，這說明PSⅡ已受到損害并且不可恢復，導致藻細胞無法進行正常的光合作用，進而抑制抑食金球藻的生長，直至死亡。

加入25 mL以上的三角褐指藻培養(yǎng)濾液的組別，接種后第2天抑食金球藻實際光化學量子產量ΦPSⅡ出現(xiàn)顯著下降，它反映了PSⅡ反應中心在有部分關閉情況下實際原初光能捕獲效率，ΦPSⅡ的降低說明三角褐指藻濾液阻止抑食金球藻細胞同化力(NADPH, ATP)的形成，影響藻類對碳的固定與同化，進而影響細胞的生長?？焖俟馇€的初始斜率Alpha，反映了植物對光能的捕獲能力，Alpha的降低表明三角褐指藻濾液可以抑制抑食金球藻細胞對光能的利用效率，同時，三角褐指藻濾液也可降低抑食金球藻的光保護能力，非光化學淬滅NPQ的降低就很好地說明了這一點。最小飽和光強Ik代表的是植物對強光的耐受能力，Ik的升高，與植物對強光的耐受能力有關，⑥組Ik的上升說明35 mL三角褐指藻藻濾液的加入可以在一定程度上增強抑食金球藻細胞對強光的耐受能力。

加入三角褐指藻培養(yǎng)濾液可以有效的影響抑食金球藻的細胞密度及PSⅡ的相應葉綠素熒光參數(shù)，表明三角褐指藻對抑食金球藻的抑制作用是通過分泌活性物質來完成的，在后續(xù)的研究中應搞清其抑制作用的臨界濃度，化感物質的主要成分，化感作用的應用方面還需要進行更多的現(xiàn)場試驗。

5 結論

三角褐指藻和抑食金球藻的共培養(yǎng)可以有效的抑制抑食金球藻的生長，且與接種比例無關，抑食金球藻種群的環(huán)境容納量和內稟增長率均受到一定的影響；當抑食金球藻的培養(yǎng)基中包含低濃度(10 mL、15 mL)的三角褐指藻培養(yǎng)濾液時，抑食金球藻的生長被顯著的抑制，但對其葉綠素熒光參數(shù)沒有影響；當其培養(yǎng)基中包含較高濃度(25 mL、35 mL)三角褐指藻培養(yǎng)濾液時，抑食金球藻PSⅡ系統(tǒng)受到不可恢復的損害，藻細胞逐漸死亡。因此，三角褐指藻通過釋放生物活性物質對抑食金球藻產生化感抑制作用，其化感物質成分、濃度及在實際中的應用需要進一步研究。

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Study on the competition and allelopathy betweenPhaeodactylumtricornutumandAureococcusanophagefferens

Zhang Dajuan1, Zhang Xinghua2, Tang Xuexi2, Bi Xiangdong1,4, Song Lun3, Zhang Shulin1

(1.DepartmentofFisheriesSciences,TianjinAgriculturalUniversity,KeyLabortaryofAqua-ecologyandAquacultureofTianjin,Tianjin300384,China; 2.CollegeofMarineLifeScience,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China; 2.LiaoningOceanandFisheriesScienceResearchInstitute,Dalian116023,China;CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

To clarify whetherPhaeodactylumtricornutumhad allelopathy effect onAureococcusanophagefferens, we studied the interaction betweenP.tricornutumandA.anophagefferensand the impacts ofP.tricornutumculture media filtrate onA.anophagefferensgrowth and on chlorophyll fluorescence under laboratory conditions. The results show that,P.tricornutumhas allelopathy effect onA.anophagefferens. In the mono-culture, the proliferation ofA.anophagefferensfollowed the Logistic model, and its initial cell density affected significantly the environmental-carrying capacity (K) of algal populations; andKvalues decreased gradually with the increase of initial cell densities.In the co-culture, the growth ofA.anophagefferenswas inhibited significantly (P<0.05) byP.tricornutumof different algal initial cell densities, but the inhibitory effect changed indistinctively with the increase ofP.tricornutumproportion. In the filtrate cultivation experiment ofA.anophagefferens, we found that:P.tricornutumfiltrate at 10 mL or 15 mL could remarkably inhibite the growth ofA.anophagefferens(P<0.05) with no effect on its chlorophyll fluorescence;P.tricornutumfiltrate at 25 mL and 35 mL could cause PSⅡ irreversible damage (Fv/Fm, ΦPSⅡ, alpha, NPQ values reduced) and death ofA.anophagefferens.

Phaeodactylumtricornutum;Aureococcusanophagefferens; brown tide; allelopathy

10.3969/j.issn.0253-4193.2017.06.009

2016-09-26；

2016-12-05。

國家自然科學基金青年項目(31300393)；中國海洋發(fā)展研究會重點項目(CAMAZDA201605)；遼寧省自然科學基金資助項目(2014020182)；天津市科技支撐重點項目(15ZCZDNC00230)；中國博士后科學基金特別資助(2015T80212)；天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室開放基金項目(TJAE201501)。

張達娟(1981—)，女，天津市人，博士，實驗師，主要從事浮游生物生理生態(tài)學研究。E-mail：dajuanzhang@163.com

*通信作者：畢相東(1980—)，男，遼寧省大連市人，副教授，碩士生導師，主要從事水域生態(tài)學研究。E-mail：yl801123@aliyun.com

Q948.8

A

0253-4193(2017)06-0084-11

張達娟，張興華，唐學璽，等. 三角褐指藻與抑食金球藻的競爭及化感作用研究[J].海洋學報，2017，39(6)：84—94,

Zhang Dajuan, Zhang Xinghua, Tang Xuexi, et al. Study on the competition and allelopathy betweenPhaeodactylumtricornutumandAureococcusanophagefferens[J]. Haiyang Xuebao，2017，39(6)：84—94, doi:10.3969/j.issn.0253-4193.2017.06.009