王 迪，馬溪平，孟雪蓮，董文靈，董 興，徐成斌

（1. 遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2. 遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

一株雙酚A降解菌的篩選、鑒定及其生長(zhǎng)、降解條件

王 迪1，馬溪平1，孟雪蓮2，董文靈1，董 興1，徐成斌1

（1. 遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036；2. 遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

從沈陽(yáng)北部污水處理廠曝氣池活性污泥中馴化、分離及篩選得到一株以雙酚A為唯一碳源的高效降解菌株D-17，通過(guò)菌體形態(tài)、生理生化反應(yīng)特性及16S rDNA基因測(cè)序分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并研究了該菌株的生長(zhǎng)及雙酚A降解條件。菌種鑒定結(jié)果表明，該菌為乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該菌株的生長(zhǎng)及降解雙酚A的最適條件為溶液pH 7.0，接種量10%，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，降解溫度30 ℃，降解時(shí)間5 d；當(dāng)雙酚A初始質(zhì)量濃度為60 mg/ L時(shí)，雙酚A降解率達(dá)52.62%；投加蛋白胨后，雙酚A降解率提高至57.15%。

乙酸鈣不動(dòng)桿菌；雙酚A；菌種鑒定；降解條件

雙酚A遍及人們生活的諸多領(lǐng)域，是環(huán)氧樹(shù)脂和聚碳酸酯等很多聚合型化工產(chǎn)品的原料［1-2］。近年來(lái)，在全球范圍內(nèi)，特別是發(fā)達(dá)地區(qū)的水環(huán)境中，都檢測(cè)到了雙酚A的存在［3-6］。在我國(guó)遼寧省等區(qū)域的地表水中也曾發(fā)現(xiàn)存在較高濃度的雙酚A［7-8］。雙酚A具有的高毒性及持久性會(huì)對(duì)人類(lèi)健康及環(huán)境造成嚴(yán)重威脅，目前該物質(zhì)已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署認(rèn)定為內(nèi)分泌干擾物（EDCs）［9-11］。

水環(huán)境中雙酚A的去除方法有很多，但相比于物理方法和化學(xué)方法，生物降解雙酚A的優(yōu)勢(shì)是低成本、高去除率和長(zhǎng)降解持續(xù)周期，利用好氧微生物去除雙酚A的效果更為顯著［12-13］。目前，假單胞菌、新鞘氨醇桿菌、芽孢桿菌及少動(dòng)鞘氨醇單胞菌等雙酚A降解菌，均被人們分離得到［11，14-20］。2006年Kwon等［21］進(jìn)行了乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）作為雙酚A降解菌的相關(guān)研究，結(jié)果顯示該菌株對(duì)雙酚A的最大耐受濃度為1 140 μg/ mL，影響其降解效果的兩個(gè)因素的最佳值為：降解溫度30 ℃，降解pH 7.0。

本工作從沈陽(yáng)北部污水處理廠馴化獲得一株以雙酚A為碳源的雙酚A降解菌，進(jìn)行了菌種鑒定，并對(duì)該菌株進(jìn)行了生長(zhǎng)及雙酚A降解條件的研究，以期為乙酸鈣不動(dòng)桿菌作為雙酚A高效降解菌的生物降解研究提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

富集培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏4，NaCl 5，pH 7.0；無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 1，MgSO40.2，NH4Cl 0.1，KH2PO41，Na2HPO4·12H2O 3.8，pH 7.0；分離培養(yǎng)基（g/ L）：蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏4，瓊脂20%（w），pH 7.0。以上培養(yǎng)基皆添加雙酚A溶液（經(jīng)少量無(wú)水乙醇助溶），使雙酚A 質(zhì)量濃度為60 mg/L，在121 ℃的條件下滅菌處理30 min。

活性污泥：取自沈陽(yáng)北部污水處理廠曝氣池。

1.2 菌株的馴化、分離和篩選

在富集培養(yǎng)基中富集耐雙酚A菌株后，再用含雙酚A的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行不斷地馴化，每隔6 d按10 mg/L的梯度增加雙酚A質(zhì)量濃度至60 mg/L。經(jīng)在分離培養(yǎng)基上多次平板劃線后，從25個(gè)菌落中通過(guò)鏡檢及降解能力實(shí)驗(yàn)，最后獲得一株以雙酚A為碳源且降解能力相對(duì)較強(qiáng)的純菌菌株D-17。

1.3 菌種鑒定

以革蘭氏染色結(jié)果、菌落特征和生理生化特性為菌株的初步鑒定依據(jù)。委托哈爾濱博仕技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列分析，應(yīng)用CLUSTALX 2.0及MEGA 5.10軟件構(gòu)建NJ（Neighbor-joining）進(jìn)化樹(shù)。

1.4 生長(zhǎng)及降解條件的優(yōu)化

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株D-17接種于含60 mg/L雙酚A的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以不同的溶液pH、接種量、降解溫度、搖床轉(zhuǎn)速、外加有機(jī)物為考察條件，振蕩搖床培養(yǎng)5 d，測(cè)定菌株的生長(zhǎng)情況及雙酚A降解效果。

1.5 分析方法

雙酚A質(zhì)量濃度的測(cè)定：將待測(cè)菌液置于離心機(jī)中離心（12 000 r/min，1 min），采用美國(guó)Varian公司Cary 50型紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液在波長(zhǎng)275 nm處的吸光度，以未接菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算雙酚A質(zhì)量濃度。

菌體濃度的測(cè)定：采用同上紫外分光光度計(jì)，測(cè)定待測(cè)菌液在 600 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD600），以此表征菌體濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株D-17的鑒定

菌株D-17菌落呈邊緣規(guī)則、淡黃色、不透明的圓形，表面凸起、濕潤(rùn)、光滑而有光澤，菌體無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，桿狀，靜止期呈圓形，大小為（0.7～1.3）μm×（0.3～2.1）μm；革蘭氏染色呈陰性。菌株D-17的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株D-17的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為乙酸鈣不動(dòng)桿菌，在Genbank中登錄號(hào)為AJ888983。菌株D-17的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖1。

2.2 菌株D-17的生長(zhǎng)曲線

在溶液pH為7.0、接種量為10%、降解溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，菌株D-17的生長(zhǎng)曲線和雙酚A降解率見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)：0～2 d時(shí)為菌株D-17的生長(zhǎng)停滯期，菌體濃度和雙酚A降解率都增長(zhǎng)緩慢；2～4 d時(shí)為菌株D-17的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，大量繁殖的菌株細(xì)胞使雙酚A的降解率迅猛增加；4～5 d時(shí)為菌株D-17的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，生長(zhǎng)曲線走勢(shì)較為平穩(wěn)，菌體濃度和雙酚A降解率變化不大，5 d時(shí)雙酚A降解率達(dá)到了最大值52.62%。因此，選定5 d為最佳降解時(shí)間。

圖1 菌株D-17的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 菌株D-17生長(zhǎng)與降解條件的確定

2.3.1 溶液pH對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)和降解性能的影響在接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時(shí)間為5 d的條件下，溶液pH對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響見(jiàn)圖3。

圖3 溶液pH對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響

由圖3可見(jiàn)：過(guò)酸和過(guò)堿的環(huán)境皆會(huì)對(duì)雙酚A的降解產(chǎn)生負(fù)面作用；溶液pH在6.0～8.0時(shí)，菌株D-17的生長(zhǎng)情況和雙酚A的降解情況均較佳，弱堿環(huán)境（pH=8.0）下略好于弱堿環(huán)境（pH=6.0）；溶液pH為7.0時(shí)，菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)及雙酚A降解狀況最優(yōu)。有報(bào)道稱(chēng)生物降解雙酚A過(guò)程中能產(chǎn)生一種中間產(chǎn)物4-丙烯酸羥丁酯，營(yíng)造出弱酸性的菌株生長(zhǎng)環(huán)境［21-23］。因此，將7.0選為菌株D-17的最適溶液pH。

2.3.2 接種量對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時(shí)間為5 d的條件下，接種量對(duì)對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)：接種量為1%～10%時(shí)，對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)及雙酚A降解效果的影響非常明顯，菌體濃度逐漸增大，雙酚A降解率明顯提高，說(shuō)明貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境會(huì)抑制好氧菌株細(xì)胞生長(zhǎng)和降解率提高［24］；接種量為10%時(shí)，菌株D-17生長(zhǎng)狀態(tài)及雙酚A降解效果都達(dá)到最佳；當(dāng)接種量超過(guò)10%時(shí)，接種量變化對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)狀況的影響不再明顯，此時(shí)菌株D-17數(shù)量過(guò)多，造成生長(zhǎng)所需雙酚A的量嚴(yán)重不足。故將10%作為培養(yǎng)菌株D-17的最佳接種量。

圖4 接種量對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響

2.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、降解溫度為30 ℃、降解時(shí)間為5 d的條件下，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)：在搖床轉(zhuǎn)速不足150 r/min時(shí)，菌株D-17的生長(zhǎng)曲線及雙酚A降解曲線隨搖床轉(zhuǎn)速的增加而呈上升趨勢(shì)，這可能是由于菌株D-17是好氧菌，而搖床轉(zhuǎn)速的加快增加了溶液的含氧量，進(jìn)而促進(jìn)菌株D-17的生長(zhǎng)及雙酚A的降解；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過(guò)高（大于150 r/min）時(shí)，菌株D-17菌體濃度及雙酚A降解率的增長(zhǎng)開(kāi)始變得遲緩。從能量和效率兩方面進(jìn)行思考，選擇150 r/min為菌株D-17降解雙酚A所用搖床轉(zhuǎn)速的最適值。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響

2.3.4 降解溫度對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解時(shí)間為5 d的條件下，降解溫度對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響見(jiàn)圖6。

圖6 降解溫度對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響雙酚A降解率：● 菌株D-17；■ 空白對(duì)照；

由圖6可見(jiàn)：降解溫度為30～35 ℃時(shí)，菌體濃度較高，雙酚A降解率較高；降解溫度低于30 ℃時(shí)，溫度的逐步增高導(dǎo)致菌體濃度和雙酚A降解率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)降解溫度超過(guò)35 ℃時(shí)，菌株D-17的生長(zhǎng)與代謝受到抑制，雙酚A降解率隨降解溫度的提高而逐漸變小。因此，將30 ℃設(shè)定為菌株D-17降解雙酚A所需降解溫度的最適值。

2.3.5 外加有機(jī)物種類(lèi)對(duì)菌株D-17生長(zhǎng)和降解性能的影響

在溶液pH為7.0、接種量為10%、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min、降解溫度為30 ℃、降解時(shí)間為5 d、外加有機(jī)物加入量為0.1%（w）的條件下，外加有機(jī)物種類(lèi)對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn)：葡萄糖、乳糖和蔗糖均可不同程度地抑制雙酚A的降解，尤其是葡萄糖使雙酚A降解率由原來(lái)（無(wú)外加有機(jī)物）的52.18%降低到40.37%；而蛋白胨和尿素對(duì)雙酚A的降解起到促進(jìn)效應(yīng)。相比雙酚A，葡萄糖、乳糖和蔗糖的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，菌株會(huì)優(yōu)先利用更易于被降解的外加有機(jī)物；而蛋白胨和尿素皆為微生物的生長(zhǎng)提供氮源，而且并不會(huì)與雙酚A產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，不造成有毒有害的影響；特別是蛋白胨的加入對(duì)菌株D-17的生長(zhǎng)及雙酚A降解的促進(jìn)效果尤佳，可使雙酚A降解率增加到57.15%。由此可見(jiàn)，對(duì)比其他4種外加有機(jī)物，蛋白胨是菌株D-17生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中最佳的一個(gè)。

圖7 外加有機(jī)物種類(lèi)對(duì)雙酚A降解率和OD600的影響

3 結(jié)論

a）從沈陽(yáng)北部污水處理廠曝氣池活性污泥中馴化、分離及篩選得到一株以雙酚A為碳源的高效菌株D-17，經(jīng)鑒定為乙酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）。

b）菌株D-17的生長(zhǎng)和降解雙酚A的最適條件為：溶液pH 7.0、接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、降解溫度30 ℃、降解時(shí)間5 d。在最適條件下，雙酚A（初始質(zhì)量濃度60 mg/L）的降解率達(dá)到52.62%。投加0.1%（w）葡萄糖、乳糖和蔗糖可抑制菌株D-17降解雙酚A，而當(dāng)添加0.1%（w）蛋白胨和尿素時(shí)，菌株D-17的生長(zhǎng)和雙酚A的降解均得到了一定程度的促進(jìn)，當(dāng)?shù)鞍纂思尤肓繛?.1%（w）時(shí)，雙酚A降解率可增加至57.15%。

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（編輯 葉晶菁）

Screening，identification of a bisphenol A-degrading strain and its growth and degradation conditions

Wang Di1，Ma Xiping1，Meng Xuelian2，Dong Wenling1，Dong Xing1，Xu Chengbin1
（1. School of Environmental Science，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China；2. School of Pharmacy，Liaoning University，Shenyang Liaoning 110036，China）

A high-effi ciency degradating strain D-17，which could use bisphenol A（BPA）as sole carbon source，was obtained by acclimation，isolation and screening from activated sludge in a aeration tank of Shenyang northern sewage treatment plant. The strain was identified by morphological，physiological and biochemical analysis and 16S rDNA gene sequence analysis，and its growth and degradation conditions were studied. The identifi cation results showed that D-17 was an Acinetobacter calcoaceticus strain. The optimum conditions for D-17growth and BPA degradation were as follows：solution pH 7.0，inoculation amount 10%，rotary speed 150 r/min，degradation temperature 30 ℃ and degradation time 5 d. When the initial mass concentration of BPA was 60 mg/L，the BPA degradation rate was 52.62%；With the addition of peptone，the BPA degradation rate was increased to 57.15%.

Acinetobacter calcoaceticus；bisphenol A；strain identifi cation of；degradation condition

X172

A

1006-1878（2017）02-0189-05

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.02.011

2016 - 08 - 04；

2016 - 12 - 19。

王迪（1991—），女，遼寧省本溪市人，碩士生，電話 13840401260，電郵 13840401260@163.com。聯(lián)系人：徐成斌，電話 13840149575，電郵 xuchengbin80@163.com。

國(guó)家“十二五”科技重大專(zhuān)項(xiàng)子課題（2012ZX072020 03-05）；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目（L2015202）；2016年遼寧省級(jí)本科教改立項(xiàng)項(xiàng)目。