朱嘉瑋+張洪艷+楊衛(wèi)平+馬倩

摘要：脫氧核糖核酸（DNA）是染色體的重要組成部分，是一種主要的遺傳物質(zhì)，很多實(shí)驗(yàn)方法與理論模型被用來(lái)研究DNA與一些重要生物物種相互作用引起的構(gòu)象變化。采用激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）系統(tǒng)研究了一種特定單鏈DNA（ssDNA）分別與其互補(bǔ)DNA（cDNA）和汞離子（Hg2+）作用后的構(gòu)象變化。將一端有熒光分子的 ssDNA修飾在表面等離子體共振系統(tǒng)傳感芯片上，通過(guò)觀察熒光圖像的變化來(lái)確定ssDNA與cDNA及Hg2+之間相互作用而導(dǎo)致的構(gòu)象變化，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線計(jì)算出二者的結(jié)合速率分別為3.33×10-5 s-1和1.42×10-4 s-1。對(duì)于ssDNAcDNA的相互作用，熒光圖像沒(méi)有變化。對(duì)于ssDNAHg2+的相互作用，在通入Hg2+后熒光發(fā)生猝滅。這些結(jié)果表明，激光掃描共聚焦表面等離子體共振系統(tǒng)在高靈敏實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ssDNA與其他特殊生物分子作用產(chǎn)生的構(gòu)象變化和計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）； 構(gòu)象變化； 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

中圖分類號(hào)： R 318.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2017.02.003

文章編號(hào)： 1005-5630（2017）02-00012-06

引 言

利用顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)高分辨率的無(wú)損檢測(cè)在材料研究、生物醫(yī)學(xué)研究和半導(dǎo)體制造方面有著重要的作用。早在1957年，共聚焦顯微鏡被發(fā)明出來(lái)時(shí)，Minsky首次闡明共聚焦顯微鏡的工作原理[1]。作為一種先進(jìn)的顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡為我們分析微觀結(jié)構(gòu)提供了很大的方便，在近幾年也得到了很大的發(fā)展。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描和成像，進(jìn)行無(wú)損觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)[2]。作為一種新型的高分辨率分析手段，激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，比如生物學(xué)、材料科學(xué)、納米技術(shù)等[3]。但是，激光掃描共聚焦顯微鏡一般用于定性分析，不易直接從熒光強(qiáng)度的變化來(lái)進(jìn)行定量分析。

表面等離子體共振（SPR）傳感器近幾年被廣泛應(yīng)用于生物及化學(xué)檢測(cè)。最早在1902年由Wood[4]發(fā)現(xiàn)SPR現(xiàn)象，并在1968年由Kretschmann等[5]利用衰減全反射棱鏡耦合的方法激發(fā)出SPR現(xiàn)象，為后來(lái)SPR傳感器發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。該傳感檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、無(wú)需標(biāo)記、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)。因?yàn)镾PR傳感技術(shù)是根據(jù)高靈敏反射光的變化來(lái)檢測(cè)，所以可以無(wú)標(biāo)記地檢測(cè)在水中或者空氣中的污染物。SPR系統(tǒng)可以實(shí)時(shí)地檢測(cè)并能夠直觀地看到生物分子間相互作用的過(guò)程[6-8]，但是SPR信號(hào)的變化不能直接反應(yīng)生物分子間相互作用之后發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化[9-13]。

本文采用激光掃描共聚焦表面等離子體共振（LSCISPR）系統(tǒng)，分別對(duì)ssDNAcDNA作用和ssDNAHg2+作用進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該檢測(cè)系統(tǒng)利用SPR的高靈敏度和激光掃描共聚焦顯微成像的熒光可視化，把光學(xué)和生物學(xué)緊密結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子間作用的檢測(cè)。SPR檢測(cè)靈敏度高，金膜表面發(fā)生的一切變化，包括生物分子的結(jié)合、分解以及結(jié)構(gòu)變化都會(huì)引起SPR信號(hào)的改變，但是只有動(dòng)力學(xué)曲線并不能直觀地說(shuō)明生物分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了何種改變，因此利用表面等離子體共振（LSCI）系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)生物分子染色，可以很直觀地觀察被染色的生物分子與某種物質(zhì)發(fā)生作用后結(jié)構(gòu)發(fā)生了何種改變，比如是形成了雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)還是饋折變化等。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明，通入cDNA后，SPR信號(hào)增強(qiáng)，隨后通入緩沖液來(lái)證實(shí)該信號(hào)增強(qiáng)并不是折射率變化引起，而是生物分子間作用引起的變化，但熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化，說(shuō)明ssDNA的構(gòu)象變化并沒(méi)有使熒光發(fā)生猝滅，而是遵循沃森克里克[14]當(dāng)年提出來(lái)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式，即cDNA能與ssDNA形成兩條相互反平行盤(pán)繞成直徑為2 nm的雙螺旋結(jié)構(gòu)。通入Hg2+后，SPR信號(hào)同樣增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度明顯減弱，這是因?yàn)镠g2+的通入產(chǎn)生一種T-Hg2+T復(fù)雜結(jié)構(gòu)使得ssDNA帶有熒光一端發(fā)生折疊導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅[15]。LSCI-SPR在高靈敏實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ssDNA與其他特殊生物分子作用產(chǎn)生的構(gòu)象變化和得到相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

LSCI-SPR系統(tǒng)原理圖如圖1所示。波長(zhǎng)型SPR傳感系統(tǒng)是自主搭建的一套系統(tǒng)設(shè)備，白光光源由發(fā)光二極管發(fā)出平行光，經(jīng)過(guò)偏振片產(chǎn)生P偏振光，再經(jīng)過(guò)BK7直角棱鏡，反射光由裝有光電倍增管的光纖光譜儀采集。入射角可以通過(guò)平臺(tái)上的兩個(gè)旋轉(zhuǎn)臺(tái)隨意調(diào)節(jié)來(lái)確定最佳的入射角度。生物傳感基片的制備是用BK7玻璃片作為基底，在表面鍍上4 nm的鉻和50 nm的金。鍍有金膜的一面與流通槽接觸，另一面用匹配液與棱鏡結(jié)合使其折射率和棱鏡的折射率相同。棱鏡、傳感基片和流通槽與LSCI的倒置顯微鏡頭相互固定。采用40倍物鏡來(lái)采集ssDNA的熒光圖像，熒光用波長(zhǎng)為488 nm的多行氬激光器激發(fā)。焦平面設(shè)定在金膜面上，這樣可以觀察到ssDNA在與cDNA及Hg2+相互作用時(shí)的熒光圖像。樣品溶液通過(guò)注射泵注入流通池。

實(shí)驗(yàn)中所需溶劑為ssDNA溶液，物質(zhì)的量濃度為3 μmol/L，TE緩沖液（呈弱堿性，對(duì)DNA的堿基具有保護(hù)作用）以及不同物質(zhì)的量濃度的cDNA溶液與不同物質(zhì)的量濃度Hg2+溶液，將cDNA溶液用TE緩沖液依次稀釋成0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L。Hg2+溶液物質(zhì)的量濃度為0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L。DNA在TE緩沖液中穩(wěn)定性較好，不易破壞其完整性或產(chǎn)生開(kāi)環(huán)及斷裂。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

將金膜用乙醇溶液、乙醇和去離子水（各50%）混合溶液、去離子水各超聲10 min，吹干后用Plasma儀器對(duì)金膜表面處理10 min，處理過(guò)后浸泡在0.3 μmol/L的ssDNA溶液中24 h，估算得到ssDNA的表面覆蓋率為293 ng/cm2。所用的ssDNA分子結(jié)構(gòu)中5端接有巰基（-SH）能夠與使用的金膜相連接，3端接有紅色染色劑羅丹明染料分子。取出浸泡后的金膜用TE緩沖液緩慢沖洗，洗掉沒(méi)有接在金膜上的ssDNA。將修飾了ssDNA的金膜用匹配液與棱鏡結(jié)合后固定在SPR儀器中，同時(shí)調(diào)節(jié)光路，光路調(diào)節(jié)好后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，先通入TE緩沖液，基線平穩(wěn)后，通入不同物質(zhì)的量濃度的cDNA溶液。所有溶液通入的速率為1 μL/min。實(shí)驗(yàn)中DNA的相互作用過(guò)程都能被LSCI-SPR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)都在25 ℃下進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

用LSCI-SPR系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)ssDNA與cDNA及Hg2+相互作用時(shí)的SPR信號(hào)的變化以及熒光圖像的變化，在ssDNA中通入cDNA的熒光圖如圖2所示，通入Hg2+的熒光圖如圖3所示，所有熒光圖均在標(biāo)尺為10 μm范圍內(nèi)拍攝。在基線平穩(wěn)后分別通入事先稀釋好的cDNA溶液和Hg2+溶液，cDNA的SPR曲線圖如圖4所示，Hg2+的SPR曲線圖如圖5所示。圖4和圖5縱坐標(biāo)Ig表示IR與I0的比值，其中I0表示入射光強(qiáng)，IR表示反射光強(qiáng)。圖4（a）與圖5（a）的動(dòng)力學(xué)曲線是通入溶液后反應(yīng)的實(shí)時(shí)信號(hào)曲線，通入一段時(shí)間后，由于cDNA和Hg2+都能與ssDNA發(fā)生特異性作用，因此SPR信號(hào)上升，繼續(xù)通入溶液后，基線趨于平穩(wěn)，反應(yīng)過(guò)程結(jié)束。圖4（b）和圖5（b）為三次平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差圖，誤差較小，說(shuō)明在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，有著良好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)前后的SPR信號(hào)可以估算出在物質(zhì)的量濃度為10 μmol/L時(shí)的ssDNAcDNA反應(yīng)的結(jié)合速率為3.33×10-5 s-1，物質(zhì)的量濃度為10 nmol/L時(shí)的ssDNAHg2+反應(yīng)的結(jié)合速率為1.42×10-4 s-1。由于是在室溫25 ℃的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)合速率會(huì)比在37 ℃條件下的結(jié)合速率慢。從熒光圖像可以看出，當(dāng)通入不同物質(zhì)的量濃度的cDNA溶液時(shí)，SPR信號(hào)增強(qiáng)明顯而熒光幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，這是由于ssDNAcDNA遵循沃森克里克機(jī)制形成雙鏈DNA。但是在通入Hg2+后，SPR信號(hào)增強(qiáng)，熒光則有了明顯減弱，隨著Hg2+物質(zhì)的量濃度的增加，熒光猝滅明顯。這說(shuō)明Hg2+不但與ssDNA發(fā)生了特異性作用，并且產(chǎn)生一種特殊的THg2+T復(fù)雜結(jié)構(gòu)，使得帶有熒光的ssDNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，接有羅丹明染色劑的一端發(fā)生折疊靠近金膜表面，表面等離子共振能在很短的距離使得熒光猝滅。通過(guò)LSCISPR系統(tǒng)實(shí)時(shí)地記錄整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。

3 結(jié) 論

本文采用LSCI-SPR系統(tǒng)監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明，ssDNA與cDNA能夠發(fā)生特異性作用，雖然改變了ssDNA的構(gòu)象形成雙鏈DNA，但不能使熒光發(fā)生猝滅，而Hg2+在與ssDNA發(fā)生特異性作用的同時(shí)也改變了ssDNA的構(gòu)象使得熒光一端折疊，接近金膜表面讓熒光猝滅。通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算出ssDNAcDNA以及ssDNAHg2+的結(jié)合速率分別為3.33×10-5 s-1、1.42×10-4 s-1。LSCISPR系統(tǒng)有著檢測(cè)快速、實(shí)時(shí)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在監(jiān)測(cè)生物分子間相互作用過(guò)程有著重要作用。不僅能夠通過(guò)SPR信號(hào)的變化反映生物分子間特異性作用，還能通過(guò)熒光的變化來(lái)反映生物分子構(gòu)象的改變。LSCISPR系統(tǒng)在高靈敏實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)ssDNA與其他特殊生物分子作用產(chǎn)生的構(gòu)象變化，有著廣闊的應(yīng)用前景。

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（編輯：張磊）