毛慧芳 彭杰娣 楊棨博 周毅峰 田國(guó)政 劉曉鵬 唐巧玉 方慶

摘要[目的]鑒定一株來(lái)源于土壤的耐鹽酵母菌并探討其與植物的互作關(guān)系。[方法]對(duì)分離自恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤的一株真菌YSTEn005進(jìn)行鑒定，并研究鹽脅迫下其與植物的互作關(guān)系。[結(jié)果]條件生長(zhǎng)試驗(yàn)表明，YSTEn005對(duì)NaCl的最高耐受水平可達(dá)10%，而對(duì)高濃度的K+不敏感。YSTEn005最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，在含4%鹽的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快；其對(duì)pH耐受范圍較寬，可在pH 4.0～9.0條件下生長(zhǎng)。顯微鏡下觀察YSTEn005是單細(xì)胞形態(tài)，菌體呈橢球型，并能夠行類(lèi)似酵母的出芽生殖?？寺∑?8S rDNA，序列分析表明該真菌與高耐鹽酵母——漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）的親緣關(guān)系最近，推測(cè)YSTEn005很可能是漢遜德巴利酵母的一株變異種。該菌和擬南芥幼苗共培養(yǎng)顯示，YSTEn005的增殖可顯著降低植株在鹽脅迫下的存活率。[結(jié)論]試驗(yàn)得到一株耐鹽酵母菌YSTEn005，該菌不能改善植物對(duì)鹽分的耐受性能。

關(guān)鍵詞真菌；耐鹽酵母菌；漢遜德巴利酵母；土壤

中圖分類(lèi)號(hào)S154.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）21-0004-03

Identification of A Strain of Salttolerance Halophilic Yeast from Soil and Its Interaction with Plant

MAO Huifang1，2，PENG Jiedi2，YANG Qibo3，F(xiàn)ANG Qing1，2* et al（1.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Enshi，Hubei 445000；2.College of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000； 3.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000）

Abstract[Objective] The aim was to identify a strain of salttolerance halophilic yeast from soil and study its interaction with plant.[Method] A halophilic yeast YSTEn005 was isolated from the Pinus massoniana rhizosphere soil in Enshi，and it interaction with plant was explored under salt stress.[Result] YSTEn005 could grow on the medium supplemented with up to 10% NaCl，and it appeared in sensitive to K+；the optimum growth temperature of YSTEn005 was 28 ℃，and growth rate was higher in medium with 4% NaCl than other series of degrees；YSTEn005 was tolerant to wide pH relatively，which ranged from 4.0 to 9.0.YSTEn005 was single cell pattern under microscope，and displayed budding similar to that of yeast.Cloning its 18S rDNA and analysis the sequence indicated that the YSTEn005 was evolutionally close to Debaryomyces hansenii，which is a halophilic yeast，suggesting that YSTEn005 was from this genus.When cocultured with plants，YSTEn005 growth promoted Arabidopsis seedlings dying significantly under salt stress conditions.[Conclusion] A strain of halophilic yeast YSTEn005 is obtained from soil，and the YSTEn005 growth is not helpful to plants tolerant to salt stress.

Key wordsFungi；Halophilic yeast；Debaryomyces hansenii；Soil

特殊生境（如鹽堿土壤、沼澤濕地）對(duì)真菌的類(lèi)群有重要影響。長(zhǎng)期生態(tài)適應(yīng)，真菌類(lèi)群很可能變化較大[2，5，8，11]。針對(duì)該地域的土壤，篩選真菌具有重要意義。恩施地處鄂西南山地，境內(nèi)土壤多由灰質(zhì)巖母巖風(fēng)化而來(lái)[12]，植物種類(lèi)繁多，其中馬尾松分布較廣。筆者采集湖北省恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤，進(jìn)行土壤真菌篩選，獲得了一株耐鹽真菌，并研究了其與植物的互作關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品。菌株篩選土樣取自湖北省恩施市龍洞河附近的馬尾松根部5～8 cm深的土壤。

1.1.2培養(yǎng)基。菌株篩選采用馬丁氏培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀 1.0 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，NaCl 0～12%，pH 6.5；條件生長(zhǎng)試驗(yàn)采用馬丁氏液體培養(yǎng)基；大腸桿菌DH5α培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基。

1.1.3分子克隆試劑。TE buffer，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH 8.0；PCR擴(kuò)增用Taq（Promega）， T4 DNA ligase與克隆載體pMD18-T[TaKaRa（大連）公司]；ddH2O；擴(kuò)增引物（江蘇南京金斯瑞公司）（上游引物：GTAGTCATATGCTTGTCT；下游引物：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG）。

1.2方法

1.2.1土壤懸液制備與菌株篩選。90.0 mL無(wú)菌水懸浮土樣10 g，于250 mL三角燒瓶中，150 r/min振蕩搖勻，25 ℃培養(yǎng)24 h；按照10-6至 10-1梯度稀釋培養(yǎng)后的土壤溶液，取樣品稀釋液0.1 mL涂布于馬丁氏培養(yǎng)基中（含NaCl濃度分別為 2%、4%～12%）， 28 ℃培養(yǎng)2～3 d；選取在含4%～10% NaCl的馬丁氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，劃線分離單菌落，對(duì)分離單菌落再次進(jìn)行耐鹽性鑒定。

1.2.2耐受NaCl和KCl能力分析。將篩選出的YSTEn005菌株用無(wú)菌水懸浮，點(diǎn)1 μL于含不同濃度NaCl和KCl的馬丁氏固體培養(yǎng)基上，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3條件生長(zhǎng)試驗(yàn)。初始接種量保持相同，分別在不同溫度（25、28、37 ℃）、pH（4.0～9.0）及含不同濃度的NaCl （2%～11%）等條件下振蕩培養(yǎng)（200 r/min）YSTEn005，每隔12 h取樣并檢測(cè)OD600。

1.2.4形態(tài)觀察。取樣品用生理鹽水稀釋?zhuān)科筮M(jìn)行顯微鏡觀察。

1.2.5基因組DNA抽提。離心收集3 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的菌體，TE溶液洗滌2次后，加入200 μL TE懸浮菌體，沸水浴10 min，收集上清，異丙醇沉淀DNA，并用75%乙醇洗滌1次后，晾干后加入ddH2O溶解。

1.2.618S rDNA 克隆。以真菌基因組DNA為模板，采用真菌引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：引物（上、下游混合） 1 μL，DNA模板3 μL，Taq酶10 μL，加入6 μL無(wú)菌水定容至20 μL。PCR程序： 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)。

1.2.7序列分析。序列測(cè)定由金斯瑞公司（南京）完成；NCBI在線Blast，DNAMAN序列比對(duì)，使用MEGA 6.0 Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.8菌-植共培養(yǎng)。培養(yǎng)無(wú)菌擬南芥幼苗，置于涂布有YSTEn005（菌液濃度OD600=0.02）的1/4 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)（22 ℃ 18 h光照、20 ℃ 6 h黑暗）3 d。

2結(jié)果與分析

2.1耐鹽能力與菌體形態(tài)28 ℃培養(yǎng)3 d，挑取19個(gè)能夠在4%～10%鹽生長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行二次篩選，其中1株（命名為YSTEn005）能夠在較高鹽濃度下生長(zhǎng)。分別在含不同濃度的KCl、NaCl 培養(yǎng)基上進(jìn)行耐性鑒定，如圖1A所示，該菌可在4%～10% KCl條件下生長(zhǎng)，并且菌斑大小無(wú)明顯差異，表明YSTEn005可能對(duì)K+不敏感；YSTEn005可在10%的鹽濃度下生長(zhǎng)，但相較4% NaCl情況下，菌體生長(zhǎng)明顯變慢，表明10% NaCl濃度對(duì)YSTEn005細(xì)胞增殖抑制明顯；使用油鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該真菌是單細(xì)胞形態(tài)，菌體呈橢球體形，并且行出芽生殖（圖1B）。注：A.不同KCl和NaCl條件下培養(yǎng)3 d；B.油鏡觀察YSTEn005細(xì)胞形態(tài)

YSTEn005在28 ℃下細(xì)胞增殖最快（圖2A）；在4% NaCl濃度下菌體生長(zhǎng)最快， 其次是2% NaCl （圖2B），表明液體培養(yǎng)條件下其最適的鹽濃度為4%；其對(duì)pH的耐受范圍較寬，可在pH為4.0～9.0的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但是在pH 5.0的條件下細(xì)胞增殖最快（圖2C）。

巴利酵母（D.hansenii）[13-16]（如HQ717147）的18S rDNA序列相似性最高；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，表明該耐鹽菌YSTEn005來(lái)源于漢遜德巴利酵母屬（圖3），其很可能是漢遜德巴利酵母的一個(gè)變種。

2.4YSTEn005與植物幼苗互作關(guān)系采用平板共培養(yǎng)方法研究YSTEn005和植物之間的互作關(guān)系，結(jié)果表明，在不添加鹽分（NaCl）的平板上，相較于對(duì)照組（-N-Y），該菌增殖降低了植物的存活率，表明YSTEn005增殖對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生影響（圖4，-N-Y，-N+Y）；而在0.8% NaCl的條件下，有YSTEn005增殖的平板中幼苗存活率降低70%左右（圖4，+N-Y，+N+Y）。YSTEn005增殖情況下幼苗存活率銳減，表明該菌增殖顯著加劇，植物在鹽脅迫下死亡。

馬尾松在鄂西恩施地區(qū)分布較廣，生長(zhǎng)良好。該研究從恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤中分離出一株耐鹽真菌YSTEn005。顯微觀察、18S rDNA序列分析及條件生長(zhǎng)試驗(yàn)表明，YSTEn005很可能是漢遜德巴利酵母的一個(gè)變種。漢遜德巴利酵母對(duì)高鹽濃度脅迫具有自然的耐受性能，其耐受機(jī)制逐漸受到重視[13-14，17]，成為研究真核微生物細(xì)胞耐鹽的重要模式種。另外，漢遜德巴利酵母潛在的生物技術(shù)應(yīng)用能力受到關(guān)注，如特殊糖醇的發(fā)酵生產(chǎn)、果品保藏、廢水處理等[18-20]。

我國(guó)土壤鹽堿化情況不容樂(lè)觀，鹽堿土壤的含鹽量在0.6%～10.0%，即對(duì)植物生產(chǎn)造成較大危害[21-23]。該試驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)YSTEn005與擬南芥幼苗共培養(yǎng)，加劇了鹽脅迫下幼苗的死亡。以上表明，該菌過(guò)度繁殖并未改善植物耐鹽性能?？赡苁侵参锸艿皆摼那秩?，誘發(fā)植物凋亡。模擬土壤中該菌和植物互作關(guān)系，從而進(jìn)一步研究實(shí)際條件下該菌的調(diào)節(jié)方式，將有助于揭示特殊生境中真菌對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能。

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