楊彩娟 溫肖會(huì) 任裕其 冼望強(qiáng) 劉暖華 謝樂(lè)新

摘要[目的]研究塞尼卡病毒A VP1基因的遺傳變異情況。[方法]通過(guò)RT-PCR方法從廣東省2個(gè)豬場(chǎng)的病料中擴(kuò)增出塞尼卡病毒A陽(yáng)性樣品，并對(duì)其VP1基因進(jìn)行了基因組擴(kuò)增和序列分析。[結(jié)果]2個(gè)塞尼卡病毒A VP1基因與GenBank公布的巴西、美國(guó)、中國(guó)等毒株的同源性為92%～99%，與2002年美國(guó)分離株SVV-001的同源性分別為92.8%和92.7%，與我國(guó)分離株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性最高達(dá)99.1%。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)，毒株VP1基因組存在散在突變點(diǎn)，表明毒株可能存在一定程度的變異。[結(jié)論]研究結(jié)果可為我國(guó)塞尼卡病毒A的深入研究和豬水皰樣癥狀病的鑒別診斷提供參考。

關(guān)鍵詞塞尼卡病毒A；PCR鑒定；VP1；遺傳變異分析

中圖分類(lèi)號(hào)S855.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）26-0106-03

Phylogenetic Analysis of VP1 Gene of Senecavirus A

YANG Caijuan1，WEN Xiaohui2，REN Yuqi1，XIE Lexin1*et al

（1.The Supplies Reserve Center for Animal Disease Control and Prevention of Guangdong Province，Guangzhou，Guangdong 510520；2.Institute of Animal Health， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract[Objective]To study the genetic variation of senecavirus A VP1 gene.[Method]The positive samples of SVV in swine with vesicular symptom from two farms of Guangdong were amplified by RTPCR method.

The sequencing and phylogenetic analysis was made on Senecavirus A VP1.[Result]The homology between VP1 gene of these two strains and Brazil，USA and Chinese historical isolates on GenBank was 92%-99%.The homology between VP1 of these two strains and USA isolate SVV-001 in 2002 were 92.8% and 92.7% respectively. The highest homology of SVA VP1 gene with Chinese isolates CH-02-2015， CH-03-2015 and CH-04-2015 reached 99.1%.Sequencing analysis results showed that the VP1 gene existed scatter point，which suggested that the virus had evolved.[Conclusion]The research results can provide references for further study and differential diagnosis of SVA.

Key wordsSenecavirus A；PCR identification；VP1；Genetic variation analysis

塞尼卡病毒A（Senecavirus A，SVA），曾被稱(chēng)為塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV），是無(wú)囊膜的單股正鏈 RNA 病毒，是小 RNA 病毒科（Picornaviridae）塞尼卡病毒屬（Senecavirus）的唯一成員，與心肌炎病毒屬遺傳關(guān)系最近，可引起豬出現(xiàn)水皰性變化和新生仔豬死亡，成年豬感染通常呈亞臨床感染，引起繁殖母豬和公豬鼻吻和冠狀帶、蹄部出現(xiàn)水皰樣病變，偶見(jiàn)腹瀉癥狀。1～3 日齡新生仔豬病死率可達(dá) 30%～70%[1] 。2014 年秋，巴西報(bào)道出現(xiàn)大量仔豬斷奶前發(fā)病，1～4 日齡仔豬病死率達(dá) 30 %～70 %，送檢病料排除了其他水皰性病毒病和細(xì)菌病，SVV 核酸陽(yáng)性。截至 2015 年9 月底，美國(guó)已有 11 個(gè)州確診豬只發(fā)生 SVV 感染[2]，而加拿大、意大利和巴西出現(xiàn)疑似 SVV 感染病例[2]。我國(guó)關(guān)于該病的首次報(bào)道是在2015年，并命名為 CH-01-2015，該病毒與其他 8株分離自加拿大、巴西和美國(guó)的 SVA 同源性高達(dá) 94.4%～97.1%[3]。盡管該病自身造成的損失有限，但由于該病與口蹄疫（FMD）、豬水皰?。⊿VD）、豬水皰疹（VES）及水皰性口炎（VS）極為相似，臨床上很難區(qū)分。因此，應(yīng)加強(qiáng)該病與上述疾病的鑒別診斷。 SVA基因組全長(zhǎng)約7.2 kb，編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～4）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（2 A～C，3 A～D）；4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的長(zhǎng)度分別由265、286、241、74個(gè)殘基組成[4]。其中， VP1 被公認(rèn)為是小 RNA 病毒科免疫原性最強(qiáng)的蛋白[5]。筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的有水皰樣癥狀但口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹及水皰性口炎等4種病原檢測(cè)結(jié)果呈陰性的病料樣品進(jìn)行了SVA核酸檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)到的2份陽(yáng)性樣品進(jìn)行了SVA VP1基因擴(kuò)增和分析，研究廣東省豬場(chǎng)SVA VP1遺傳演化情況，旨在為豬場(chǎng)水皰樣癥狀病的綜合防控提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1病料樣品臨床病料樣品為2016年下半年廣東省茂名、博羅地區(qū)提供的口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹及水皰性口炎鑒定結(jié)果呈陰性的病豬內(nèi)臟、水皰拭子等病料。

1.2主要試劑pMD18-T載體、病毒基因組RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker，均購(gòu)自大連TaKaRa公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒為U-gene公司產(chǎn)品。

1.3VP1基因擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank中收錄的SVV-001（DQ641257）的基因組序列的VP1基因保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR鑒定引物P1、P2，擴(kuò)增目的片段為429 bp。根據(jù)GenBank中收錄的SVV-001（DQ641257）的基因組序列VP1基因，設(shè)計(jì)SVA VP1全基因序列擴(kuò)增引物，分別位于VP3和2A區(qū)域[6]，擴(kuò)增目的片段大小為983 bp，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

SVA PCR擴(kuò)增引物序列為：P1為5-GTTCCACTCCACCGACAA-3，P2為5- AAACCACCCTACAGCAAAT-3。SVA VP1全基因序列擴(kuò)增引物序列為：SVA-1C556F為5- TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3，SVA-2A22R為5-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC -3。

1.4病毒RT-PCR擴(kuò)增及鑒定用病毒基因組RNA提取試劑盒從保存的水皰液中提取病毒基因組RNA。以基因組RNA為模板，以P1、P2為引物，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增過(guò)程（一步法）：25 μL的反應(yīng)體系中，PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Template RNA 2 μL，加RNase Free dH2O 補(bǔ)足25 μL。 PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次； 72 ℃延伸7 min。同時(shí)，采用 RT-PCR 方法檢測(cè) FMDV、豬水皰病病毒（SVDV）、水皰性口炎病毒（VSV）、豬水皰疹病毒（VESV）、豬 2 型圓環(huán)病毒（PCV2）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）和豬輪狀病毒，并設(shè)置陰性對(duì)照。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將經(jīng)膠回收純化的 PCR 產(chǎn)物克隆至pMD19-T中，重組質(zhì)粒由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.5VP1基因的PCR擴(kuò)增與克隆鑒定用病毒基因組RNA提取試劑盒從保存的水皰液中提取病毒基因組RNA。以基因組RNA為模板，以SVV-1C556F、SVV-2A22R為引物[6]，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PrimeScript One Step Enzyme Mix 1 μL，2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，Template RNA 2 μL，補(bǔ)RNase Free dH2O至25 μL。 PCR反應(yīng)程序如下：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共循環(huán)35次； 72 ℃延伸7 min。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將經(jīng)膠回收純化的 PCR 產(chǎn)物克隆至pMD19-T中，重組質(zhì)粒由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成測(cè)序。

1.6基因序列遺傳進(jìn)化分析應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的BLAST、生物學(xué)分析DNAStar、ClustalX 2 和 MEGA 6.0軟件對(duì)擴(kuò)增的核苷酸序列與 GenBank 中登錄的 SVA的VP1基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并將所測(cè)序列登錄至 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)。

2結(jié)果與分析

2.1SVA的RT-PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

被檢測(cè)的2份樣本（L1、Q3）中均擴(kuò)增顯示陽(yáng)性。擴(kuò)增的目的片段大小約為430 bp，與預(yù)期大小相符，而其他豬病病毒及陰性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，L1與我國(guó)分離到的毒株SVA CH-02-2015（KX173339）、SVA CH-03-2015（KX17338）、SVA CH-04-2015（KX173340）相似性高，相似性在98%以上。因此，初步認(rèn)定所擴(kuò)增到的產(chǎn)物為SVA。

2.3VP1基因同源性及遺傳進(jìn)化分析

VP1基因序列比對(duì)結(jié)果（圖3）表明，CH-GDZJ-2016、CH-GDBL-2016 的VP1基因與2002年美國(guó)分離株的SVV-001相比，同源性分別為92.8%和92.7%；CH-GDZJ-2016 的VP1基因與美國(guó)2015年的分離株USA/IA46008/2015/Passage 1、SVVA/USA/IA40381/2015_P1和SVVA/USA.IA40380/2015_P1的同源性分別為96.3%、96.7%和96.7%，CH-GDBL-2016與上述3個(gè)美國(guó)分離株的同源性分別為96.8%、97.3%和97.3%；CH-GDZJ-2016、CH-GDBL-2016 的VP1基因與我國(guó)2015年的分離株CH-01-2015相比，同源性為95.8%和95.9%；與CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015的同源性均在98%以上。CH-GDZJ-2016與巴西分離株BRA/UEL-SenV-B4/15 VP1、BRA/UEL-SVV-A1/15 VP1、BRA/UEL-SVV-B2/15 VP1和SVVA/BRA/UEL/SenV-E10/15 VP1的同源性分別為96.5%、96.5%、96.9%和96.7%，CH-GDBL-2016與以上4個(gè)巴西分離株的同源性分別為97.0%、97.0%、97.4%和97.2%。

從圖4可以看出，試驗(yàn)中鑒定的2個(gè)毒株與我國(guó)2015年分離的毒株CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015在一個(gè)小分支上，而與CH-01-2015屬于不同的小分支，與美國(guó)2008年的分離株SVV-001存在較大差異。

3討論與結(jié)論

SVA最初分離自細(xì)胞培養(yǎng)基[7]。2002年，由美國(guó)基因治療公司在使用PER.C6細(xì)胞（轉(zhuǎn)化的胎兒成視網(wǎng)膜細(xì)胞）培養(yǎng)腺病毒-5（Ad5）病毒載體時(shí)分離到塞尼卡病毒-001（SVV-001）[8]。此后的十多年內(nèi)，美國(guó)獸醫(yī)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室（NVSL）從不同州的豬樣品中分離到12株與SVV-001相似的病毒株[9]。目前，全世界范圍內(nèi)多個(gè)國(guó)家已經(jīng)有關(guān)于該病的報(bào)道。2015年，我國(guó)首次報(bào)道有該病的發(fā)生。2016年，在廣東省湛江、惠州地區(qū)一些豬場(chǎng)相繼發(fā)生水皰性疾病，感染豬臨床表現(xiàn)為跛行，嗜睡，鼻吻、口腔黏膜出現(xiàn)水皰，冠狀帶和蹄壁周?chē)l(fā)紅，出現(xiàn)潰瘍性病變，短暫性發(fā)熱，傳播速度快，但未出現(xiàn)死亡病例，發(fā)病時(shí)間持續(xù)1～2周，經(jīng)檢測(cè)排除口蹄疫、豬水皰病、豬水皰疹、水皰性口炎等疾病。從病料中擴(kuò)增出SVA病毒核酸陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為SVA。

愛(ài)荷華州立大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室將 SVA毒株VP1和全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，所有的新分離毒株間的同源性高達(dá)為99%～100%，但與早期 SVA（1988—2001年）序列差異顯著。美國(guó) SVA 毒株與巴西 SVA毒株的同源性為97%～98%。進(jìn)化樹(shù)分析表明，近30 年來(lái)SVA已發(fā)生變異，致病性增強(qiáng)[10]。該試驗(yàn)中的2個(gè)毒株與2015年我國(guó)分離的CH-01-2015同源性較其與CH-02-2015、CH-03-2015、CH-04-2015毒株的同源性高，從進(jìn)化樹(shù)來(lái)看屬于不同的小分支。它們與美國(guó)、巴西分離株在VP1基因上也都存在明顯差異。這些變異會(huì)是否導(dǎo)致毒株致病性增強(qiáng)，還有待進(jìn)一步研究。

SVA病毒大量存在于鼻吻、蹄冠等部位的水皰中，且在血清、糞便中也可檢出該病毒，說(shuō)明SVA病毒是一種泛嗜性病毒，可造成多系統(tǒng)性疾病[11]。雖然SVA不是一種新的病毒，但是短時(shí)間內(nèi)可以引起大量的豬發(fā)生水皰性疾病是從未發(fā)生過(guò)的。 是否與SVA的致病性增強(qiáng)有關(guān)，應(yīng)該引起足夠重視。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該病的致病機(jī)理、病原學(xué)特點(diǎn)、鑒別診斷和預(yù)防控制方法的進(jìn)一步研究和探討。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

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