袁秀云 許申平 雷志華 王默霏 崔波

摘 要 為研究MADS-box基因在花器官發(fā)育中的功能，進(jìn)一步理解蘭科植物花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理。利用RT-PCR和RACE技術(shù)從蝴蝶蘭中克隆了一個MADS-box基因PhAG1a（GenBank登錄號為KY399811），并利用實(shí)時熒光定量方法分析其表達(dá)特性。序列分析表明，該基因的cDNA全長為1 107 bp，含完整的開放閱讀框，可編碼248個氨基酸，屬于C功能AGAMOUSE家族基因，與蝴蝶蘭屬的PhalAG1和PeMADS1基因關(guān)系最近；表達(dá)模式分析表明，PhAG1a基因在營養(yǎng)器官中不表達(dá)，只在蕊柱和子房中表達(dá)。在5類突變體花器官中，PhAG1a基因在退化雄蕊變異為側(cè)瓣、側(cè)瓣退化與蕊柱合生和側(cè)萼片變異為唇瓣等3類突變體花器官中，PhAG1a基因的表達(dá)沒有變化，在側(cè)瓣變異為唇瓣和側(cè)瓣頂端長出花藥的突變體花器官中，PhAG1a基因在蕊柱中的表達(dá)水平顯著降低。推測該基因在決定蝴蝶蘭合蕊柱的發(fā)育中起重要的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；AGAMOUSE家族；MADS-box；花器官突變體

中圖分類號 S681.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract To explore the function of the MADS-box gene in the floral organ development and further understand the molecular regulation mechanism of floral organ development in orchid， a Class-C MADS-box gene PhAG1a（GenBank accession number： KY399811）was cloned from Phalaenopsis using RT-PCR and RACE. The sequence analysis indicated the cDNA full-length of the gene was 1 107 bp encoding 248 amino acid residues. The gene belonged to the C function gene of the AGAMOUSE family， which was highly homologue with PhalAG1 and PeMADS1 from Phalaenopsis. The expression motif analysis showed that the PhAG1a was not expressed in the vegetative organs， only was expressed in the column and ovary. In the 5 types of floral organ mutants， the expression level of the PhAG1a gene was not changed in the 3 types of floral organ mutants including degraded stamens converting petals， lateral petals pillared mutant and lateral sepals converting lips. The expression of the gene decreased significantly in columns in the mutants of lateral petals converting lips and lateral petals with anthers. The results suggested that the PhAG1a gene should play a crucial role in regulating column development in Phalaenopsis.

Key words Phalaenopsis spp； AGAMOUSE family； MADS-box； floral organ mutants

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.016

在花器官的“ABC”發(fā)育模型中，C類基因參與第3輪和第4輪花器官的發(fā)育。典型的C類基因AGAMOUSE（AG）在擬南芥中與A類基因互為拮抗，參與調(diào)控雄蕊和心皮的發(fā)育[1]。在單子葉植物中，麝香百合的C類基因LLAG1在擬南芥中的異源表達(dá)可引起花瓣突變?yōu)樾廴颷2]。在禾本科植物中，C類基因在進(jìn)化過程中經(jīng)過了基因重復(fù)[3]，演變?yōu)?個分支，小麥的TaAG-1和TaAG-2、水稻的OsMADS58和OsMADS3、玉米的ZAG1和ZMM2/3屬于C類基因的不同分支，并具有極為不同的時空表達(dá)模式[4-6]。由此可見，在單子葉植物中，由于花被各輪器官不同程度的退化或特化使得花器官發(fā)育的分子調(diào)控更為復(fù)雜。研究C類基因在單子葉植物花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理，將進(jìn)一步豐富花器官發(fā)育理論，揭示自然界花器官多樣性的發(fā)育調(diào)控機(jī)理。

蘭科作為被子植物的第二大科，是單子葉植物中最早進(jìn)化的類群，其花器官的結(jié)構(gòu)既有第1輪和第2輪的區(qū)分，第2輪有唇瓣的特化，又有第3輪和第4輪的合生（雌蕊與雄蕊合生為蕊柱），因此，其花器官是研究單子葉植物花發(fā)育基因的好材料，此方面的研究也較多[7-8]。其中C類基因在蝴蝶蘭（Phalaenopsis sp）[9-10]、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）[11]、球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）[12]、建蘭（Cymbidium ensifolium）[13]、紅門蘭（Orchis italica）[14]和木石斛（Dendrobium crumenatum）[15]等蘭科植物中都有研究，然而不同蘭科植物的C類基因有其表達(dá)特征的普遍性，也有各自表達(dá)模式的特殊性。目前C類基因在蝴蝶蘭多種突變體花器官中的表達(dá)特性研究還未見報道。由于蝴蝶蘭形態(tài)多樣美觀，花期長，觀賞性強(qiáng)，是人們普遍喜歡的花卉，因此，對蝴蝶蘭突變體花器官發(fā)育的分子調(diào)控研究將有助于進(jìn)一步了解蘭科植物的進(jìn)化與演變，也為利用分子手段培育奇異蝴蝶蘭新品種奠定基礎(chǔ)。本研究以蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp）為材料，克隆了一個C類基因PhAG1a，研究其在蝴蝶蘭不同組織和5類突變體花器官中的表達(dá)，研究結(jié)果將為進(jìn)一步理解蝴蝶蘭C類基因的分子調(diào)控提供資料，為蝴蝶蘭的分子育種提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

蝴蝶蘭品種‘聚寶紅玫瑰、‘內(nèi)山姑娘、‘婚宴、‘S1024、‘火鳥和‘富樂夕陽均來自鄭州師范學(xué)院蘭花工程中心智能溫室?！畠?nèi)山姑娘、‘婚宴、‘S1024、‘火鳥和‘富樂夕陽的花器官突變株均為組培無性繁殖過程中獲得。取‘聚寶紅玫瑰盛花期的葉、根、花葶、花萼、花瓣、唇瓣、蕊柱、子房及授粉后10 d的子房組織；取突變體花器官的花萼、花瓣、唇瓣和蕊柱等組織。每個樣品取3個重復(fù)，取樣后迅速用液氮速凍，于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 組織材料總RNA用RNAprep Pure Plant Kit（天根）提取，具體方法參照說明書進(jìn)行。提取的RNA通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳判斷總RNA的質(zhì)量，并用核酸蛋白分析儀測量總RNA的濃度。

1.2.2 蝴蝶蘭PhAG1a基因全長的克隆及序列分析

以蝴蝶蘭品種‘聚寶紅玫瑰蕊柱的總RNA為模板，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Takara）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)NCBI登錄的C類MADS-box基因序列設(shè)計簡并引物AG-F： 5′-CACAACAAAYAG

RCAAGTCAC-3′和AG-R： 5′-CTGGAATCAAAYGG

AGGCATM-3′，用于擴(kuò)增C類基因的中間保守片段，PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含10×buffer 2 μL，每條引物0.5 μmol/L，cDNA模板1 000～2 000 ng，4種dNTPs各150 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95 ℃ 35 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 35 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。回收目的片段，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，進(jìn)行克隆和測序。根據(jù)得到的中間片段序列，設(shè)計1對3′端特異引物：GSP3-1：5′-GGTTGCCCTAATCATCTTCTCTAC-3′，GSP3-2：5′-TTCGCAGTATTACCAACAAGAG-3′，1對5′端特異引物：GPS5-1：5′-GTGGCCTCTTGTTGGTAAT

ACTGCGA-3′，GPS5-2：5′-TATTCATAGAGGCGG

CCACGGGTA-3′，利用SMARTTM RACE Amplification kit（Clontech）進(jìn)行擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株，鑒定后進(jìn)行測序。將5′和3′RACE得到的序列與中間片段進(jìn)行拼接，并根據(jù)拼接的序列設(shè)計1對引物：AG1-ORFF：5′-ATGTTTGCTTCTTCTCAGCCAGG-3′，AG1-ORRR：5′-CAACCTCCCCATCACCCAAGT-3′，進(jìn)行開放閱讀框（ORF）的擴(kuò)增和測序驗(yàn)證。引物合成和測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成?；蛐蛄械耐葱苑治鲈贜CBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）上進(jìn)行，蛋白結(jié)構(gòu)域在NCBI的蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database）中搜索；使用MEGA軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 蝴蝶蘭PhAG1a基因的表達(dá)分析 用于定量分析的組織總RNA用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)基因的全長設(shè)計1對特異引物：qAG1-F：5′-GCAGAAAAGGGAAATGGAACTC-3′，qAG1-R：5′-TGCTGGTGGGAATAACGGTC-3′，產(chǎn)物長度204 bp，以內(nèi)參基因Actin（JN185655）為參考，引物為：Act-F：5′-GCA GCA TGA AGA TCA AGG TGG-3′，Act-R：5′-GCC TTA GAA ATC CAC ATC TGT TG-3′。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ kit（TaKaRa）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min，接著 95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s（40個循環(huán)）。反應(yīng)在熒光定量PCR儀（Eppendorf， Mastercycler ep realplex）上進(jìn)行，3次重復(fù)。引物特異性分別通過溶解曲線分析并測序驗(yàn)證，相對表達(dá)量按照2-ΔΔct法計算，PhAG1a基因的表達(dá)差異通過SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝴蝶蘭PhAG1a基因的克隆

圖1-A顯示，保守片段長570 bp，經(jīng)Blastn分析，該片段為AGAMOUSE-like蛋白基因片段。利用GSP3-1和GSP3-2引物擴(kuò)增獲得3′端目的片段為640 bp（圖1-B），利用GSP5-1和GSP5-2引物擴(kuò)增獲得5′端目的片段為376 bp（圖1-C）。ORF擴(kuò)增驗(yàn)證得到了預(yù)期的758 bp的片段（圖1-D），最終拼接獲得1 107 bp的cDNA基因全長，分析表明該片段包含149 bp的5′-UTR、747 bp開放閱讀框和211 bp的3′-UTR，編碼248個氨基酸（圖2）。將其命名為PhAG1a，提交GenBank，登錄號為KY399811。

2.2 蝴蝶蘭PhAG1a基因的生物信息學(xué)分析

PhAG1a基因編碼的蛋白具有M、I、K和C結(jié)構(gòu)域，是典型的MIKC型MADS轉(zhuǎn)錄因子（圖2）。將PhAG1a編碼的蛋白在NCBI的蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫中搜索發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白具有MADS和K-box 2個典型結(jié)構(gòu)域，同時在C-端還有2個AG特征基序（圖2）。另外在MADS區(qū)有18個DNA結(jié)合位點(diǎn)，1個磷酸化位點(diǎn)和19個二聚化結(jié)合界面位點(diǎn)（圖3）。通過Blastp工具分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白與其它植物的AGAMOUSE蛋白或MADS轉(zhuǎn)錄因子序列具有88%以上的覆蓋率和64%以上的一致性，其中與小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）的PeMADS1（AAL76415）和蝴蝶蘭雜交種（Phalaenopsis hybrids）的PhalAG1（BAE80120）具有96%的覆蓋率和100%的一致性，PhAG1a編碼蛋白的N-端比PeMADS1和PhalAG1多了9個氨基酸，與球花石斛的DthyrAG1（DQ017702）、建蘭的CeMADS1（ADP00515）和蕙蘭（Cymbidium faber）的CfAG1（AFP19447）具有93%的一致性，與文心蘭的OMADS4（AIJ29176）具有91%的一致性，與紅門蘭的OitaAG（AFU81324）具有85%的一致性。

為了更好地了解蝴蝶蘭PhAG1a蛋白與其它MADS-box基因之間的進(jìn)化關(guān)系，選取與PhAG1a蛋白一致性高的AGAMOUSE-like蛋白和有代表性MADS-box蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。從圖4可以看出，所分析的MADS-box蛋白包括花器官發(fā)育的A、B、C、D和E 5類功能蛋白，其中PhAG1a蛋白屬于C類，與同為C類的MADS蛋白聚為一支，包括蝴蝶蘭品種的PhalAG1、小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS1、文心蘭的OMADS4、建蘭的CeMADS1、球花石斛的DthyrAG1、紅門蘭的OitaAG、木石斛的DcOAG1 （DQ119840）、建蘭的CeMADS2（ADP00516）和麝香百合（Lilium longiflorum）的LMADS10（AIJ29174），這些蛋白均報道屬于花器官發(fā)育的C類功能基因。其中與蝴蝶蘭的PhalAG1關(guān)系最近，其次是小蘭嶼蝴蝶蘭的PeMADS1，在這一分支中與麝香百合的LMADS10關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 蝴蝶蘭PhAG1a基因的表達(dá)分析

為了研究PhAG1a基因在蝴蝶蘭不同組織中的功能，分析了其在根、葉、花葶、花器官及5類變異花器官中的表達(dá)特性。結(jié)果表明，PhAG1a基因在根、葉和花葶中不表達(dá)，在花器官的萼片、花瓣和唇瓣中也不表達(dá)，只在花器官的蕊柱和子房中表達(dá)，其中在蕊柱中表達(dá)最高，而在授粉前和授粉后子房中的表達(dá)較低（圖5）。

5類突變體花器官有：‘內(nèi)山姑娘的突變?yōu)槠渫嘶廴镛D(zhuǎn)變?yōu)榛ò隊(duì)罱Y(jié)構(gòu)（圖6-A），‘婚宴第一種突變?yōu)槠鋫?cè)瓣退化，一部分與蕊柱合生（‘婚宴1，圖6-B），‘S1024的突變?yōu)槠湎路?個側(cè)萼片變異為唇瓣（圖6-C），‘火鳥的突變?yōu)槠鋫?cè)瓣變異為唇瓣（圖6-D），‘婚宴的另一種突變體與‘火鳥相同，也是側(cè)瓣變異為唇瓣（‘婚宴2，圖6-E），‘富樂夕陽的突變?yōu)槠鋫?cè)瓣頂端長出花藥（圖6-F）。PhAG1a基因在5類突變體花器官中的表達(dá)分析表明，PhAG1a基因在‘內(nèi)山姑娘、‘婚宴1和‘S1024等突變體花器官的萼片、花瓣、側(cè)瓣和唇瓣中的表達(dá)水平?jīng)]有變化（圖6-A、B、C）；在‘火鳥和‘婚宴2側(cè)瓣變異為唇瓣的突變體花器官中，PhAG1a基因在蕊柱中的表達(dá)水平明顯降低，而在萼片、花瓣和唇瓣中的表達(dá)水平?jīng)]有變化（圖6-D、E）；在‘富樂夕陽突變體花器官中，PhAG1a基因在萼片、花瓣和唇瓣的表達(dá)水平無明顯變化，而在蕊柱中的表達(dá)水平降得更低（圖6-F）。這些結(jié)果表明，側(cè)萼變異為唇瓣、雄蕊變異為花瓣和側(cè)瓣退化與蕊柱合生等突變體的形態(tài)建成與PhAG1a基因的表達(dá)水平無密切關(guān)系，這些形態(tài)的改變可能與其它基因的功能改變有關(guān)；而在側(cè)瓣變異為唇瓣和側(cè)瓣頂端長出花藥的突變體中，PhAG1a基因在蕊柱中表達(dá)水平下降，推測PhAG1a基因的表達(dá)可能引起了其它基因在側(cè)瓣的表達(dá)，進(jìn)而影響了側(cè)瓣形態(tài)的改變，PhAG1a基因間接影響了花器官第2輪的形態(tài)發(fā)育。

3 討論

諸多研究表明，花器官發(fā)育理論從典型的“ABC”模型到“ABCDE”模型在被子植物中既具有保守性，又具有多樣性[16]?；蛑貜?fù)成就了花器官發(fā)育基因多樣的功能[17-18]。就AG家族基因而言，擬南芥有AG和SHP1/2[19]，二者在控制心皮和胚珠特征的功能上是冗余的[20]，同時SHP1/2又發(fā)生了新功能化， 具有促進(jìn)果實(shí)開裂的功能[21]。蘭科植物不同的C類基因在花器官發(fā)育調(diào)控中具有不同的表達(dá)模式和功能[13]。例如蝴蝶蘭PeMADS1[9]和PhalAG1[10]、心蘭的OMADS4[11]、建蘭的CeMADS1[13]等的C類基因在蕊柱和子房中表達(dá)，而木石斛的DcOAG1為C類基因，在萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱、花藥和藥帽中均有表達(dá)[14]。本研究中蝴蝶蘭的PhAG1a從編碼蛋白序列比對結(jié)果上看，除了在N-端多了9個氨基酸殘基外，與PeMADS1和PhalAG1編碼蛋白完全一致，而且PhAG1a與PeMADS1和PhalAG1具有相似的表達(dá)特征，即只在花器官的蕊柱和子房中表達(dá)，在營養(yǎng)器官中不表達(dá)。

在本研究中，蝴蝶蘭的PhAG1a在萼片變異為唇瓣的花器官中，其表達(dá)沒有明顯變化，說明這些花器官形態(tài)的變異與PhAG1a的表達(dá)無關(guān)。筆者前期的研究顯示，一個B類基因PhPI在萼片變異為唇瓣突變體的萼片中表達(dá)水平升高[22]，說明該類突變體的形態(tài)可能與特異B類基因在萼片中表達(dá)水平升高有關(guān)。在退化雄蕊變異為花瓣和側(cè)瓣退化與蕊柱合生的突變體花器官中，PhAG1a的表達(dá)在各輪花器官中也沒有明顯變化，說明PhAG1a的表達(dá)不參與這2類突變體花器官形態(tài)發(fā)育的調(diào)控。據(jù)報道，花菱草的2個C類基因EScaAG1和EScaAG2具有非常相近的序列和表達(dá)特征，其基因沉默研究顯示，EScaAG1和EScaAG2基因的沉默能夠?qū)е滦廴锵蚧ò旰托钠は蚧ò甑耐崔D(zhuǎn)化，同時這2個基因表達(dá)的降低顯著提高了B類基因的表達(dá)[23]。文心蘭的OMADS1，是一個擬南芥AGL6同源基因，在擬南芥中過表達(dá)會引起花器官的萼片轉(zhuǎn)換為心皮和花瓣轉(zhuǎn)化為雄蕊的結(jié)構(gòu)[24]，表明AGL6同源基因也參與花器官形態(tài)的建成。另有研究表明，蝴蝶蘭的PhAGL6a、PhAGL6b基因也參與花器官發(fā)育的調(diào)控[25]，由此推測這2類突變體花器官的形態(tài)發(fā)生可能與未知的C類基因或者其它基因有關(guān)。

在側(cè)瓣變?yōu)榇桨甑耐蛔凅w中，PhAG1a在蕊柱中的表達(dá)顯著減低，在其余花器官組織中沒有檢測到表達(dá)。已有研究表明，在文心蘭和蝴蝶蘭突變體花器官中，其側(cè)瓣變異為唇瓣的形態(tài)與B類基因的表達(dá)有關(guān)[26-28]。本研究結(jié)果表明，C類基因在蕊柱中的降低也可能參與側(cè)瓣變?yōu)榇桨晖蛔凅w花器官的發(fā)育。對蝴蝶蘭PeMADS1（C類基因）的研究表明，在側(cè)瓣頂端長出花藥的突變體中，發(fā)現(xiàn)該基因在側(cè)瓣中有表達(dá)，研究認(rèn)為蝴蝶蘭的C類（PeMADS1）和D類（PeMADS7）基因在E類基因的作用下構(gòu)成同源或異源二聚體，調(diào)控了側(cè)瓣雄化變異的發(fā)育[10]，而在本研究中的此類突變體花器官中，PhAG1a在側(cè)瓣中沒有檢測到表達(dá)，同時在蕊柱中的表達(dá)降得更低，推測C類基因在蕊柱中的表達(dá)降低到一定程度導(dǎo)致了調(diào)控花藥發(fā)育的基因在外輪的表達(dá)。這一表達(dá)特征與PeMADS1在突變體中的表達(dá)明顯不同。聯(lián)想到序列比對結(jié)果，PhAG1a在該類突變體花器官中的表達(dá)特征可能與N-端的序列有關(guān)，這些猜測還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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