陳志堅(jiān) 彭璽如 羅佳佳 劉攀道 李欣勇 丁西朋 郇恒福 劉國(guó)道

摘 要 分析了低溫（6 ℃）處理對(duì)6份柱花草種質(zhì)地上部鮮重、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、葉綠素濃度和最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的影響，并比較不同柱花草種質(zhì)抗冷性的差異。結(jié)果表明：低溫處理降低了柱花草的地上部鮮重、葉綠素濃度和Fv/Fm值，增加了柱花草葉片相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量，但是，低溫處理對(duì)不同種質(zhì)的影響有所差異。在6份柱花草種質(zhì)中，種質(zhì)TF41抗冷能力最強(qiáng)，其他5份種質(zhì)（TF29、TF57、TF220、TF303和TF2001）抗冷能力較弱。研究結(jié)果為柱花草抗冷機(jī)理研究及抗冷柱花草品種改良提供了理論依據(jù)和種質(zhì)材料。

關(guān)鍵詞 柱花草；低溫脅迫；抗冷性評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào) S541 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Shoot fresh weight， relative electric leakage， malondialdehyde（MDA）content， chlorophyll concentration and maximum photochemical efficiency（Fv/Fm）of six Stylosanthes（stylo）accessions were investigated under chilling stress（6 ℃）. Results showed that the six tested stylo accessions exhibited different responses to chilling stress. The shoots fresh weight， chlorophyll concentration and Fv/Fm of stylo accessions differentially decreased by chilling treatment， while relative electric leakage and MDA content in the leaves of stylo increased under chilling stress. Comprehensive evaluation analysis with subordinate function showed that among the six tested stylo accessions， TF41 exhibited the superior ability of chilling resistance. Taken together， our results not only provide a theoretical basis for dissecting the mechanisms underlying stylo resistant to chilling， but also provide germplasm resources for improving stylo varieties to chilling stress.

Key words Stylosanthes； chilling stress； chilling resistance evaluation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.010

自然界中，低溫脅迫是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要因素之一。低溫容易造成植物機(jī)體損傷，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，甚至植株死亡[1-2]。低溫影響植物對(duì)礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，影響呼吸作用和新陳代謝等生理過程[3]。研究表明，低溫處理降低植物葉綠素含量、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和光合速率[4]。低溫脅迫會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等活性氧物質(zhì)（ROS，reactive oxygen species），ROS的積累會(huì)造成膜脂過氧化，增加丙二醛（MDA）含量，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[5-6]。在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，植物形成了一系列適應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制，如通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)抵抗氧化傷害，增強(qiáng)感受低溫信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)提高耐低溫能力[7-9]。此外，在低溫脅迫下，植物體內(nèi)積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性蛋白、游離脯氨酸以及可溶性糖含量等，在植物耐低溫中發(fā)揮著重要作用[10]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是重要的熱帶豆科牧草，可用于牧草飼料、果園覆蓋、綠肥作物以及天然草地改良等。柱花草具有耐貧瘠和酸性土壤、草品質(zhì)好等特點(diǎn)，已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛種植及應(yīng)用的豆科牧草。20世紀(jì)60年代至今，柱花草已在我國(guó)南方各省（區(qū)）推廣種植，累積種植面積已超過20萬(wàn)hm2[11]。然而，柱花草對(duì)低溫脅迫較為敏感，10 ℃以下的低溫就會(huì)導(dǎo)致柱花草葉片失綠變黃，甚至引起植株死亡，嚴(yán)重影響了推廣和應(yīng)用，因此，低溫脅迫問題已成為柱花草實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中的重要難題[12-14]。

目前，對(duì)柱花草響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)理已有相關(guān)的研究報(bào)道。低溫脅迫顯著抑制柱花草的生長(zhǎng)，但通過添加外源脫落酸（ABA），能夠提高柱花草抗氧化能力、維持較高的最大光化學(xué)效率和保護(hù)光系統(tǒng)II，從而增強(qiáng)柱花草耐低溫能力[15]。并且，研究發(fā)現(xiàn)，信號(hào)分子NO和Ca2+也參與了ABA提高柱花草抗冷能力的過程中[16-17]。此外，外源水楊酸（SA）和NO供體硝普鈉（SNP）處理，也能夠提高柱花草抗氧化酶活性，降低葉片相對(duì)電導(dǎo)率及MDA含量，從而減輕低溫脅迫對(duì)柱花草幼苗的傷害[18]。但篩選與培育抗冷柱花草品種是應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境的根本途徑，對(duì)南方大力發(fā)展草牧業(yè)具有重要的實(shí)際意義。然而，迄今為止，對(duì)不同柱花草種質(zhì)抗冷性評(píng)價(jià)分析較少，并且，采用的實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)體系不同，結(jié)論不盡相同[19-20]。因此，本研究以6份柱花草種質(zhì)為材料，分析低溫（6 ℃）處理對(duì)柱花草生長(zhǎng)、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量、葉綠素濃度和Fv/Fm的影響，并運(yùn)用隸屬函數(shù)法綜合比較不同柱花草種質(zhì)抗冷性的差異，以期為探索柱花草抗冷機(jī)理及抗冷柱花草品種改良提供理論依據(jù)及種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)共用到6份柱花草種質(zhì)，編號(hào)分別為TF29（Stylosanthes guianensis）、TF41（Stylosanthes grandifolia）、TF57（Stylosanthes hamata）、TF220（Stylosanthes guianensis）、TF303（Stylosanthes guianensis）和TF2001（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子來自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 柱花草種子處理萌發(fā)后，播種于盆栽營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中（為滅菌土、腐殖土和蛭石按2 ∶ 1 ∶ 1比例的混合物），并于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室溫室培養(yǎng)。柱花草幼苗正常培養(yǎng)40 d后，移至人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理溫度，分別為28 ℃（對(duì)照）和6 ℃（低溫）。低溫處理7 d后，柱花草幼苗轉(zhuǎn)移到28 ℃下恢復(fù)生長(zhǎng)3 d。分別于低溫處理7 d和恢復(fù)生長(zhǎng)3 d收獲柱花草地上部樣品，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目 收獲地上部樣品并稱取鮮重。質(zhì)膜透性用電導(dǎo)法測(cè)定。丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[6]。葉綠素含量測(cè)定采用分光光度法[21]。葉片最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）采用Pocket PEA熒光儀（Hansatech，英國(guó)）測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2003作圖，通過SPSS20.0（SPSS Institute，美國(guó)）軟件進(jìn)行單因素方差分析。測(cè)定指標(biāo)增加率或降低率=（冷處理下測(cè)定值-CK測(cè)定值）/CK測(cè)定值×100%。當(dāng)冷處理下各性狀測(cè)定值>CK各性狀測(cè)定值，則為增加率；當(dāng)冷處理下各性狀測(cè)定值2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對(duì)柱花草生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，6 ℃低溫處理7 d顯著抑制柱花草的生長(zhǎng)，但不同種質(zhì)受低溫處理影響的程度不一樣，其中，種質(zhì)TF41在低溫處理下的表型性狀與對(duì)照條件下相似，表明其受低溫影響較低。低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質(zhì)的地上部鮮重，相對(duì)對(duì)照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的地上部鮮重分別降低了31.9%、45.4%、38.7%、46.4%、25.8%和16.6%（圖2-A）。并且，柱花草經(jīng)低溫處理后，恢復(fù)生長(zhǎng)3 d，TF41的地上部鮮重相對(duì)對(duì)照處理下，降低了18.7%，而其他種質(zhì)地上部鮮重降低了22.2%～63.6%（圖2-B）。以上結(jié)果表明，在6份柱花草種質(zhì)中，TF41具有較強(qiáng)的耐低溫能力。

2.2 低溫處理對(duì)柱花草葉片質(zhì)膜透性的影響

低溫處理顯著增加了柱花草葉片相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛含量（圖3）。相對(duì)對(duì)照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的葉片相對(duì)電導(dǎo)率分別增加了70.2%、84.4%、84.7%、83.6%、53.7%和39.3%，丙二醛含量分別增加了62.9%、68.7%、60.8%、67.1%、55.9%和44.6%，（圖3-A、B）?；謴?fù)生長(zhǎng)3 d后，相對(duì)對(duì)照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的葉片相對(duì)電導(dǎo)率增加了44.1%～82.4%，而TF41僅增加了18.9%，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的丙二醛含量增加了48.3%～66.4%，而TF41僅增加了29.9%（圖3）。以上結(jié)果說明TF41葉片質(zhì)膜透性受低溫處理影響低于其他種質(zhì)。

2.3 低溫處理對(duì)柱花草葉綠素濃度及最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的影響

從圖4-A可以看出，低溫處理對(duì)柱花草葉綠素濃度影響不大，只顯著降低了TF2001和TF220葉片葉綠素濃度（分別降低了17.2%和18.5%），但是，恢復(fù)生長(zhǎng)3 d后，相對(duì)對(duì)照處理，TF57、TF303、TF2001、TF29和TF220的葉綠素濃度降低了49.1%～82.9%，而TF41僅降低了21.8%（圖4-A）。低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質(zhì)的Fv/Fm值，TF57、TF303、TF2001、TF29、TF220和TF41在低溫處理下的Fv/Fm分別比對(duì)照處理降低了36.9%，40.4%，50.0%，38.3%，42.1%和17.2%，而恢復(fù)生長(zhǎng)3 d后，F(xiàn)v/Fm分別比對(duì)照處理降低了62.7%，72.3%，66.9%，56.7%，45.3%和26.5%（圖4-B）。以上結(jié)果表明，在低溫處理下，相對(duì)其他種質(zhì)，TF41能夠維持較高的葉綠素濃度及最大光化學(xué)效率。

2.4 柱花草種質(zhì)抗冷性綜合評(píng)價(jià)

本研究進(jìn)一步對(duì)低溫處理下，地上部鮮重、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm等5個(gè)指標(biāo)的變化進(jìn)行分析，計(jì)算隸屬函數(shù)值，綜合評(píng)價(jià)柱花草的抗冷能力。結(jié)果表明，種質(zhì)TF41綜合評(píng)價(jià)D值最大，為1.000，TF220和TF57次之（分別為0.589 7和0.415 5），TF303、TF29和TF2001最小，為0.141 9～0.230 4（表1）。因此，TF41抗冷能力最強(qiáng)，為抗冷型柱花草，TF220、TF57、TF303、TF29和TF2001為冷敏感型柱花草。并且，從表1可以看出，地上部鮮重、電導(dǎo)率、丙二醛和Fv/Fm與隸屬函數(shù)值顯著負(fù)相關(guān)，表明以上4個(gè)指標(biāo)可作為柱花草抗冷能力評(píng)價(jià)和鑒定的參考指標(biāo)。

2.5 柱花草種質(zhì)抗冷性聚類分析

對(duì)地上部鮮重、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量、葉綠素含量及Fv/Fm等5個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用歐氏距離，利用離差平方和法，對(duì)6份種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明柱花草種質(zhì)在歐氏距離為3.63處可以分為2個(gè)類群（圖5）。第1類群只有種質(zhì)TF41，各項(xiàng)指標(biāo)受低溫處理影響較小，認(rèn)為是抗冷型柱花草；第2類群包括種質(zhì)TF220、TF57、TF2001、TF303和TF29，各項(xiàng)指標(biāo)顯著受到低溫處理的影響，屬于冷敏感型柱花草（圖5）。

3 討論

低溫脅迫是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的非生物脅迫之一。低溫條件下柱花草生長(zhǎng)明顯受到抑制，嚴(yán)重的低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致柱花草植株死亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，6份柱花草種質(zhì)在受到低溫脅迫時(shí)，會(huì)導(dǎo)致地上部鮮重降低，這與Lu等[6]和Bao等[14]在柱花草中的研究結(jié)果相似，低溫處理顯著抑制柱花草的生長(zhǎng)。在低溫條件下，種質(zhì)TF41能夠維持較高的生物量，表明其具有較強(qiáng)的耐低溫能力。在低溫脅迫下，維持較低的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量，說明細(xì)胞膜受到膜脂過氧化程度較低，抗寒性強(qiáng)[5-6]。在本研究中，6份柱花草種質(zhì)受到低溫脅迫后，相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量顯著增加，冷害造成膜脂過氧化。這與柱花草、黃瓜、核桃和越橘的研究結(jié)果相似，寒害造成膜脂過氧化，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量增加[6，23-24]。并且，在低溫處理和恢復(fù)生長(zhǎng)條件下，種質(zhì)TF41的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量增加率最小，表明TF41葉片質(zhì)膜受低溫處理的影響低于其他種質(zhì)。

低溫脅迫直接影響葉綠體中酶的活性，從而影響葉綠素的合成，并且，葉綠素?zé)晒鈪?shù)中最大光化學(xué)效率可有效的反映PSⅡ受到低溫傷害的程度[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理顯著抑制了6份柱花草種質(zhì)的Fv/Fm值，但相對(duì)其他種質(zhì)，TF41能夠維持較高的葉綠素濃度及Fv/Fm，表明TF41抗冷能力高于其他種質(zhì)。類似的，低溫處理顯著降低了柱花草“熱研4號(hào)”葉綠素濃度、Fv/Fm和光合速率，進(jìn)而抑制了光合作用[4]。在對(duì)玉米耐寒性分析中也有類似報(bào)道[25]，可見低溫脅迫對(duì)葉綠素含量和Fv/Fm有重要影響。

植物抗寒是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，受到多種因素的影響，單一指標(biāo)作為抗寒指標(biāo)的直接評(píng)價(jià)難以全面反映植物的真實(shí)抗寒情況，需要以多個(gè)指標(biāo)為依據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)植物的抗寒性[19，22]。因此，本研究運(yùn)用隸屬函數(shù)法，綜合比較不同柱花草種質(zhì)抗冷性的差異。結(jié)果表明，TF41抗冷能力最強(qiáng)，為抗冷型柱花草，其余5份種質(zhì)為冷敏感型柱花草。并且，聚類分析結(jié)果表明6份柱花草種質(zhì)的抗冷性可以分為2個(gè)類群，第1類群只有種質(zhì)TF41，第2類群包括其余5份種質(zhì)，與抗冷性綜合評(píng)價(jià)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明種質(zhì)TF41具有較強(qiáng)的抗冷能力。

綜上所述，在6份柱花草種質(zhì)中，種質(zhì)TF41抗冷能力最強(qiáng)，為抗冷型柱花草。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)地上部生物量、電導(dǎo)率、丙二醛含量和Fv/Fm等4個(gè)指標(biāo)可作為柱花草抗冷能力評(píng)價(jià)和鑒定的參考指標(biāo)。本研究為柱花草種質(zhì)的創(chuàng)新利用及抗冷柱花草品種改良提供了理論依據(jù)及新的種質(zhì)材料，并且，種質(zhì)TF41可作為柱花草抗冷機(jī)理研究的重要材料，其抗冷機(jī)理值得做進(jìn)一步的分析。

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