（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

五種核酸提取試劑盒對新城疫病毒RNA提取效率的比較

呂 艷，王靜靜，羅瑤瑤，李 林，趙云玲，鄭東霞，左媛媛，于松梅，劉華雷，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

本研究采用羅氏、天隆、賽默飛世爾等公司生產(chǎn)的5種核酸提取試劑盒，對新城疫病毒RNA的提取效率進(jìn)行比較，以優(yōu)選出提取效率高、耗時短、成本低的核酸提取方法，為各級實驗室開展新城疫病毒核酸檢測提供技術(shù)參考。采用5種商品化核酸提取試劑盒，對不同濃度（稀釋度100～10-8/EID50108.3）的新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行RNA提取，通過實時定量熒光RT-PCR進(jìn)行檢測，以Ct值評價5種試劑盒的RNA提取效率，并對試劑盒的RNA提取時間和價格等進(jìn)行綜合比較分析。結(jié)果顯示：High Pure Viral RNA Kit（羅氏）、動物疫病病毒RNA核酸提取試劑盒（天?。┖蚅abServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）的RNA提取效率較高。其中，LabServ Viral Total NA Kit對低濃度樣本的RNA提取效率最高，價格最便宜；Tian Long的RNA提取所需時間也較短，但操作最為簡便。綜合提取效率、時間及成本等因素，分析認(rèn)為LabServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）性價比最高，適用于大批量臨床樣品的集中檢測。

新城疫病毒；RNA提取；熒光RT-PCR

新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）強毒引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病[1]，在全球許多國家和地區(qū)均有發(fā)生或流行。該病是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）法定報告動物疫病，是我國一類動物疫病，也是《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》中確定的優(yōu)先防控的重大動物疫病之一。按照《國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計劃》的有關(guān)要求，各級動物疫病防控機構(gòu)需要開展ND的病原學(xué)監(jiān)測和免疫效果評估。對于病原學(xué)監(jiān)測，目前常用的方法包括病毒分離與鑒定，以及普通RT-PCR和熒光RT-PCR等核酸檢測。對于病毒核酸檢測，除了檢測試劑盒的特異性、敏感性和重復(fù)性等因素對檢測結(jié)果影響較大外，病毒RNA的提取效率對其影響也非常大。早期，病毒RNA的提取主要采用硫氰酸胍法、CTAB法、Trizol法、反復(fù)凍融法和溶壁酶法等[2-3]。這些傳統(tǒng)提取方法操作繁瑣，提取效率低，易污染，且很難實現(xiàn)自動化。隨著高分子材料的快速發(fā)展，RNA提取技術(shù)已由傳統(tǒng)的液相系統(tǒng)分離技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔噍d體吸附技術(shù)，如膜吸附技術(shù)、磁珠吸附技術(shù)等。近幾年，市場上也出現(xiàn)了多種基于固相載體的RNA提取試劑盒。本研究對常用的5種病毒RNA提取試劑盒的提取效率、時間及成本等進(jìn)行綜合比較，為實驗人員合理選擇RNA提取方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株

3株NDV強毒尿囊液（EID50108.3）由本實驗室保存，分別編號為毒株1、2、3 ；用PBS（0.01 M，pH 7.4）對3株病毒分別作10倍梯度稀釋，制備10-1～10-8稀釋度樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

High Pure Viral RNA Kit（批號11696800）、MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（批號12066700）、MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit（批號18922500），由羅氏診斷有限公司提供；動物疫病病毒RNA核酸提取試劑盒（批號E0115040411），購自西安天隆科技有限公司；LabServ Viral Total NA Kit（批號00LSKFR805496C19O005），購自賽默飛世爾科技公司；新城疫病毒強毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，由國家新城疫參考實驗室提供。

1.3 主要儀器設(shè)備

NP968 Nucl eic Acid Extraction System（西安天隆科技有限公司）；Thermo KingFisher Flex 磁珠法核酸提取儀（賽默飛世爾科技公司）；MagNA Pure LC 2.0全自動核酸純化系統(tǒng)（羅氏診斷有限公司）；MagNA Pure 96 全自動核酸純化系統(tǒng)（羅氏診斷有限公司）；LightCycler? 480Ⅱ熒光定量PCR儀（羅氏診斷有限公司）。

1.4 RNA提取

對High Pure Viral RNA Kit，采用離心柱吸附技術(shù)，按照試劑盒說明書，手動提取病毒RNA；對其余4種試劑盒，均采用磁珠法，按照試劑盒說明書，運用相應(yīng)核酸提取儀，自動提取病毒RNA。5種試劑盒所用樣品均為200 μL，核酸洗脫液體積為100 μL，每份樣品（稀釋度10-1～10-8）平行做2次RNA提取。所用5種RNA提取方法見表1。

1.5 熒光RT-PCR

采用國家新城疫參考實驗室提供的新城疫強毒熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒，對不同方法制備的病毒RNA進(jìn)行檢測。熒光RT-PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃1 min，進(jìn)行45個循環(huán)，60 ℃收集熒光信號。每個樣品做2個重復(fù)，通過Ct值比較不同試劑盒的RNA提取效率。

表1 5種RNA提取方法的比較

2 結(jié)果

2.1 RNA提取效率比較

利用5種試劑盒，分別提取3份NDV原液，通過熒光RT-PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，不同提取方法和不同樣品在提取效率上有一定差異，High Pure Viral RNA Kit試劑盒的離心柱法和磁珠法試劑盒的效果相當(dāng)，Roche LC 2.0試劑盒的Ct值較高（圖1）。

圖1使用5種提取方法對3株NDV提取效果比較（誤差線為平均值的標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 重復(fù)性分析

利用5種試劑盒，2次平行提取病毒原液RNA，并以其為模板進(jìn)行熒光RT-PCR擴增；重復(fù)2次，根據(jù)熒光RT-PCR的Ct值計算變異系數(shù)（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值），評價方法的重復(fù)性。High Pure Viral RNA Kit、Tian Long、Thermo KingFlex、Roche LC 2.0、Roche Pure 96試劑盒的變異系數(shù)分別為0.022 829、0.016 261、0.016 555、0.031 033、0.046 504，說明Tian Long試劑盒重復(fù)性最好，Thermo KingFlex試劑盒次之。

隨機選取1株NDV進(jìn)行10倍梯度稀釋，以10-1～10-8稀釋度樣本為模板，進(jìn)行熒光RT-PCR擴增，根據(jù)Ct值評價各試劑盒對不同濃度樣品的RNA提取效率。結(jié)果顯示，在樣品被梯度稀釋后，High Pure Viral RNA Kit、Tian Long和Thermo KingFlex試劑盒的提取效率較好，其中Thermo KingFlex試劑盒對低濃度尿囊液的提取率最高（圖2）。

圖2 5種RNA提取試劑盒對不同濃度樣品的RNA提取效率比較

2.3 提取時間及價格比較

High Pure Viral RNA Kit為手動提取，耗時最長。按照1人標(biāo)配24孔離心機來算，提取96份樣品需4 h左右，其余4種試劑盒均有配套核酸提取儀，可通過儀器自動化或半自動化提取。其中Tian Long試劑盒上機前手動加樣最為簡便，Roche Pure 96試劑盒提取RNA耗時最短。5種試劑盒中，Roche Pure 96試劑盒價格較貴，檢測1份樣品約36元；Thermo KingFlex試劑盒對較便宜，約25元/份樣品（表2）。由于各實驗室試劑采購?fù)緩讲煌?，參考價格會有所差異，表中所列價格僅供參考。

3 討論

目前，NDV的病原學(xué)診斷主要依靠分子生物學(xué)技術(shù)，即常規(guī)RT-PCR、熒光RT-PCR和焦磷酸測序技術(shù)等。在所有的分子診斷方法中，病毒RNA提取是分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，RNA的提取效率和質(zhì)量直接影響最終檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，選擇一種高效的RNA提取方法，對NDV的核酸檢測至關(guān)重要。早期的RNA提取方法主要依靠液相系統(tǒng)分離技術(shù)，包括硫氰酸胍法、CTAB法、Trizol法、反復(fù)凍融法和溶壁酶法等[2-3]。這些傳統(tǒng)方法操作繁瑣、費時，提取率低，易污染，且操作人員可能需要直接接觸有毒的化學(xué)試劑。隨著高分子材料學(xué)的快速發(fā)展，提取核酸的關(guān)鍵技術(shù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔噍d體吸附技術(shù)，包括旋轉(zhuǎn)離心柱提取法、玻璃粉吸附法、二氧化硅基質(zhì)法、陰離子交換法和納米磁珠提取法等[4]。其中離心柱法已被普遍應(yīng)用。該方法提取率較高且質(zhì)量穩(wěn)定，但至今未實現(xiàn)高通量自動化操作。納米磁珠法是一種新興的核酸提取方法，目前已被眾多實驗室采用。該方法提取效率高，且可通過儀器自動化批量提取，操作簡單。目前，市售的RNA提取試劑盒主要采用膜吸附技術(shù)（離心柱提取法）和磁珠吸附技術(shù)（納米磁珠法）。這些試劑盒在提取效率、時間、成本等方面存在較大差異[5]。本研究利用熒光RT-PCR技術(shù)檢測NDV RNA，通過Ct值評價病毒RNA提取效率，并對常見的5種RNA提取試劑盒進(jìn)行綜合比較，以期能找到一種提取效率高、耗時短、成本低的病毒RNA提取方法。

研究發(fā)現(xiàn)，在提取效率方面，High Pure Viral RNA Kit（羅氏）、動物疫病病毒RNA核酸提取試劑盒（天?。┖蚅abServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）明顯優(yōu)于另外2種試劑盒。對于低濃度的病毒樣本（稀釋度為10-8/EID50為108.3），5種試劑盒均具有很好的RNA提取效率均效高，其中LabServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）的RNA提取效率最高。在重復(fù)性方面，5種試劑盒無明顯差異。綜合耗時、成本等其他因素比較發(fā)現(xiàn)，High Pure Viral RNA Kit（羅氏，離心柱吸附法）為手工操作，耗時費力，不適合大批量樣本集中檢測，但其收集的RNA為單管單獨分裝，無需再次轉(zhuǎn)移，可防止RNA交叉污染，因此在樣品數(shù)量較少時較為實用。其余4種試劑盒均依靠磁珠吸附技術(shù)，具有配套的核酸提取儀器，可實現(xiàn)全自動化或半自動化操作。動物疫病病毒RNA核酸提取試劑盒（天?。┦俏ㄒ坏膰a(chǎn)試劑盒，為預(yù)裝試劑盒，只需手動加入待檢樣品和少量試劑，操作簡便，且有多種規(guī)格可供選擇。但該儀器1次最多提取32個樣品，成本相對較高。LabServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）雖可同時提取96個樣品，但所有試劑和樣品均需手動加入，操作相對繁瑣。目前該試劑盒已有預(yù)裝試劑盒出售，且成本較低，是大批量樣品檢測的首選試劑盒。MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit（羅氏）和配套儀器每次最多可提取32個樣品RNA，試劑和樣品均需手動加入，操作復(fù)雜，且RNA提取效率最低。羅氏公司出售的MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit為預(yù)裝試劑盒，操作簡單，可同時提取96個樣品，RNA提取效率明顯高于MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit，但與另外3種方法相比，仍有一定差距，且耗材成本較高。因此，綜合考慮RNA提取試劑盒的提取效率、時間和成本等因素，認(rèn)為LabServ Viral Total NA Kit（賽默飛世爾）的性價比最高，是大批量樣品檢測的最佳選擇。

[1] 王志亮，劉華雷. 新城疫[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：1-3.

[2] CHIRGWIN J M，PRZYBYLA A E，MACDONALD R J，et al. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease[J]. Biochemistry，1979，18（24）：5294-5299.

[3] 王淼，馬學(xué)軍. 核酸提取方法的研究進(jìn)展[J]. 中華實驗和臨床病毒學(xué)，2014，28（6）：503-505.

[4] 劉洪波，劉曉雷，羅小銘. 核酸提取方法進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，16：3187-3190.

[5] 趙怡，陳蘇紅，劉志紅，等. 6種核酸提取試劑盒對甲型H1N1流感病毒核酸提取效果的比較[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34（2）：111-114.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Comparison on RNA Extraction Eff i ciency of Five Nucleic Acid Extraction Kits for Newcastle disease Virus

Lü Yan，Wang Jingjing，Luo Yaoyao，Li Lin，Zhao Yunling，Zheng Dongxia，Zuo Yuanyuan，Yu Songmei，Liu Hualei，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In order to select a RNA extraction kit with high extraction eff i ciency in a short time and at a low price，the Newcastle disease viruses（NDVs）were used and the RNA extraction eff i ciency of fi ve RNA extraction kits produced by Roche，Tian Long and Thermo were compared. In the study，the RNA of NDV samples with different virus titers（Dilution100～10-8/EID50108.3）was extracted using five RNA extraction kits，the RNA extraction efficiency was evaluated by the Ct value of real-time RT-PCR，and the RNA extraction time and the price of kits were compared. The results showed the RNA extraction eff i ciency of High Pure Viral RNA Kit（Roche），Tian Long RNA extraction kit（Tian Long），and LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）was higher than the other two kits. And for the samples with low virus titers，the RNA extraction eff i ciency of LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）was the highest . Among all the fi ve kits，Tian Long RNA extraction kit was the most convenient one with the shortest time，while the LabServ Viral Total NA Kit was the cheapest. Considering of the RNA extraction eff i ciency，the time and the price，LabServ Viral Total NA Kit（Thermo）is better than the other kits and is the best choice for the detection of mass samples.

Newcastle disease virus（NDV）；RNA extraction；real-time RT-PCR

S852.65

：B

：1005-944X（2017）06-0098-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.028

公益性行業(yè)科研專項（210303033）；國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0500800）并列第一作者：呂 艷、王靜靜

劉華雷、王志亮