蔣文明，彭 程，李金平，王素春，侯廣宇，袁萬哲，陳繼明

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；

2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

H7亞型流感病毒通用及區(qū)分強(qiáng)弱毒RT-PCR方法的建立

蔣文明1，彭 程1，李金平1，王素春1，侯廣宇1，袁萬哲2，陳繼明1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；

2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北保定 071001）

為建立可以區(qū)分H7亞型流感病毒強(qiáng)弱毒的方法，根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列，設(shè)計2條特異性引物，建立了擴(kuò)增H7病毒HA裂解位點(diǎn)區(qū)域的通用RT-PCR方法。在此基礎(chǔ)上，在裂解位點(diǎn)處設(shè)計1條引物，建立了可以區(qū)分H7強(qiáng)弱毒的RT-PCR方法。該方法對弱毒株可以擴(kuò)增出約337 bp的片段，對強(qiáng)毒株可以擴(kuò)增出約349 bp和227 bp的片段，對其他常見亞型流感病毒的RT-PCR擴(kuò)增均為陰性。敏感性試驗結(jié)果表明，該RT-PCR方法的檢測下限為1 fg的H7N9病毒模板。該方法對10份實驗室已鑒定好的H7N9病毒進(jìn)行對比驗證，兩者的符合率為100%。試驗結(jié)果表明，該方法具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于H7亞型流感病毒的快速檢測，同時還可區(qū)分強(qiáng)弱毒，對H7N9病毒，尤其是高致病性病毒的早期診斷和有效防控可提供有效技術(shù)支撐。

流感病毒；H7N9；RT-PCR；強(qiáng)毒株

2013年3月發(fā)生的“H7N9事件”給家禽業(yè)帶來了巨大的沖擊和經(jīng)濟(jì)損失[1]，但病毒遺傳信息和動物實驗都證明家禽中分離的H7N9病毒對家禽是無致病力的。盡管如此，仍存在變異成高致病性毒株的風(fēng)險。2017年以來，某些地區(qū)的家禽發(fā)生了H7N9高致病性流感疫情，說明某些家禽中的H7N9病毒已經(jīng)從低致病性毒株變異為高致病性毒株。

及早發(fā)現(xiàn)H7N9病毒是切實保障養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的前提。因此，建立H7N9病毒強(qiáng)毒株的快速檢測方法十分必要。雖然已有可同時鑒別H7亞型和N9亞型的雙重RT-PCR方法[2]，但該方法不能對高致病性H7N9病毒做出診斷。本研究在此基礎(chǔ)上，建立了一種新的RT-PCR方法，不僅可以擴(kuò)增H7亞型流感病毒，還可以區(qū)分強(qiáng)毒株與弱毒株。

1 材料與方法

1.1 病毒

H7N9、H7N2、H7N3、H5N6、H9N2等亞型流感病毒均由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

QIAamp Viral RNA Mini Kit，購自Qiagen公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、DL2000 Plus DNA Marker，購自Vazyme公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的序列，針對H7流感病毒基因序列保守區(qū)設(shè)計1對引物，使其能夠擴(kuò)增HA1、HA2裂解位點(diǎn)區(qū)域（表1）。同時，根據(jù)裂解位點(diǎn)處的核苷酸序列，設(shè)計1條引物，使其能夠擴(kuò)增H7強(qiáng)毒的HA基因。

1.4 H7通用RT-PCR方法的建立

根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明提取病毒RNA，用微量核酸分析儀測定病毒RNA含量。將RNA作10倍比稀釋，取2.0 μL稀釋后的RNA模板，加入到22.0 μL RT-PCR預(yù)混液中，包括：2 × RT-PCR Buffer 12.5 μL，引物H7F1/H7R1各1.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 1.25 μL，ddH2O 7.25 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，然后進(jìn)行35個循環(huán)（94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中引物的比較

以10倍比稀釋的RNA為模板，分別以引物H7F1/H7R1、H7F2/H7R2和H7F3/H7R3進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 區(qū)分H7強(qiáng)弱毒RT-PCR方法的建立及優(yōu)化

以引物H7F1/H7R1/H7RQ進(jìn)行擴(kuò)增，對下游引物H7R1的終濃度分別設(shè)定為0.04、0.08、0.12、0.16和0.20 μmol/L，然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，確定最適引物濃度。

1.7 RT-PCR方法的特異性

利用優(yōu)化的RT-PCR方法分別檢測H7N2、H7N3、H7N9、H5N6、H9N2等常見亞型的流感病毒，檢驗該方法的特異性。

1.8 RT-PCR方法的敏感性

用微量核酸分析以上測定的H7N9病毒RNA含量，然后作10倍比稀釋，利用優(yōu)化的RT-PCR方法，對不同稀釋度的RNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗該方法的敏感性。

1.9 RT-PCR方法的準(zhǔn)確性

利用建立的RT-PCR方法對實驗室分離并已測序鑒定的10株H7N9病毒進(jìn)行檢測，檢驗該方法的準(zhǔn)確性。

表1 擴(kuò)增H7亞型的引物

2 結(jié)果

2.1 通用RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，H7F1/ H7R1引物可以從含有H7N9病毒的尿囊液中擴(kuò)增得到H7亞型特異的基因片段，獲得與預(yù)期片段大小相符的條帶（圖1）。敏感性試驗結(jié)果表明，H7F1/H7R1引物對的檢測下限為1 fg。

圖1 H7亞型通用引物的敏感性試驗

2.2 與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的對比

2.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，H7F2/ H7R2引物對的檢測下限為10 fg，H7F3/H7R3引物對的檢測下限為10 fg（圖2）。

圖2行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中H7亞型通用引物的敏感性試驗

2.3 區(qū)分強(qiáng)弱毒RT-PCR方法的建立及優(yōu)化

通過對下游引物H7R1的濃度優(yōu)化，確定RTPCR中H7F1、H7RQ最佳引物濃度分別為0.4 μmol/L，H7R1最佳引物濃度為0.08 μmol/L（圖3）。

2.4 RT-PCR方法的特異性

利用建立的雙重RT-PCR方法，分別對H7N9、H7N2、H7N3、H5N6、H9N2、IBV、NDV、IBDV、ILTV等病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該方法只能擴(kuò)增H7亞型的流感病毒，對其它亞型流感病毒和其他常見禽病病毒擴(kuò)增均為陰性，且對SPF雞胚擴(kuò)增結(jié)果也為陰性（圖4），表明該方法具有良好的特異性。

圖3不同引物濃度對H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

圖4 RT-PCR方法對不同亞型流感病毒RNA的擴(kuò)增

2.5 RT-PCR方法的敏感性

將提取的RNA依次做10倍比稀釋，每個稀釋度取2 μL作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示1 fg的H7N9可擴(kuò)增出特異性條帶（圖5），說明該方法具有良好的敏感性。

圖5 RT-PCR對不同濃度H7N9病毒RNA模板的擴(kuò)增

2.6 RT-PCR方法的準(zhǔn)確性

對實驗室分離鑒定的10株H7N9病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，該雙重RT-PCR方法均可以進(jìn)行良好的擴(kuò)增（圖6），說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

圖6 RT-PCR方法對實驗室分離鑒定的H7N9病毒檢測結(jié)果

3 討論

隨著病毒的進(jìn)化，某些H7N9病毒已經(jīng)從低致病性變異為高致病性毒株，對養(yǎng)禽業(yè)危害巨大。

2014年建立的同時檢測H7亞型和N9亞型的雙重RT-PCR方法，既可確定H7N9亞型流感病毒，也可鑒別單個H7亞型或N9亞型流感病毒。但該方法只能確定是否為H7亞型病毒，而不能確定是高致病性毒株還是低致病性毒株。本研究根據(jù)GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的H7亞型病毒HA基因序列，針對HA基因序列保守區(qū)設(shè)計1對引物，使其能夠擴(kuò)增HA1、HA2裂解位點(diǎn)區(qū)域，a其可以作為H7亞型病毒的通用檢測引物。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，即可確定該病毒是否已發(fā)生變異。

為進(jìn)一步更直觀地對H7亞型高致病性病毒進(jìn)行檢測，根據(jù)裂解位點(diǎn)處的核苷酸序列，設(shè)計1條引物，使其能夠擴(kuò)增H7強(qiáng)毒的HA基因。這樣，如果檢測的是弱毒株，則該方法只能擴(kuò)增出約337 bp的片段；如果檢測的是強(qiáng)毒株，則能擴(kuò)增出約349 bp和227 bp的片段。

敏感性試驗結(jié)果表明，本方法最低能檢出1 fg的H7N9病毒模板，證明該方法的敏感性較高。與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RT-PCR檢測方法》（NY/ T 772—2013）和（NY/T 772—2004）中的檢測引物相比，敏感性更高，而且行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的引物不能擴(kuò)增HA裂解位點(diǎn)區(qū)域，即使擴(kuò)增出H7片段，也不能通過測序等方法鑒定出強(qiáng)弱毒。

本研究建立的RT-PCR方法，對于H7病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的檢測均可出現(xiàn)與試驗設(shè)計大小相符的條帶，而對于其他亞型流感病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表現(xiàn)出較好的特異性；樣品符合性試驗結(jié)果表明，該方法表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性。

本研究建立的區(qū)分H7亞型流感病毒強(qiáng)弱毒的RT-PCR檢測方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。在同一反應(yīng)體系中，加入3條引物，即可通過電泳快速區(qū)分強(qiáng)弱毒，省時省力。如果反應(yīng)體系中只加入上下游2條引物，則可以作為H7亞型病毒的通用檢測方法，進(jìn)一步對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，可以確定病毒的變異情況，即使病毒裂解位點(diǎn)進(jìn)一步發(fā)生變異，該方法仍然可以有效擴(kuò)增和進(jìn)行下游信息分析。該方法不僅實現(xiàn)了對H7病毒的快速檢測，同時還可區(qū)分強(qiáng)弱毒，對H7N9病毒，尤其是高致病性病毒的早期診斷和有效防控具有重要意義。

[1] 蔣文明. 從“H7N9禽流感”命名說開去[J]. 中國動物檢疫，2014，8（31）：80-82.

[2] 蔣文明，李金平，于美芳，等. 雙重RT-PCR快速檢測H7N9流感病毒方法的建立[J]. 中國動物檢疫，2015，32（5）：65-68.

[3] 農(nóng)業(yè)部. 禽流感病毒RT-PCR檢測方法：NY/T 772—2013 [S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[4] 農(nóng)業(yè)部. 禽流感病毒RT-PCR檢測方法：NY/T 772—2004 [S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of a General Method for Distinguishing Inf l uenza RT-PCR Virus from H7 Subtype and Distinguishing between Virulent and Attenuated Inf l uenza Viruses

Jiang Wenming1，Peng Cheng1，Li Jinping1，Wang Suchun1，Hou Guangyu1，Yuan Wanzhe2，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. College of Animal Medicine，Agriculture University of Hebei，Baoding，Hebei 071001）

In order to establish a method of distinguishing virulent and attenuated strains of H7 subtype inf l uenza virus rapidly，two specif i c primers were designed according to the conserved regions on the HA sequences of H7 subtype virus in Genbank and GISAID. On this basis，a reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）method was established for amplif i cating the region and spanning the cleavage site of HA. The attenuated strain can be amplif i ed to fragments measured about 337 bp，and can be amplif i ed to fragments measured about 349 bp and 227 bp for the virulent strain. The method was negative for RT-PCR amplif i cation of other common subtype inf l uenza viruses. Sensitivity test showed that the detection limit of the RT-PCR method was 1 fg for the H7N9 virus templates. With 10 H7N9 virus strains identif i ed in the laboratory，the coincidence rate was 100%. It was showed that the established RT-PCR method was specif i c，rapid，sensitive，and accurate，and it could be used for rapid detection of H7 subtype inf l uenza virus. It was used to distinguish virulent and attenuated strains，so to provide technical support for early diagnosis and effective prevention and control for H7N9 virus，especially highly pathogenic virus.

inf l uenza virus；H7N9；RT-PCR；virulent strains

S855.65

：A

：1005-944X（2017）06-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.026

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項（2012FY111000）