蔣文明，侯廣宇，李金平，王素春，袁萬哲，王 灝，程善菊，陳繼明

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071001）

H7N9亞型流感候選疫苗株的構建及免疫效力試驗

蔣文明1，侯廣宇1，李金平1，王素春1，袁萬哲2，王 灝1，程善菊1，陳繼明1

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2. 河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院，河北保定 071001）

近期的禽流感主動監(jiān)測結果表明，我國部分H7N9亞型流感病毒已突變?yōu)楦咧虏⌒远局辍轭A防H7N9流感在禽群中引發(fā)大流行，本研究利用反向遺傳技術，以雞胚適應毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）的內部基因為骨架，分別以H7N9亞型流感弱毒A/chicken/SH/3277/2016（S3277）和強毒A/chicken/SD/GDRZ/2017（GDRZ）的基因組為模板，擴增HA及NA基因，并對GDRZ HA基因進行修飾，去除裂解位點處的多個堿性氨基酸，使其獲得低致病性流感病毒的分子特征，最終成功構建了H7N9流感疫苗候選株rS3277和rGDRZ。將兩株病毒與自然分離的H7N3弱毒株A/duck/ZJ/1208/2009（ZJ1208）同時作為候選疫苗株，進行免疫效力試驗。結果表明，rS3277、rGDRZ和ZJ1208滅活疫苗免疫SPF雞21 d后，針對GDRZ的平均HI抗體效價分別達到7.2 log2、10.1 log2和6.2 log2。免疫攻毒保護試驗結果表明，上述3種滅活疫苗均可100%保護SPF雞免受H7N9強毒攻擊。本研究所構建的rGDRZ重組候選疫苗株可為H7N9高致病性流感的防控提供支持。

流感病毒；H7N9；強毒；反向遺傳；疫苗

2013年3月底H7N9亞型流感在我國出現(xiàn)并逐漸流行。雖然H7N9病毒弱毒株對家禽無致病性，但給我國養(yǎng)禽業(yè)（主要是雞）造成了嚴重的經濟損失，甚至導致了一定數量的人員感染和死亡，嚴重威脅著人類健康和公共衛(wèi)生安全。更讓人關注的是，2017年，我國有關機構主動監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，部分H7N9病毒已突變?yōu)閷仪菥哂懈咧虏⌒缘亩局?，其對養(yǎng)禽業(yè)的威脅更大。2017年3月19日，湖南省永州市東安縣的蛋雞發(fā)生H7N9流感疫情，發(fā)病29 760只，死亡18 497只。該疫情雖然得到了及時有效的控制，但H7N9高致病性毒株的出現(xiàn)使得此次疫情備受關注。目前沒有商品化的疫苗用于H7N9流感預防，因此有必要構建針對H7N9的疫苗候選株，以應對該病毒的流行和威脅。本研究以H7N9弱毒代表株S3277和強毒代表株GDRZ為表面基因供體，以PR8毒株的內部基因為骨架，構建了疫苗候選株rS3277和rGDRZ，同時以自然分離的H7N3弱毒作為候選疫苗株，進行免疫效力和攻毒保護試驗，旨在為H7N9流感的防控提供儲備疫苗。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細胞、載體和實驗動物

H7N9弱毒A/chicken/SH/3277/2016（S3277）、H7N9強毒A/chicken/SD/GDRZ/2017（GDRZ），本實驗室分離保存；H7N3弱毒A/duck/ ZJ/1208/2009（ZJ1208），中國動物衛(wèi)生與流行病學中心劉華雷博士贈送；雙向表達載體pH205及表達PR8基因的pH205-PB2、pH205-PB1、pH205-PA、pH205-NP、pH205-M、pH205-NS，本實驗室構建保存；293T細胞，本實驗室保存；SPF雞胚和SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑

QIAamp Viral RNA mini Kit，購自Qiagen公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScript Reverse Transcriptase、T4 DNA連接酶、pMD19-T、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，購自TaKaRa公司；限制性內切酶BsmBI，購自NEB公司；轉染試劑Lipofectamine 3000，購自Invitrogen公司。

1.3 引物設計

關于HA和NA基因的擴增引物，按照以前發(fā)表的文獻合成[1]。設計引物使GDRZ強毒株HA裂解位點處的氨基酸序列“PKGKRTAR/GLF”突變成弱毒株的HA裂解位點“PKGK/GLF”（表1、圖1）。

表1擴增HA、HA突變體、NA基因的引物

圖1 GDRZ HA基因突變前后裂解位點處測序結果

1.4 病毒RNA的提取及基因擴增

對HA和NA基因的擴增，按照以前發(fā)表的文獻進行[2]。按照QIAamp Viral RNA mini Kit說明書提取病毒RNA，利用PrimeScript Reverse Transcriptase進行反轉錄。以cDNA為模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase擴增病毒HA和N9基因片段。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA膠回收試劑盒純化回收，然后與T載體連接，將陽性重組質粒送青島志遠生物測序鑒定。

對于HA突變體的構建，以鑒定正確的GDRZ HA陽性重組質粒為模板，將2對引物Bm-HA-F/ HA1-R和HA2-F/Bm-HA-R分別擴增出HA1和HA2片段，然后以HA1和HA2的混合物為模板，Bm-HA-F/Bm-HA-R為引物，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase進行重疊延伸PCR（SOE-PCR），擴增出HA突變體片段。將PCR產物經膠回收后，與T載體連接，對陽性重組質粒進行測序鑒定。

1.5 重組表達質粒的構建

將鑒定正確的GDRZ HAmut以及S3277 HA和N9重組質粒經BsmBI酶切后，與BsmBI酶切的表達載體pH205相連，提取重組質粒，進行測序鑒定，并利用DNAStar7.0軟件進行序列分析。

1.6 病毒拯救與鑒定

具體操作按照Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑盒說明進行。將PR8的6個內部基因重組表達質粒、HA或HA突變體和對應的N9表面基因重組表達質粒各0.6 μg混合，共同轉染293T細胞。轉染48 h后，將細胞懸液接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃繼續(xù)孵化，72 h后收集尿囊液，測定其血凝活性。將血凝陽性的尿囊液經10 000倍稀釋后接種10日齡SPF雞胚，擴增病毒，0.1 mL/枚，72 h后收集尿囊液，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。重組病毒命名為rS3277和rGDRZ。對提取救獲的病毒RNA，用RT-PCR擴增全基因組并測序。

1.7 疫苗制備

將病毒經10 000倍稀釋后接種10日齡SPF雞胚，擴增病毒，0.1 mL/枚，72 h后收集尿囊液，加入甲醛至終濃度0.1%，2～8 ℃滅活48 h。將尿囊液和白油佐劑按照1:2的比例，乳化制成滅活油佐劑疫苗。

1.8 免疫保護試驗

將40只21日齡SPF雞分成4組，每組10只；將各組雞分別頸部皮下接種rS3277、rGDRZ和ZJ1208滅活油苗，接種劑量均為0.3 mL/只，其中1組不接種疫苗，直接攻毒組作為對照。免疫21 d后采血[3]，分離血清，測定抗體效價，并用H7N9強毒GDRZ（EID50=106）對各組雞進行滴鼻攻毒，連續(xù)觀察10 d，統(tǒng)計排毒、發(fā)病和死亡情況。

2 結果

2.1 表達HA或HA突變體以及N9重組質粒的構建

采用SOE-PCR，擴增GDRZ株的HA基因，并將其克隆至pH205載體中，構建pH205-GDRZmHA重組質粒。測序結果表明（圖1），HA裂解位點的氨基酸序列已由強毒病毒HA分子的“-PKGKRTAR-”突變?yōu)槿醵静《綡A分子的“-PKGK-”。按照常規(guī)方法擴增HA和N9，構建重組表達載體pH205-GDRZNA、pH205-S3277HA、pH205-S3277NA。

2.2 重組病毒的拯救與鑒定

將成功構建的8個重組質粒轉染293T細胞，利用反向遺傳技術，拯救出重組病毒rS3277和rGDRZ；將其在雞胚中繁殖1代后，提取病毒RNA，進行反轉錄，對拯救病毒的全基因組進行擴增、測序。測序結果表明，HA基因裂解位點已突變?yōu)椤?PKGK-”，為低致病性H7N9病毒分子特征，所有8個片段序列均與預期的一致。

2.3 候選疫苗的免疫保護和交叉免疫保護試驗

候選疫苗的免疫和攻毒保護試驗結果見表2。免疫21 d后，rS3277疫苗對母本病毒的平均HI滴度為10.3 log2，對強毒GDRZ的平均HI滴度為7.2 log2；rGDRZ疫苗對母本病毒的平均HI滴度為10.1 log2；ZJ1208疫苗對母本病毒的平均HI滴度為9.7 log2，對強毒GDRZ的平均HI滴度為6.2 log2。

表2候選疫苗對SPF雞的免疫和攻毒保護試驗結果

攻毒保護試驗結果顯示，rS3277和rGDRZ重組滅活疫苗，以及H7N3自然分離弱毒制備的滅活疫苗，為SPF雞提供的針對H7N9強毒GDRZ的保護率均為100%。未免疫對照組，經強毒GDRZ攻毒后5 d內全部死亡。

3 討論

2013年，H7N9亞型流感在我國長三角地區(qū)出現(xiàn)，并迅速向全國蔓延[4]。2017年以前，在家禽中分離的H7N9病毒絕大多數為弱毒株，對家禽沒有致病力。2017年前監(jiān)測數據顯示，有些地區(qū)的部分H7N9病毒突變?yōu)楦咧虏⌒远局?，對雞有高致病力，對養(yǎng)禽業(yè)帶來極大威脅。

前期試驗研究表明，以分離的H7N3自然弱毒ZJ1208免疫小鼠，可以產生針對H7N9病毒的HI抗體和中和抗體[5]。因此，本試驗將ZJ1208作為候選疫苗株進行試驗。同時，在生產中，自然分離的H7N9病毒可能存在一定的潛在危險，所以本研究利用反向遺傳技術，以雞胚高產適應毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）的內部基因為骨架，分別以弱毒株S3277和強毒株GDRZ的HA和NA表面基因為供體，通過對GDRZ HA基因進行分子突變修飾，去除HA蛋白裂解位點處的多個堿性氨基酸，使其獲得H7N9低致病性流感的分子特征，對雞胚和SPF雞均不能發(fā)病和致死，同時又保證了重組病毒與流行株的抗原匹配性，成功構建了針對H7N9亞型流感的疫苗候選株rS3277和rGDRZ。

SPF雞免疫結果顯示，免疫rS3277、rGDRZ和ZJ1208滅活油苗21 d后，血清中針對母本病毒的平均HI抗體效價分別達到10.3 log2、10.1 log2和9.7 log2，說明重組疫苗具備良好的免疫原性。但是，免疫rS3277和ZJ1208產生的，針對GDRZ強毒株的平均HI抗體效價分別為7.8 log2和6.2 log2，與針對母本病毒的平均HI抗體效價分別相差了3.1 log2和3.5 log2，說明rS3277和ZJ1208與GDRZ強毒株之間有一定的抗原性差異。HA氨基酸序列對比結果顯示，S3277和ZJ1208與GDRZ之間的同源性分別為97.1%和95.9%，這與HI試驗結果一致。

攻毒保護試驗結果表明，rS3277和rGDRZ重組滅活疫苗，以及自然分離的ZJ1208制備的滅活疫苗，均可以對SPF雞提供針對強毒100%的保護。但是相對rS3277和ZJ1208候選疫苗株，rGDRZ可以產生針對強毒更高的HI抗體滴度。本研究構建的rGDRZ重組病毒株作為候選疫苗株，為H7N9流感的防控提供了可行的探索和嘗試，為H7N9流感的防控提供了技術支持。

[1] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol，2001，146（12）：2275-2289.

[2] 蔣文明，侯廣宇，王素春，等. H5N6亞型禽流感病毒反向遺傳疫苗株的構建及免疫保護試驗[J]. 中國動物檢疫，2015，32（1）：64-67.

[3] 宋洋銘，谷春陽，曾顯營，等. Clade7.2 H5N1亞型禽流感重組病毒疫苗株的構建及免疫效力評價[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2016，38（7）：580-584.

[4] 蔣文明. 從“H7N9禽流感”命名說開去[J]. 中國動物檢疫，2014，31（8）：80-82.

[5] JIANG W M，WANG S C，LIU H L，et al. Evaluation of avian inf l uenza virus isolated from ducks as a potential live vaccine candidate against novel H7N9 viruses[J]. Vaccine，2014，32（48）：6433-6439.

（責任編輯：朱迪國）

Construction of H7N9 Subtype Inf l uenza Candidate Vaccine Strain and its Immune Eff i cacy Test

Jiang Wenming1，Hou Guangyu1，Li Jinping1，Wang Suchun1，Yuan Wanzhe2，Wang Hao1，Cheng Shanju1，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. College of Animal Medicine，Hebei Agricultural University，Baoding，Hebei 071001）

Recently，the nationwide active surveillance results revealed that a number of H7N9 subtype influenza A viruses have evolved into highly pathogenic strains in China. In order to prevent the potential pandemic caused by the mutant viruses to poultry，two reassortant viruses，tentatively named rS3277 and rGDRZ，were generated using reverse genetics in this study. The rescued viruses contained intact or modif i ed HA and NA genes of currently circulating isolates A/ chicken/SH/3277/2016 and A/chicken/SD/GDRZ/2017，respectively，while containing the internal genes derived from A/ Puerto Rico/8/34（PR8）. The novel reassortant candidate vaccine virus，rGDRZ，with deletion of the multi-basic amino acid motif in the HA gene，was served as a vaccine candidate and examined for immune eff i cacy，together with rS3277 and an naturally isolated H7N3 virus，A/duck/ZJ/1208/2009（ZJ1208）. The results showed that the HI antibody titers against GDRZ reached 7.2 log2，10.1 log2 and 6.2 log2，respectively，when serum of SPF chickens immunized with rS3277，rGDRZ and ZJ1208 was tested on 21 days post-immunization. Importantly，the results of immune challenge test showed that the rS3277，rGDRZ and ZJ1208 vaccines protected SPF chickens from H7N9 highly pathogenic GDRZ virus infection completely. Taken together，the recombinant candidate vaccine strain constructed by this research can provide strong support for the prevention and control of H7N9 highly pathogenic avian inf l uence.

inf l uenza virus；H7N9；virulent virus；reverse genetics；vaccine

S852.65

：A

：1005-944X（2017）06-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.025

科技部科技基礎性工作專項（2012FY111000）