孫 雨，楊 林，王傳彬，董 浩，楊天意，宋曉暉

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

疾病防控

產(chǎn)氣莢膜梭菌α蛋白的高效可溶性表達(dá)與基因工程亞單位疫苗的制備

孫 雨，楊 林，王傳彬，董 浩，楊天意，宋曉暉

（中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600）

通過優(yōu)化α蛋白的密碼子、去除蛋白信號(hào)肽、選擇親水性與抗原性較好的序列、優(yōu)化表達(dá)條件等方法，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)的產(chǎn)氣莢膜梭菌可溶性重組α蛋白，用該蛋白免疫小鼠，再用間接ELISA方法測(cè)定血清抗體水平。結(jié)果表明：針對(duì)A型、B型、C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的保護(hù)率分別為100%、90%、85%和90%，小鼠三免后7～14 d抗體效價(jià)達(dá)到峰值。該研究表達(dá)的α蛋白具有較好的免疫原性，可進(jìn)一步用于研制預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因工程亞單位疫苗。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；α蛋白；可溶性表達(dá)與純化；基因工程亞單位疫苗

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是臨床上氣性壞疽病原菌中最多見的一種梭菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導(dǎo)致組織嚴(yán)重氣腫，繼而影響血液供應(yīng)，造成動(dòng)物機(jī)體組織大面積壞死，加之本菌在體內(nèi)能形成莢膜，故名產(chǎn)氣莢膜梭菌［1］。反芻動(dòng)物的氣性壞疽、腸毒血癥、出血性腸炎、牛羊猝死癥、羔羊痢疾均由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起［2］。α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌所有毒素基因中最重要的一種外毒素，A、B、C、D、E等5個(gè)型的細(xì)菌均可產(chǎn)生該毒素［3-5］。編碼α毒素的基因plc位于染色體上，大小為1 194 bp，可以編碼398個(gè)氨基酸，分子量為42.5 ku，其中成熟肽和信號(hào)肽分別由370個(gè)氨基酸和28個(gè)氨基酸組成。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)α毒素基因的功能及其致病機(jī)理研究較多。α毒素的致病機(jī)理就是依靠鞘磷脂酶和磷脂酶C兩種酶活性，將細(xì)胞膜的膜磷脂進(jìn)行水解，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞快速裂解死亡，同時(shí)該毒素對(duì)胰酶敏感，接觸后容易喪失活性［6-8］。α毒素基因相對(duì)保守，雖然不同菌株之間平均有1.3%的核苷酸以及1.2%的氨基酸序列不同，但這些核苷酸與編碼氨基酸的不同并不影響α毒素本身的活性［9-12］。α毒素基因的啟動(dòng)子能被大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別，因而α毒素在自身啟動(dòng)子下不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身高效表達(dá)，也可在大腸桿菌中得到高效表達(dá)。筆者等嘗試在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌可溶性重組α蛋白，并用其制備預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌的基因工程亞單位疫苗。

1 材料與方法

1.1 材料

載體：pET30a融合表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司；感受態(tài)細(xì)胞：BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；酶和試劑：限制性內(nèi)切酶BamHⅠ及XhoⅠ、T4DNA連接酶、2000 DNA Marker、SDS、IPTG、Taq PCR Master Mix均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司；瓊脂糖、DNA Extraction Kit、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖芯?gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；蛋白純化柱（鎳柱5 mL）、分子篩（Superdex2000）購(gòu)自GE公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑與不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司?；蚝铣桑喝诤系鞍啄康幕蛐虻暮铣捎扇A大基因生物科技有限公司完成。菌株：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C57-10、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌C58-5、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60-11均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 α重組基因的合成與引物設(shè)計(jì) 通過去除蛋白信號(hào)肽、優(yōu)化密碼子序列設(shè)計(jì)了α重組基因。根據(jù)α重組基因的序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，并分別在引物5’端添加BamHⅠ和3’端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)，用于目的片段的擴(kuò)增（下劃線部分為酶切位點(diǎn)）。

上游引物F：5’-GGATCCATGTTTTGGGACCCGGACACCGAC-3’

下游引物R：5’-CTCGAGTTATTTGATGTTATAGGTGCTGT-3’

1.2.2 高效可溶性融合表達(dá)載體pET30a-α的構(gòu)建及鑒定 將pET30a載體進(jìn)行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切體系為40 μL：10×酶切緩沖液4 μL，BamHⅠ和XhoⅠ各1 μL，載體24 μL，去離子水8 μL，酶切產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖電泳后膠回收試劑盒回收。然后將酶切好的載體與擴(kuò)增后的α編碼基因序列進(jìn)行連接，構(gòu)建10 μL的連接體系。其中，α編碼基因片段5.5 μL，pET30a載體1.5 μL，T4DNA連接酶1 μL，T4DNA連接緩沖液2 μL。輕敲管壁，上下顛倒混勻之后瞬離，放22℃連接儀中連接4h。將重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定及測(cè)序分析，將測(cè)序鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pET30a-α。

1.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 將pET30a-α連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21（DE3）細(xì)胞中。無菌條件下，取適量BL21菌液加到LB（Kan+）固體培養(yǎng)基平板上，將菌液涂布均勻，待菌液完全吸收后，做好標(biāo)記，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落分別進(jìn)行菌液鑒定、酶切鑒定、菌液測(cè)序，確定α片段轉(zhuǎn)化進(jìn)pET30a載體中。

1.2.4 重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件的建立 將上述鑒定的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coll BL21（DE3）中，挑取陽性克隆，37℃培養(yǎng)過夜。將菌液以1∶100接種于含卡那霉素（50 μg/mL）的液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6時(shí)，取出l mL未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，其余液體中加入異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。經(jīng)過對(duì)溫度、時(shí)間、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定蛋白高效可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件為：0.75 mmol/L的IPTG濃度，過夜誘導(dǎo)13 h大量表達(dá)后，于4℃、8 000 r/min離心30 min收集菌體。經(jīng)高壓大規(guī)模破碎菌體后，于4℃、16 000 r/min離心30 min收集上清。

1.2.5 重組蛋白表達(dá)形式的分析 取IPTG誘導(dǎo)表達(dá)13 h后的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。取1 mL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記，4℃、8 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入1 mL PBS重懸沉淀，8 000 r/min離心5 min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200 μL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠。于4℃離心機(jī)中16 000 r/min離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，向剩余的沉淀中加入50 μL PBS重懸沉淀。向上清和沉淀中加入10 μL 5× SDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水浴中煮沸5 min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取10 μL用于SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 可溶性重組蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化 菌液高壓破菌后，于4℃、16 000 r/min離心30 min，棄沉淀，上清用 0.22 μm濾膜過濾，后上樣至預(yù)先用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)上，分別用10個(gè)柱體積的20mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用 20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）沖洗鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品。

1.2.7 重組蛋白表達(dá)的鑒定 將純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至NC膜上，用10%的BSA進(jìn)行封閉，以產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清為一抗，兔抗鼠IgG－HRP（1∶20 000）為二抗，通過western－blot方法鑒定蛋白的特異性。

1.2.8 抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的制備 將使用分子篩純化的α蛋白用無菌PBS溶解，得到濃度為1 000 μg/mL的α溶液，脫毒后用于免疫。將α溶液與弗氏佐劑按1∶1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為首免疫苗。將α溶液與不完全弗氏佐劑按1∶1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗并脫毒，將其命名為二免疫苗。

1.2.9 細(xì)菌對(duì)小鼠最小致死量的測(cè)定 取體重在18～22 g之間的雌性小鼠100只，隨機(jī)將其分成4組（A組、B組、C組和D組），每組各25只。將每組再隨機(jī)分成5個(gè)小組，每個(gè)小組各5只小鼠，第1小組腹腔注射濃度為1×1010CFU/mL的菌液1 mL，第2小組注射0.8 mL，第3小組注射0.6 mL，第4小組注射0.4 mL，第5小組注射0.2 mL，并設(shè)10只PBS對(duì)照組。A組接種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C57－10）菌液，B組接種B型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C58－5）菌液，C組接種C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C59－4）菌液，D組接種D型產(chǎn)氣莢膜梭菌C60－1株菌液。于接種后一周內(nèi)觀察并記錄小鼠的存活情況。

1.2.10 產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn) 將80只體重在18～22 g的雌性昆明小鼠隨機(jī)分成4組（攻毒劑量組20只，并另設(shè)20只小鼠的PBS對(duì)照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第2次免疫與第3次免疫均采用皮下注射的方法，首次免疫用首免疫苗，第2次免疫與第3次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均為每只0.2 mL（重組蛋白免疫劑量為每只100 μg）；PBS對(duì)照組中的每只小鼠首次免疫、第2次免疫與第3次免疫均皮下注射0.2 mL PBS。首次免疫之前，先對(duì)小鼠進(jìn)行一次割尾采血，分離血清，用作陰性對(duì)照血清。首次免疫后，間隔14 d進(jìn)行第2次免疫，二免后14 d進(jìn)行第3次免疫。第3次免疫2周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對(duì)照組小鼠腹腔注射各型產(chǎn)氣莢膜梭菌。根據(jù)1.2.9中確定的細(xì)菌最小致死量進(jìn)行攻毒，具體的攻毒劑量為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（編號(hào)：C57－10）1.5× 109CFU、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌（編號(hào)：C58－5）為2×109CFU、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（編號(hào)：C59－4）為1.5×108CFU、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌（編號(hào)：C60－1）為1.8×109CFU。

1.2.11 疫苗免疫后小鼠體內(nèi)抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律研究 對(duì)5只注射疫苗的對(duì)照組小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律檢測(cè)，自一免后開始每周采血一次，分離血清，于－80℃冰箱保存，采用間接ELISA方法檢測(cè)免疫動(dòng)物抗體水平。具體步驟：用分子篩純化的α蛋白包被ELISA板，采用棋盤方陣滴定法確定蛋白最適包被濃度和最佳血清稀釋度，以不同濃度的BSA封閉酶標(biāo)板確定最佳封閉液濃度，優(yōu)化酶標(biāo)二抗工作濃度、反應(yīng)時(shí)間等條件，陽性血清與陰性血清的OD450比值（P/N）最大的孔所對(duì)應(yīng)的反應(yīng)條件為ELISA方法的最佳反應(yīng)條件。按照上述間接ELISA方法檢測(cè)試驗(yàn)小鼠初次免疫后0～12周的小鼠血清中抗體效價(jià)水平。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

使用BamHⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pET30a－α進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果（見圖1）表明，酶切產(chǎn)物于924 bp處出現(xiàn)一條明顯的條帶，說明目的片段成功克隆至pET30a載體中。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定與表達(dá)形式分析

將誘導(dǎo)后的菌體制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明在41 kD處出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明成功獲得重組蛋白pET30a-α（見圖2）。將重組蛋白α與產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清反應(yīng)，結(jié)果顯示該重組蛋白可被產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清所識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)性（見圖3）。通過SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果融合蛋白均為可溶性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用pET30a構(gòu)建的pET30a-α載體，經(jīng)過可溶性誘導(dǎo)表達(dá)條件的不斷優(yōu)化，表達(dá)的可溶性重組蛋白占總蛋白的比例非常高。通過NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（ND 2000）對(duì)得到的蛋白純度進(jìn)行定量分析，并結(jié)合蛋白灰度分析軟件分析蛋白含量，結(jié)果表明，大部分α融合蛋白以可溶性的形式存在于細(xì)菌破碎菌體的上清液中，可溶性蛋白目的條帶表達(dá)明顯，上清液中雜質(zhì)較少（見圖2）。

圖2 純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

圖3 蛋白的Western-blotting鑒定

2.3 可溶性蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化

將鎳柱接入AKTA系統(tǒng)，分別用10個(gè)柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl的溶液（pH值8.0）與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑的溶液（pH值8.0）沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品。通過紫外吸收可以發(fā)現(xiàn)，目的蛋白峰與雜質(zhì)峰能夠有效分離。使用分子篩對(duì)獲得的目的蛋白進(jìn)一步純化，可得到純度更高的目的蛋白，并發(fā)現(xiàn)該重組蛋白的結(jié)構(gòu)為單體結(jié)構(gòu)（見圖4）。

圖4 重組蛋白α-his的AKTA系統(tǒng)純化鑒定結(jié)果

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)結(jié)果

攻毒劑量組（免疫α-his）對(duì)各型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護(hù)效果。攻毒劑量組（免疫α-his）抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊7 d內(nèi)的免疫保護(hù)率為100%（20只全部存活），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護(hù)率為 90%（18只存活，2只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護(hù)率為 85%（17只存活，3只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；攻毒劑量組（免疫α-his）抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊的免疫保護(hù)率為90%（18只存活，2只死亡），而PBS對(duì)照組小鼠全部死亡。詳見圖5。

2.5 疫苗免疫后小鼠體內(nèi)抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律

將純化后的α蛋白作為診斷抗原包被酶標(biāo)板檢測(cè)小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發(fā)現(xiàn)α蛋白作為診斷抗原建立的檢測(cè)方法均具有非常好的靈敏性與特異性。結(jié)果如表1所示，α蛋白質(zhì)量濃度為5 μg/mL、血清稀釋倍數(shù)為1∶200時(shí)，P/N值最大（P/N值≥2.1時(shí)樣品判為陽性），因此確定抗原的最佳包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)確定HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG按1∶20 000的比例稀釋、37℃作用1 h、加入TMB顯色液8 min后OD450值最佳。分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中小鼠首免后0～12周的血清中抗體效價(jià)水平，結(jié)果表明，α融合毒素蛋白免疫組抗體效價(jià)有明顯升高，在二免后抗體效價(jià)快速上升，小鼠三免后7～14 d抗體效價(jià)達(dá)到峰值。詳見圖6。

表1 ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

圖6 小鼠免疫血清抗體消長(zhǎng)曲線

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致病因素是其分泌的外毒素，種類多達(dá)13種，其中α毒素是最主要的外毒素，根據(jù)產(chǎn)生外毒素的種類不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E五個(gè)主要血清型。產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素導(dǎo)致的動(dòng)物傳染病是當(dāng)前動(dòng)物疫病防控工作的主要難題之一。傳統(tǒng)疫苗在治療和預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病方面雖然取得了一定的效果。但這些疫苗易引起動(dòng)物局部炎癥以及毒性反應(yīng)等。研發(fā)能表達(dá)α外毒素抗原蛋白，并且不破壞α外毒素抗原蛋白的免疫原性，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌α外毒素引起的疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解決的技術(shù)難題［13-16］。

α毒素是5種類型產(chǎn)氣莢膜梭菌共有的毒素，也是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要毒素，因其具有強(qiáng)啟動(dòng)子，所以該毒素不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身中高效表達(dá)，也可在大腸桿菌中得到高效表達(dá)。此外，也可將其置于其他啟動(dòng)子下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得高效表達(dá)。這一點(diǎn)十分有利于α毒素作為基因工程疫苗的研究［17］。林明輝等［18］在成功構(gòu)建重組高效表達(dá)工程菌株pBV220cpa408的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)了α基因在大腸桿菌中的部分可溶性表達(dá)，表達(dá)量達(dá)43.75%，用純化可溶性蛋白免疫昆明小鼠，被免疫小鼠獲得了較高的保護(hù)。許崇波等［19］克隆了第68位氨基酸殘基后面的α毒素基因片段，并將其置于T7啟動(dòng)子下，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）中表達(dá)。結(jié)果α毒素基因得到高效表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物喪失了α毒素本身的活性，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其表達(dá)量占菌體總蛋白的33.21%，而且保留了α毒素絕大部分的免疫原性。Zeng等［14］構(gòu)建了產(chǎn)氣莢膜梭菌α蛋白，并獲得了一定的免疫保護(hù)性。Bai等［20］將產(chǎn)氣莢膜梭菌α基因進(jìn)行重組表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。李娜［21］對(duì)羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了分離鑒定并對(duì)α毒素的原核表達(dá)和免疫原性做了研究，并設(shè)計(jì)針對(duì)a毒素成熟肽序列的引物，采用PCR方法擴(kuò)增α毒素成熟肽序列，將其插入質(zhì)粒pET-28b構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28b-cpa，用重組蛋白制備亞單位疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明，重組α毒素可以刺激產(chǎn)生抗α毒素抗體免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫抗體在免疫后28 d達(dá)到最高水平（1∶6 400），并能夠?qū)γ庖咝∈筇峁┮欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)作用。但是該重組質(zhì)粒表達(dá)出的蛋白為部分可溶性蛋白，可溶性蛋白表達(dá)量占菌體可溶性蛋白的34.6%。

現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達(dá)與純化方法相對(duì)復(fù)雜，表達(dá)產(chǎn)物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達(dá)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外非常少。因?yàn)榘w中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進(jìn)行變性與復(fù)性處理。蛋白的變性與復(fù)性是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主要制約因素。采用可溶性表達(dá)方式可克服這一問題。構(gòu)建可溶性表達(dá)載體并優(yōu)化可溶性蛋白的高效表達(dá)方法，是本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來一直研究的熱點(diǎn)課題。

本研究通過優(yōu)化密碼子、切除蛋白信號(hào)肽、優(yōu)化表達(dá)條件等多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行反復(fù)探索，成功地在大腸桿菌中獲得了可溶性高表達(dá)抗原。大腸桿菌表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，利用大腸桿菌獲得高表達(dá)的活性蛋白，為進(jìn)一步開發(fā)基因工程亞單位疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究以高效表達(dá)的α重組蛋白為基礎(chǔ)，研制出了抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的融合蛋白疫苗。該疫苗免疫動(dòng)物后可使動(dòng)物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。該疫苗在抵抗A型、B型、C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率分別為100%、90%、85%和90%，最高抗體效價(jià)可達(dá)1∶128 000。綜上所述，該研究構(gòu)建的α重組蛋白可以作為預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染疫苗研究的方向，為下一步研制產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因工程亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)，該重組菌株有望作為產(chǎn)氣莢膜梭菌基因工程疫苗的候選生產(chǎn)菌株。

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Efficient and Soluble Expression of α Protein of Clostridium perfringens and the Preparation of Genetic Engineering Subunit Vaccine

Sun Yu，YangLin，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

According to optimization of codon，removal of the signal peptide，selection on better hydrophilicity and antigenic sequences，and optimization of the expression conditions in this study，the soluble α fusion protein was obtained in Escherichia coli expression system.The results showed that the serum antibody level increased obviously after immuning，and it could resist the attack of Clostridium perfringens.The vaccine could resist the attack of type A，B，C and D of Clostridium perfringens，and the immune protection rate in mouse were 100%，90%，85%and 90%，respectively.After the third immune，the antibody titer in mice reached a peak at 7 to 14 days.The vaccine can be used to control the disease caused by Clostridium perfringens infection，and it has a good application prospect.

Clostridium perfringens；α protein；soluble expression and purification；genetic engineeringsubunit vaccine

S851

A

2095-3887（2017）03-0040-06

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.011

2017-04-01

十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500901）

孫雨（1983－），男，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病預(yù)防控制研究。

宋曉暉（1978－），女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事草食動(dòng)物與人畜共患病預(yù)防控制研究。