羅生金，黃 浩，張 磊，阿不都力·尼亞孜

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密 839000）

優(yōu)質(zhì)肉羊超數(shù)排卵優(yōu)化組合方案應(yīng)用研究

羅生金，黃 浩，張 磊，阿不都力·尼亞孜

（新疆哈密地區(qū)畜牧工作站，哈密 839000）

試驗旨在探索優(yōu)化超排方案，提高肉羊胚胎生產(chǎn)效率。在新疆哈密市牧祥合作社用FSH+PG遞減4 d 8針注射法處理供體羊44只，沖胚數(shù)503枚、只均沖胚數(shù)11.43枚±0.79枚，可用胚數(shù)394枚、只均可用胚數(shù)8.95枚±0.95枚；同樣的方法用FSH+PG+PMSG處理供體45只，沖胚數(shù)608枚、只均沖胚數(shù)13.51枚±1.04枚，可用胚數(shù)435枚、只均可用胚數(shù)9.67枚±1.06枚，差異均極顯著（P< 0.01）；對39只供體羊分別采用開膣器輸精+自然交配+開膣器輸精和自然本交方法配種，重復(fù)超排跟蹤統(tǒng)計，重復(fù)超排和不同授精方式?jīng)_胚數(shù)無明顯差異（P>0.05）；選用自然發(fā)情與人工誘情法處理，自然發(fā)情組可用胚胎數(shù)289枚，誘情組可用胚胎數(shù)221枚，兩者差異極顯著（P<0.01）；供體羊在不同營養(yǎng)狀態(tài)下超排處理，營養(yǎng)良好者與營養(yǎng)中等者只均回收胚胎數(shù)分別為14.4枚和8.52枚，只均可用胚胎平均數(shù)分別為7.0枚和5.25枚，差異也極顯著（P<0.01）。該研究優(yōu)化了綿羊超排方法和配種授精方案，初步建立了高效胚胎移植體系。

優(yōu)質(zhì)肉羊；超數(shù)排卵；胚胎移植

羊胚胎移植也叫“借腹懷胎”，就是將1只良種母羊經(jīng)配種后的早期胚胎取出，或者由體外受精及其他方式獲得的胚胎，移植到另一只生理狀態(tài)相同的母羊體內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成為新個體的過程。通過胚胎移植技術(shù)的實施既可以充分發(fā)揮良種羊的遺傳性能，又可在短時間內(nèi)獲得一定數(shù)量的純種群。本試驗在新疆哈密市牧祥合作社和伊吾縣北牧種羊場進行，在同一飼養(yǎng)管理條件下，針對種羊場優(yōu)質(zhì)肉羊按不同處理方式、不同營養(yǎng)狀態(tài)、重復(fù)利用實施超數(shù)排卵處理；通過開膣器輸精與自然交配，篩選出適合生產(chǎn)推廣使用的配種方式。通過誘導(dǎo)發(fā)情、超數(shù)排卵、胚胎鑒定、胚胎移植技術(shù)等的系統(tǒng)應(yīng)用，優(yōu)化肉羊超排方案，有效降低生產(chǎn)成本，提高胚胎移植效率，以期總結(jié)出適合本地區(qū)推廣應(yīng)用的肉羊超排方案與胚胎移植技術(shù)的操作規(guī)程，為推動本地區(qū)胚胎移植技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 羊只

試驗于2015年10—12月、2016年10月—2017年 1月選用哈密市牧祥合作社的體重90～100 kg，體況良好、無繁殖疾病，1～3歲的良種薩?？四秆蜃龉w；受體羊為湖羊母羊，年齡1～3歲，體重40～50 kg以上，膘情良好、無繁殖疾病。杜泊羊選用伊吾縣北牧種羊場良種肉羊（做供體羊）。試驗前期補飼，確保體況中等以上；采精種公羊為種羊場純種肉羊，性欲良好，精液品質(zhì)優(yōu)良。試情公羊為性欲旺盛的成年湖羊。按程序做好飼喂、飲水、運動、試情等工作。

1.2 設(shè)備

專用胚胎移植手術(shù)架，內(nèi)窺鏡，B超儀，子宮鉗，體視顯微鏡，水浴鍋，恒溫臺，注射器（1 mL、2.5 mL、5 mL、20 mL、50 mL），沖卵管，三通管，檢卵（胚）針，移植管，培養(yǎng)皿，曲別針，小彎縫合針，12號縫合線，10號縫合線，剃毛刀，剪毛剪，電暖器。

1.3 藥品與試劑

沖卵液（PBS）由中國農(nóng)科院研制生產(chǎn)，保存液（holding solution）新西蘭生產(chǎn)；前列醇鈉、FSH、LHRH-A3、孕馬血清促性腺激素（PMSG）均為寧波三生激素制品廠生產(chǎn)；靜松靈注射液，利多卡因注射液，黃體酮注射液，160萬IU青霉素，100萬IU鏈霉素，100 mL替硝唑注射液，75%酒精，2%碘酒，新潔爾滅，0.9%生理鹽水，克林霉素，等等。

1.4 供體羊超排處理和配種

1.4.1 超排處理方式 方法一：對供體羊采用自然觀察法，用試情公羊試情一個情期，選出有自然發(fā)情周期的母羊全群注射PG，每只1 mL，在24～72 h內(nèi)每天試情2次，做好發(fā)情記錄，按照發(fā)情先后順序編號、分組、編制程序，在母羊情期10～11 d采用FSH+PMSG+PG或FSH+ PG遞減4 d 8針注射法進行超排處理，F(xiàn)SH+PMSG+PG法同一程序第5針同時注射PMSG+FSH，PMSG注射劑量每只200 IU，第6針注射PG，撤栓，逐量遞減，F(xiàn)SH劑量參照羅生金等［1］進行，12 h后開始用公羊試情，間隔6～12 h再試情1次，直至不接受交配為止，并在第2次配種后，每只羊注射LHRH－A3（寧波）25 mg。方法二：采用CIDR法，可在供體羊發(fā)情周期內(nèi)任意一天陰道放入CIDR，此后第10天開始注射FSH，每隔12小時注射1次，第6針注射FSH+PG 1 mL，撤栓，劑量遞減。其余部分與方法一相同。

1.4.2 配種輸精方式 根據(jù)種羊場種公羊質(zhì)量和數(shù)量，采用授精方式一：開膣器輸精+自然交配+開膣器輸精；方式二：發(fā)情后12 h自然交配一次+發(fā)情后24 h再自然交配1次，也即母羊發(fā)情后12 h和24 h各自然交配一次。1.4.3 試驗分組 本試驗分不同超排處理方案、重復(fù)利用、不同授精方式、營養(yǎng)條件因素對供體綿羊超排效果的影響進行對比試驗，為減小誤差，每組因素的試驗都在同一條件下進行。

1.4.4 胚胎質(zhì)量鑒定 配種后第5.5～6.6天手術(shù)法從子宮角沖卵，在20～40倍體視顯微鏡下根據(jù)受精卵的形態(tài)、色澤、卵裂球的大小和數(shù)量、均勻度、細(xì)胞的密度等確定受精情況以及胚胎發(fā)育階段。

1.4.5 受體羊處理和移植 受體羊與供體羊同步試情處理，采用兩次PG法，第1次與第2次間隔11 d，受體羊與供體羊同期時間相差不得超過12 h，采用腹部手術(shù)法處理受體羊，腹腔內(nèi)窺鏡觀察，單側(cè)卵巢1～3個黃體則移植1～2枚桑葚胚或囊胚。左右創(chuàng)口各縫1針后，解除保定。

1.4.6 供受體羊術(shù)后處理 供受體羊術(shù)后置于小圈內(nèi)隔離觀察1～2 d，圈舍應(yīng)保持清潔干燥，有利于術(shù)后恢復(fù)。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel進行數(shù)據(jù)收集，使用SPSS 18.0軟件對超排供體羊可用胚胎數(shù)、回收胚胎數(shù)分別進行t檢驗和χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超排方案對超排效果的影響

采用4 d 8針FSH遞減+PG與FSH遞減+PMSG+PG不同組合注射方式的2個方案進行超排（見表1）。授精方式采用方式一。結(jié)果顯示：前者供體羊只均沖卵數(shù)11.43枚±0.79枚、只均可用胚數(shù)8.95枚±0.95枚，后者供體羊只均沖卵數(shù)13.51枚±1.04枚、只均可用胚數(shù)9.67枚±1.06枚，兩者差異均極顯著（P＜0.01），且后者比前者獲得較多的受精卵，取得了滿意效果。

表1 不同超排方案供體羊胚胎數(shù)量比較

2.2 重復(fù)超排對超排效果的影響

由表2可知，對牧祥合作社兩年39只薩福克羊（供體羊）跟蹤統(tǒng)計顯示：第1次沖胚數(shù)510枚、只均沖胚數(shù) 13.26枚±1.58枚，可用胚胎數(shù) 416枚、只均可用胚胎數(shù) 10.67枚±1.48枚；第 2次沖胚數(shù) 507枚、只均沖胚數(shù) 13.00枚±0.91枚，可用胚胎數(shù) 372枚、只均可用胚胎數(shù)9.54枚±0.86枚，重復(fù)超排和不同授精方式?jīng)_胚數(shù)無明顯差異（P＞0.05）；但供體羊隨著年齡的增加、沖胚次數(shù)的增多，可用胚胎數(shù)減少，可能是沖胚造成粘連，部分供體羊子宮內(nèi)環(huán)境紊亂，有的次年沒有產(chǎn)羔。為提高羊只的重復(fù)利用率，2017年筆者做供體羊沖胚手術(shù)，避開血管，子宮內(nèi)灌注克林霉素注射液，自動止血后再還納入腹腔原位。供體羊粘連數(shù)量是否減少，還有待于進一步驗證。

表2 不同沖胚次數(shù)供體羊胚胎數(shù)量比較

2.3 不同發(fā)情狀態(tài)對超排效果的影響

如表3所示，供體羊自然發(fā)情法只均沖胚數(shù)14.65枚±1.42枚，可用胚胎數(shù)289枚，只均可用胚胎數(shù)11.12枚±1.35枚；而PG誘情法只均沖胚數(shù)12.00枚±1.18枚，可用胚胎數(shù)221枚，只均可用胚胎數(shù)8.50枚±1.27枚，兩者間均差異極顯著（P＜0.01）。

表3 不同發(fā)情狀態(tài)供體羊胚胎數(shù)量比較

2.4 不同營養(yǎng)狀態(tài)對超排的影響

2016年12 月在伊吾縣北牧種羊場，筆者將杜泊母羊分為兩組，粗飼料自由采食，一組45只，每只羊每日飼喂精飼料0.8 kg，飼喂20 d；另一組28只，每只羊每日飼喂精飼料1.2 kg，飼喂40 d。任意一天隨機對空懷供體羊埋栓CIDR（寧波三生激素制品廠生產(chǎn)），采用4 d 8針 FSH遞減+PMSG注射法。不同營養(yǎng)狀態(tài)供體羊胚胎數(shù)相比較，營養(yǎng)良好的羊只超排回收胚胎數(shù)、只均可用胚胎數(shù)與營養(yǎng)中等羊只間差異均極顯著（P<0.01）。通過試驗看出，配種前較長時間短期優(yōu)飼，會得到較高的排卵數(shù)和較好的胚胎質(zhì)量?？梢娫诹己玫臓I養(yǎng)條件下，供體羊獲得良好的體況，可保證正常的繁殖機能［2-3］。

表4 不同營養(yǎng)狀態(tài)供體羊胚胎數(shù)量比較

3 討論

（1）卵的成熟和排卵是兩個相關(guān)又相互獨立的生理現(xiàn)象，用藥物促使多個卵泡的成熟并同時排卵，可能使某些卵子并未發(fā)育成熟而排出，這種卵子或者沒受精，或者停止在胚胎的早期階段。本試驗采用FSH+PG遞減與FSH+PMSG+PG遞減4 d 8針注射法（PMSG第5針單獨注射）相比較，F(xiàn)SH+PMSG+PG遞減方案超排效果優(yōu)于FSH+PG方案，增加PMSG注射更有利于卵泡的發(fā)育，同時有一定的促排卵和黃體形成的功能，該方案可為大規(guī)模胚胎移植提供參考。

（2）良好的種質(zhì)資源應(yīng)得到高效利用。本研究對39只黑薩福克羊間隔12個月（超排采胚后自然配種，產(chǎn)羔后再進行第2次超排采胚）再次超排，延長了超排處理的時間間隔，使（子宮）卵巢有充足的恢復(fù)時間，采胚成功率、平均可用胚數(shù)無顯著差異（P>0.05）。重復(fù)超排可有效降低成本、提高優(yōu)質(zhì)種羊的利用率。

（3）對同一種羊重復(fù)超排，采用開膣器輸精+自然交配+開膣器輸精和本交的方法，兩者間差異不顯著（P> 0.05）。在今后的工作中，種公羊數(shù)量多時可采用自然本交方式，種公羊少的種羊場可采用開膣器輸精+自然交配+開膣器輸精的方式進行配種。在移植前必須按照胚胎移植整體時間計劃來安排，供體羊的營養(yǎng)水平必須在做超排和手術(shù)時提高，即胚胎移植前40～60 d提高供體羊營養(yǎng)水平特別關(guān)鍵，此結(jié)果與馬保華等［4］報道相一致。實踐證明，上等膘情的供體母羊超排效果極顯著好于膘情較差的供體母羊（P<0.01）。

（4）筆者通過2個情期篩選，按照自然發(fā)情周期供體羊超排處理的采卵平均數(shù)、可用胚胎平均數(shù)均高于PG誘情組。究其原因在于自然發(fā)情有正常的發(fā)情周期，卵巢發(fā)育良好，大小適中，排卵點均勻，卵巢上大卵泡較少，胚胎回收數(shù)量與排卵點數(shù)吻合。而PG誘情組通過激素調(diào)節(jié)，部分羊只超排效果不明顯，卵泡發(fā)育不成熟或不能正常排卵，以致對采胚數(shù)和可用胚數(shù)產(chǎn)生影響。自然發(fā)情周期超排處理供體羊組沖胚數(shù)和可用胚數(shù)與PG誘情組間差異極顯著（P<0.01），此結(jié)果與梁坤等［5］報道不一致。陰道栓法超數(shù)排卵完全可以替代自然同期發(fā)情法超數(shù)排卵，雖然在可用胚胎率上差異極顯著（P<0.01），但在可用胚胎數(shù)上沒有顯著性差異（P>0.05）。在供體種羊數(shù)量大的養(yǎng)殖場，最好采用自然發(fā)情法來超排處理供體羊。

［1］ 羅生金，張磊，尼亞孜，等.薩?？搜虺盘幚砼c胚胎移植技術(shù)應(yīng)用研究［J］.中國草食動物科學(xué)，2016，36（2）：26-28.

［2］ 羅生金，尼亞孜.杜泊綿羊胚胎移植技術(shù)在哈密地區(qū)應(yīng)用效果觀察［J］.黑龍江動物繁殖，2015（5）：12-14.

［3］ 張春香，任有蛇，岳文斌.營養(yǎng)對母羊繁殖性能影響研究［J］.中國草食動物科學(xué)，2010，30（6）：62-64.

［4］ 馬保華，李鍵.羊生產(chǎn)性胚胎移植的組織與技術(shù)程序［J］.草食家畜，2001（S2）：112-118.

［5］ 梁坤，王宏寶，俞守緒，等.兩種不同超數(shù)排卵方法的效果分析［J］.黑龍江動物繁殖，2007，15（5）：20-21.

S826.2

A

2095-3887（2017）03-0015-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.005

2017-03-16

哈密地區(qū)科技興農(nóng)項目［哈地黨農(nóng)字（2015）6號］

羅生金(1973-)，男，高級獸醫(yī)師、執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，從事畜牧業(yè)科技推廣和動物疫病診療工作。