黃子成，陳清，翁曉源，楊振榮，陳惠忠，周永建

（1.福建醫(yī)科大學附屬泉州市第一醫(yī)院消化內科，福建泉州362200；2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州350001；3.惠安縣醫(yī)院普通外科，福建惠安362100）

Pin1與CyclinD1在胃腸間質瘤中的表達及臨床意義

黃子成1，陳清2，翁曉源2，楊振榮2，陳惠忠3，周永建2

（1.福建醫(yī)科大學附屬泉州市第一醫(yī)院消化內科，福建泉州362200；2.福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州350001；3.惠安縣醫(yī)院普通外科，福建惠安362100）

目的檢測Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA在胃腸間質瘤（GIST）中的表達情況，探討二者與GIST臨床病理特征的相關性。方法分別采用免疫組化法和實時熒光定量PCR法檢測Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中的表達情況。結果Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表達率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］高于癌旁組織［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］；Pin1和CyclinD1mRNA在GIST組織中的表達量為癌旁組織中的7.03倍和5.53倍。Pin1蛋白及mRNA的表達與患者的臨床病理參數(shù)無明顯相關性，與GIST的NIH分級和腫瘤直徑大小有關（均P＜0.05）。GIST組織中Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA的表達呈正相關。結論Pin1與CyclinD1蛋白和mRNA在GIST中表達增加，且二者的表達呈正相關，提示二者在GIST的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

胃腸間質瘤；Pin1；CyclinD1；免疫組化；實時熒光定量PCR

胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道中最為常見的間葉源性腫瘤，其發(fā)病機制與突變有關。肽基脯氨酰順反異構酶1（peptidylprolyl cis/trans isomerase，NIMA-interacting 1，Pin1）是一種特異的肽基脯氨酰異構酶。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）基因是一種原癌基因，可調節(jié)細胞周期進行有絲分裂和增殖。CyclinD1是Pin1重要的靶基因之一。二者在GIST中的表達情況及臨床意義尚未明確。本研究通過免疫組化法和實時熒光定量PCR技術分別從蛋白和mRNA水平研究GIST中Pin1和CyclinD1蛋白及mRNA表達情況及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2007年至2014年在福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院行手術切除的GIST的腫瘤組織及癌旁組織石蠟包埋標本85例。研究對象均符合GIST的診斷標準，且經病理證實為原發(fā)性GIST；患者術前均未行放療或化療等輔助治療；且均無合并其他惡性腫瘤。冰凍組織標本均為手術中取得，放置于-80℃液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：采用ElivisionTMplus免疫組織化學法。Pin1抗體（sc-15340）購自美國Santa Cruz公司，工作濃度為1∶200；即用型CyclinD1抗體購自北京中杉金橋試劑公司；ElivisionTMplus二抗（KIT-9901）購自福州邁新生物技術公司。結果判斷采用Fromowitz的陽性細胞半定量分級法，每個切片隨機觀察5個高倍視野（×400），先根據(jù)陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比計分，≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；再根據(jù)陽性細胞染色強度的深淺計分，不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，最后將二者分數(shù)相加，≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.2.2 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用SYBR GreenⅠ熒光染料法及相對定量的檢測方法，以βactin作為參照基因。UltraSYBR Mixture（With high ROX）購自福州貝爾曼公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司；RNAiso plus購自日本TaKaRa公司。qRT-PCR的Pin1及CyclinD1引物序列設計參照GenBank中撿索到的Pin1基因序列（NM_006221.2）和CyclinD1基因序列（NM_ 053056.2），用Primer3.0設計引物，引物序列見表1；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。qRT-PCR的結果判斷采用2-△△CT（Livak）法行相對基因表達分析。目的基因和參照基因的擴增效率均接近1.95，計算公式為1.95-△△CT。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer pairs used for qRT-PCR analysis

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行檢驗，用Spearman等級相關分析Pin1及CyclinD1表達的相關性。計量資料用x±s表示，采用配對樣本t檢驗或兩獨立樣本t檢驗進行比較，采用雙變量相關性分析Pin1與CyclinD1表達的相關性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

Pin1蛋白和CyclinD1在GIST組織及癌旁組織中的表達定位于細胞質及細胞核中。Pin1和CyclinD1蛋白在GIST中的表達率［64.7%（55/85），42.3%（36/85）］明顯高于癌旁組織［26.7%（4/15），6.7%（1/15）］（P＜0.05）。

Pin1蛋白的表達與患者的性別、年齡、核分裂象、NIH分級、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、組織學類型、遠處轉移均無明顯相關性（P＞0.05）（表2）。CyclinD1蛋白表達與NIH分級和腫瘤直徑大小有關（P＜0.05），與患者的性別、年齡、核分裂象、腫瘤位置、組織學類型及遠處轉移無明顯相關性（P＞0.05）（表3）。

85例GIST組織中Pin1與CyclinD1蛋白均陽性表達者29例，均陰性表達者23例。Spearman等級相關分析結果表明GIST中Pin1蛋白與CyclinD1蛋白的表達呈正相關（r=0.284，P＜0.01）。

2.2 qRT-PCR結果分析

表2 Pin1蛋白表達與GIST臨床病理參數(shù)的關系Tab.2 Relationship between Pin1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

GIST組織和癌旁組織中，Pin1的△CT值分別為6.02±1.13和8.94±1.56，CyclinD1分別為5.62±6.93和8.18±2.00，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2-△△CT（Livak）法公式計算結果顯示，Pin1和CyclinD1 mRNA在GIST組織中的表達量為癌旁組織中的7.03倍和5.53倍。Pin1mRNA的表達與患者的性別、年齡、核分裂象、NIH分級、腫瘤直徑大小、腫瘤位置、組織學類型及遠處轉移均無明顯相關性（P＞0.05）；CyclinD1mRNA的表達與NIH分級、腫瘤直徑大小有關，與患者的性別、年齡、核分裂象、腫瘤位置、組織學類型及遠處轉移無明顯相關性（P＞0.05）（表4）。

使用雙變量相關性分析對GIST組織中Pin1與CyclinD1表達（△CT值）的相關性進行分析，結果顯示，Pin1mRNA與CyclinD1mRNA的表達呈正相關（r=0.337，P＜0.05）（圖1）。

3 討論

GIST的發(fā)病機制被認為與C-Kit原癌基因及PDGFR基因的突變有關，CD117和CD34的陽性表達為目前診斷GIST的重要指標。近年來分子靶向藥物及手術的聯(lián)合應用明顯改善了GIST的治療效果，但仍然有26%的患者在術后5年內復發(fā)［1］，因此對GIST的發(fā)病機制及生物學行為的進一步研究十分必要。

Pin1基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的在酵母和人類細胞的有絲分裂中所必需的肽基脯氨酰順反異構酶［2］。Pin1蛋白可特異地催化磷酸化后的絲/蘇-脯氨酸間肽鍵發(fā)生順反異構，從而誘導蛋白質構象及功能發(fā)生改變。JAMIYANDORJ等［3］通過研究2 041個人類腫瘤樣本和609個正常組織的樣本發(fā)現(xiàn)：Pin1在60種不同腫瘤中的38種中呈高表達，這些腫瘤包含了大部分常見的腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌等。CyclinD1基因是一種致癌基因，對細胞周期的調控起重要作用。研究［4］表明CyclinD1在多種腫瘤組織中過度表達。有研究［5］發(fā)現(xiàn)約51%的GIST患者CyclinD1過表達，且表達水平與預后相關。CyclinD1是Pin1的重要靶基因之一。Pin1可通過多種途徑使CyclinD1表達增加，包括通過Ras/Neu-Jun信號轉導通路、wnt/β-catenin信號轉導通路和NF-κB信號轉導通路誘導CyclinD1轉錄的增加［6-7］，通過直接結合CyclinD1減少其分解，增加CyclinD1的穩(wěn)定性及其在核內的聚積，從而調節(jié)細胞周期［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，肺癌和前列腺癌中，Pin1與 CyclinD1的表達呈正相關。在敲除Pin1基因的小鼠體內CyclinD1呈低表達，其表型與敲除CyclinD1的小鼠相似［10］。

表3 CyclinD1蛋白表達與GIST臨床病理參數(shù)的關系Tab.3 Relationship between CyclinD1 protein expression and clinicopathological parameters of GIST

本研究結果顯示，Pin1與CyclinD1蛋白及mRNA在GIST中過表達，提示Pin1與CyclinD1過表達所導致的細胞增殖異?？赡茉贕IST的發(fā)病機制中起重要作用。CyclinD1的表達與GIST的NIH分級及腫瘤大小相關，且隨腫瘤惡性程度和腫瘤直徑的增加而增強，這與相關文獻［5，11］報道符合，提示CyclinD1不僅參與了GIST的發(fā)生，可能還與GIST的惡性轉變和腫瘤生長相關。Pin1與CyclinD1蛋白及mRNA表達呈正相關，提示Pin1可能通過多種途徑調節(jié)CyclinD1的表達，二者相互協(xié)同，對GIST的發(fā)生發(fā)展產生影響。

表4 Pin1和CyclinD1 mRNA表達與GIST臨床病理參數(shù)的關系Tab.4 Relationship between expressions of Pin1 and CyclinD1 mRNA and clinicopathological parameters of GIST

圖1 40例GIST患者的CyclinD1△CT與Pin1△CT的散點圖Fig.1 Scatter map of CyclinD1△CT and Pin1△CT in 40 patients with GIST

腫瘤的發(fā)生發(fā)展由多種因素共同作用，本研究結果表明，Pin1及CyclinD1在GIST的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來的大量研究證明，控制Pin1表達及其功能可作為治療腫瘤的一個新途徑，如通過RNA干擾抑制Pin1的表達可以影響前列腺癌細胞的增殖速度，降低其轉移能力，并可抑制其致瘤性［12］。CyclinD1表達的檢測可能成為預測GIST生物學行為的重要參考指標。

［1］BISCHOF DA，KIM Y，DODSON R，et al.Conditional disease-free survival after surgical resection of gastrointestinal stromal tumors：a multi-institutional analysis of 502 patients［J］.JAMA Surg，2015，150（4）：299-306.DOI：10.1001/jamasurg.2014.2881.

［2］ATABAY KD，YILDIZ MT，AVSAR T，et al.Knockdown of Pin1 leads to reduced angiogenic potential and tumorigenicity in glioblastoma cells［J］.Oncol Lett，2015，10（4）：2385-2389.DOI：10.3892/ ol.2015.3512.

［3］JAMIYANDORJ U，BAE JS，NOH SJ，et al.Expression of peptidylprolyl isomerase PIN1 and its role in the pathogenesis of extrahepatic cholangiocarcinoma［J］.Oncol Lett，2013，6（5）：1421.DOI：10.3892/ol.2013.1525.

［4］劉換新，白義鳳，吳曉霞，等.非小細胞肺癌組織PCDH9和cyclin D1表達及其臨床意義分析［J］.中華腫瘤防治雜志，2014，21（19）：1508-1512.DOI：10，3969/j.issn.1538-5879，2014，19，238.

［5］朱玉娟，陶永敏，蔣文初，等.胃腸間質瘤中cyclinD1和Ki67蛋白的表達及其病理意義［J］.現(xiàn)代醫(yī)學，2014（11）：1293-1296. DOI：10，3969/j.issn.1671-7562，2014，11，010.

［6］SCHNEIDER S，THURNHER D.The prognostic significance of βcatenin，cyclin D1 and PIN1 in minor salivary gland carcinoma：βcatenin predicts overall survival［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2016，273（5）：1283-1292.DOI：10.1007/s00405-015-3609-6.

［8］LILL C，SCHNEIDER S，SEEMANN R，et al.Correlation of βcatenin，but not PIN1 and cyclin D1，overexpression with diseasefree and overall survival in patients with cancer of the parotid gland［J］.Head Neck，2015，37（1）：30-36.DOI：10.1002/hed.23546.

［7］LU Z，HUNTER T.Prolyl isomerase Pin1 in cancer［J］.Cell Res，2014，24（9）：1033.DOI：10.1038/cr.2014.109.

［8］RYO A，SUIZU F，YOSHIDA Y，et al.Regulation of NF-kappa B signaling by Pin1-dependent prolyl isomerization and ubiquitin-mediated proteolysis of p65/RelA［J］.Mol Cell，2003，12（6）：1413-1426.DOI：10.1016/S1097-2765（03）00490-8.

［9］KIM M，CHOI H，CHO KB，et al.Involvement of Pin1 induction in epithelial-mesenchymal transition of tamoxifen-resistant breast cancer cells［J］.Cancer Sci，2009，100（10）：1834.DOI：10.1111/ j.1349-7006.2009.01260.x.

［10］鄭東林，陳遠能，曹驥，等.Pin1和Cyclin D1在原發(fā)性肝癌中的表達及意義［J］.廣西醫(yī)科大學學報，2010，27（3）：424-426. DOI：10.3969/j.issn.1005-930X.2010.03.035.

［11］務森，張謝夫，趙春臨，等.胃腸道間質瘤組織中Ki-67、Cyclin D1、ICAM-1、Livin及MMP-9蛋白表達與危險度分級［J］.鄭州大學學報（醫(yī)學版），2011，46（6）：895-897.DOI：10.3969/j. issn.1671-6825.2011.06.025.

［12］JIN J，ZHANG Y，LI Y，et al.RNA-interference-mediated downregulation of Pin1 suppresses tumorigenicity of malignant melanoma A375 cells.［J］.Neoplasma，2013，60（1）：92-100.DOI：10.4149/ neo_2013_013.

（編輯 王又冬）

Expression and Clinical Significance of Pin1 and CyclinD1 in Gastrointestinal Stromal Tumor

HUANG Zicheng1，CHEN Qing2，WENG Xiaoyuan2，YANG Zhenrong2，CHEN Huizhong3，ZHOU Yongjian2
（1.Department of Gastroenterology，Quanzhou First Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362200，China；2.Department of Gastric Surgery，Union Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China；3.Department of General Surgery，Hui’an Hospital，Hui’an 362100，China）

Objective To investigate the relationship between Pin1 and CyclinD1 expression and the development of gastrointestinal stromal tumor（GIST）.MethodsThe protein and mRNA expression of Pin1 and CyclinD1 in 85 samples of GIST and adjacent non-cancerous tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction.ResultsThe expression rate of Pin1 protein in GIST tissues（64.7%；55/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（26.7%；4/15）.Similarly，the expression rate of CyclinD1 protein in GIST tissues（42.3%；36/85）was higher than that in adjacent non-cancerous tissues（6.7%；1/15）.The expression ofPin1andCyclinD1mRNA in GIST tissues was 7.03 and 5.53 times that in adjacent non-cancerous tissues，respectively.There was no obvious correlation between the expression of Pin1 and clinicopathological parameters.The expression of CyclinD1 was positively correlated with the grade of NIH and tumor diameter（P＜0.05）.There was a significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues.ConclusionThe expression of both Pin1 and CyclinD1 was up-regulated in GIST tissues.The significant correlation between the expression of Pin1 and CyclinD1 in GIST tissues suggests that their synergistic effect promotes carcinogenesis and the development of GIST.

gastrointestinal stromal tumor；Pin1；CyclinD1；immunohistochemistry；real-time quantitative polymerase chain reaction

R735.2

A

0258-4646（2017）06-0495-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.004

國家自然科學基金（81172380）；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)學術技術帶頭人后備人基金（010114201）；國家臨床重點?？平ㄔO基金［衛(wèi)辦醫(yī)政函（2012）649號］

黃子成（1969-），男，副主任醫(yī)師，本科.

周永建，E-mail：zyjbju@sina.com

2016-10-25

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