周登攀，郝小軍，向本春

(石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

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新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病害調(diào)查及病原檢測

周登攀，郝小軍，向本春

(石河子大學農(nóng)學院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

【目的】研究新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病的發(fā)生情況，明確病毒種類及帶毒率。【方法】對新疆石河子設(shè)施櫻桃病毒病害進行調(diào)查，利用已報道在櫻桃上發(fā)生的8種病毒特異性引物，對122個設(shè)施櫻桃疑似病毒病樣品進行RT-PCR檢測及序列同源性分析?！窘Y(jié)果】石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病田間癥狀主要表現(xiàn)有花葉、卷葉、褪綠黃化、畸形、皺縮等。在樣品中擴增出與櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus, PNRSV)、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus,PDV)和櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)預期大小一致的目的片段；序列分析表明4種病毒擴增片段與GenBank中注冊的相應病毒核苷酸和氨基酸序列均具有較高的同源性； 其中分離物CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ和CGRMV-SHZ與GenBank中已報道的分離物ChTA12(KT310083.1)、DJ1-1(JF333586.1)、HSY4-1(HQ539657.1)、ZZ-Ch-13(KC965106.1)對核苷酸同源性分別為99.5%、99.5%、99.0%和99.4%。CVA、PNRSV、PDV和CGRMV的檢出率分別為67.3%、61.1%、6.5%、4.9%，受兩種及兩種以上病毒復合侵染檢出率56.5%。【結(jié)論】新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病原以CVA和PNRSV為主，且兩種病毒復合侵染較為普遍。這是在新疆設(shè)施櫻桃上檢測到CVA、PNRSV、PDV、CGRMV4種病毒。

設(shè)施櫻桃；病毒；分子檢測；復合侵染

0 引 言

【研究意義】隨著新疆種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和特色林果業(yè)的快速發(fā)展，櫻桃在新疆各地區(qū)引種栽培面積逐年增加，目前在吐魯番、哈密、阿克蘇、喀什、烏魯木齊、石河子、克拉瑪依、伊犁等南北疆地區(qū)均有栽培[1]。隨著櫻桃栽培規(guī)模不斷擴大，病毒病日益加重，已成為制約櫻桃種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展和櫻桃產(chǎn)量及品質(zhì)的主要因素[2]。建立快速有效的檢測方法，對控制櫻桃病毒病的傳播和指導新疆各地區(qū)櫻桃病毒病的防控提供科學依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】侵染櫻桃的病毒達30多種，常見主要有20種[3,4]。我國已報道的侵染櫻桃的病毒有12種，包括蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus，ApMV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecroticringspotvirus,PNRSV、李矮縮病毒(Prunedwarfvirus,PDV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)、櫻桃銼葉病毒(Cherryraspleafvirus,CRLV)、櫻桃病毒A(CherryvirusA,CVA)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottlevirus,CGRMV)、李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒(Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV)，櫻桃小果病毒-2(Littlecherryvirus-2,LChV-2)、櫻桃壞死銹狀斑駁病毒(Cherrynecroticrustymottlevirus,CNRMV)及櫻桃小果病毒-1(Littlecherryvirus-1,LChV-1)[5-11]。1996 年，Zhou 等[5]首次報道我國甜櫻桃病毒病的發(fā)生；同年李青等[12]利用ELISA法對北京地區(qū)的櫻桃上PNRSV 的發(fā)生情況進行了檢測；1998年，阮小鳳等[13]對陜西櫻桃上的病毒病也進行了檢測；2009 年在云南也發(fā)現(xiàn)了甜櫻桃病毒病的的報道[6]；2010至2015年，王文文、盧美光、劉聰利等[14-16]先后對遼寧、山東、北京以及河南等地的櫻桃病毒病進行調(diào)查，發(fā)生較為普遍、檢出率最高的櫻桃病毒病主要為PNRSV、CVA以及PDV。【本研究切入點】新疆的設(shè)施櫻桃種植面積不斷擴大，而櫻桃苗木多為內(nèi)地引進，隨著甜櫻桃苗木引種和調(diào)運，新病毒病也有隨著苗木傳入新疆的潛在風險；加之栽培管理方式的及檢疫措施的不完善等因素，櫻桃病毒病害發(fā)生日趨嚴重。目前，關(guān)于新疆櫻桃病毒病原的檢測未見報道。針對新疆石河子地區(qū)周邊團場設(shè)施櫻桃病毒病進行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究觀察設(shè)施櫻桃病毒病田間癥狀并通過RT-PCR方法對設(shè)施櫻桃發(fā)病情況進行檢測，鑒定病原種類，調(diào)查復合侵染情況，為當?shù)卦O(shè)施櫻桃病毒病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年4～9月，以每株樹作為1份樣本，每株采集3～5片病葉，分別采集兵團第八師134團40份，136團25份，150團16份，葡萄研究所13份，141團11份和第七師129團18份，共采集櫻桃葉片病樣122份。分別裝在不同的采集袋中，編號記錄癥狀并拍照，實驗室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 引物合成

用于檢測的8種病毒的相關(guān)引物設(shè)計參考國內(nèi)外已報道文獻和實驗室設(shè)計。表1

表1 RT-PCR法擴增病毒基因組特異性片段的引物

Table 1 Primers for amplification segments of virus genomes by RT-PCR

引物名稱Primers引物序列(5’→3’)Sequence(5’-3’)產(chǎn)物/ntProducts參考文獻ReferencesCVA-FATGCTTCGCAGGTGACGATACVA-RGCTTGTTTGTGGAGGGAGAC652[17]PDV-FCGAAGTCTATTTCCGAGTGGPDV-RCCACTGGCTTGTTTCGCTGT304[17]CGRMV-FTGCGGGAAATCAACTCTTGTCCGRMV-RTGTGCCACCAAACACCTTAC363[15]PNRSV-FAACTGCAGATGGTTTGCCGAATTTGCAAPNRSV-RGCTCTAGACTAGATCTCAAGCAGGTC675[18]CRLV-FTGACTTTCCCAAGGATGAGACRLV-RGTGACATACCATAGATCC447[19]ACLSV-FTCTGCAAGAGAATTTCTGTTACLSV-RGTCTACAGGCTATTTATTATAAG800[15]CMV-FTATGATAAGAAGCTTGTTTCGCGCMV-RGCCGTAAGCTGGATGGACAA486本實驗室CNRMV-FCTGACCCAGACTGGGAGGTCNRMV-RTTGGCGCACATGTCATCACC553[18]

1.2.2 主要試劑

RNA提取試劑購自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司； dNTPs、TaqPCR Mix 、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等，均購自北京康為世紀生物科技有限公司；2 000 bp DNA Marker購自全式金生物；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。PCR引物由北京華大科技有限公司合成。大腸桿菌DH5α菌株為實驗室保存。

1.2.3 植物組織總RNA的提取

植物組織總RNA提取步驟參照吳慶豐等[20]的方法。

1.2.4 RT-PCR反應

cDNA第一鏈的合成：以5 μL總RNA為模板，1 μL oligo(dT)18為引物，1 μL隨機六聚體引物，6 μL無核酸酶的高純水輕輕混勻，短暫離心，65℃孵育5 min，冰上冷卻2 min，離心后加4 μL 的5×第一鏈反應緩沖液，1 μL RiboLockTM RNA酶抑制劑，2 μL 10 mM dNTPs Mix，Revert AidTM M-MnLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混勻，離心，42℃孵育60 min，70℃加熱5 min終止反應，-60℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應：以合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR。25 μL反應體系：cDNA 3 μL，上游引物(10 μM)1 μL，下游引物(10 μM)1 μL，TaqPCR Mix 12.5 μL，加ddH2O至終體積為25 μL。PCR擴增條件為94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火30 s，溫度根據(jù)引物設(shè)定；72℃延伸50 s，35個循環(huán)；后72℃延伸10 min，4℃保存。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。

1.2.5 序列測定及其分析

瓊脂糖凝膠回收目的片段，回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株后，進行藍白斑篩選，通過菌落PCR以及酶切驗證的陽性克隆，送至北京華大基因生物公司進行測序。利用GenBank 數(shù)據(jù)庫中的BLAST 程序?qū)y序結(jié)果進行同源性檢索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，通過DNAStar、MEGA version 5.0 軟件進行相似序列比較分析， 采用鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施櫻桃田間發(fā)病癥狀

研究表明，兵團第八師134團、136團、150團、141團、葡萄研究所和第七師129團的設(shè)施櫻桃病毒病害癥狀表現(xiàn)復雜多樣。且在4至9月，田間癥狀主要表現(xiàn)為花葉、褪綠、皺縮、卷葉、畸形。這些典型癥狀往往相互伴隨其他癥狀。由于有些病毒侵染植物后不表現(xiàn)癥狀，為潛隱性危害，必須通過采樣進行病毒檢測來進一步明確櫻桃病毒病的發(fā)生情況。圖1

A、E：斑駁花葉；B、F：皺縮；C、G：褪綠；D、H：畸形

A.E: Patches Mosaic; B,F: Crinkle; C,G: chlorsis; D,H: deformity

圖1 設(shè)施櫻桃病毒病癥

Fig.1 Symptoms of virus diseases on facilities cherry

2.2 設(shè)施櫻桃病毒種類分子檢測

2.2.1 設(shè)施櫻桃 RT-PCR檢測病毒種類

提取葉片總RNA，以隨機六聚體引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，選取各病毒的特異性檢測引物進行RT-PCR 擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，8種甜櫻桃待檢病毒中，只有4種病毒檢測結(jié)果呈陽性，分別為用CVA特異性引物擴增出650 bp左右的條帶(圖2b)，PNRSV特異性引物擴增到約670 bp的條帶(圖2a)，PDV特異性引物擴增出300 bp左右的條帶(圖2c)，CGRMV特異性引物擴增到約360 bp的條帶(圖2d)。每種病毒特異性引物擴增獲得的片段大小均與預期結(jié)果相同。用其它病毒檢測引物擴增均未獲得與預期片段大小相符的條帶。

為進一步驗證RT-PCR檢測結(jié)果的可靠性，分別對CVA、PNRSV、PDV、CGRMV檢測引物擴增產(chǎn)物進行純化、克隆和測序，并與GenBank中注冊的相關(guān)病毒的核苷酸序列進行對比，結(jié)果表明，4個片段長度分別為652 bp、675 bp、304 bp、363 bp，分別與數(shù)據(jù)庫中CVA、PNRSV、PDV、CGRMV 4種病毒上的部分基因具有高度的同源性。因此，確定檢測結(jié)果為上述4種病毒并將這4個分離物分別鑒定為CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ、CGRMV-SHZ。圖2

a.M:DNA Marker(2 000 bp); 1:陰性對照; 2: PNRSV病樣.b. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:陰性對照; 2: CVA病樣.c. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:陰性對照; 2:為PDV病樣.d. M:DNA Marker(2 000 bp); 1:陰性對照; 2:為CGRM病樣.

a. M: DNA Marker (2,000 bp); 1:Negative control;2: infected of PNRSV sample. b. M: DNA Marker (2,000 bp); 1: Negative control; 2: infected of CVA sample. c. M: DNA Marker (2,000 bp); 1: Negative control;2: infected of PDV sample. d. M: DNA Marker (2,000 bp); 1:Negative control;2: infected of CGRMV sample

圖2 新疆石河子地區(qū)部分設(shè)施櫻桃病毒病原的RT-PCR擴增結(jié)果

Fig.2 RT-PCR amplification result of some facilities cherry virus disease in Shihezi, Xinjiang Province

2.2.2 櫻桃病毒CVA-SHZ分離物與其他分離物同源性

將CVA-SHZ分離物與基因庫中序列比對，核苷酸序列與已報道的CVA分離物序列核苷酸序列同源性在75%～99%。其中與中國山東的ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)分離物核苷酸同源性最高為99.5%；與捷克得到的Rannaja46(KU215411.1)分離物核苷酸同源性最低為75.7%。表2

表2 CVA-SHZ與其它CVA分離物同源性比較

Table 2 Homologous comparion of nucleotide sequences of between CVA-SHZ and other CVA isolates

分離物Isolates登錄號GenbankAccessionNo．寄主Host國家Nation同源性 Homology核苷酸 Nucleotide(%)JLC125634．1PrunuarmeniacaJapan81 7JKFN691959．1PrunsaviumIndia76 3PFHQ267856．1PrunusdomesticaFrance81 3Rannaja46KU215411．1SourcherryCzechRepublic75 7Lambert43KU215410．1CherryCzechRepublic76 2TaianKU131205．1SweetcherrtChina98 6ChTA12KT310083．1PrunusaviumChina99 5ChTA11KT285841．1PrunusaviumChina99 5WKLN879388．1TreeAustralia81 6CVANC003689．1SweetcherryUSA97 7FRGX82547．1SweetcherryFRG97 7

將CVA-SHZ與CVA其他分離物核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，研究表明，CVA-SHZ分離物與中國在甜櫻桃上得到的ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)兩個分離物進化樹關(guān)系最近，在同一個進化分支中。圖3

圖3 基于CVApolyprotein基因部分核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

Fig.3 Phylogenetic tree based onpolyproteingene partial nucleotide sequences of CVA

2.2.3 設(shè)施櫻桃病毒PNRSV-SHZ分離物CP基因與其他分離物同源性

將PNRSV-SHZ分離物與基因庫中序列比對，核苷酸序列與已報道的PNRSV分離物序列核苷酸同源性在91%～99%，氨基酸序列同源性在91%～99%。其中與中國DJ1-1(JF333586.1)分離物核苷酸同源性最高為99.5%，氨基酸同源性為99.3%；與中國在巴旦木上得到的XJC-39(JQ247431.1)分離物核苷酸同源性最低為91.5%，氨基酸同源性為91.4%。表3

用MEGA5.2軟件將櫻桃分離物PNRSV-SHZ與PNRSV其他分離物cp核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。研究表明，PNRSV-SHZ與其他PNRSV分離物構(gòu)建的發(fā)育樹共形成兩大分支，其中PNRSV-SHZ與中國在櫻桃上得到的DJ1-1(JF333586.1)、Beijing (DQ300178.1)、Chr-p(HQ833191.1)分離物，中國在桃子上得到的PchGCS5(KF135196.1)分離物、中國在杏子上得到的AprSX3(KF135204.1)分離物、匈牙利得到的PNRSV-Mk(EU368738.1)、智利在櫻桃李上得到的PlmCl.mrb1(EF565260.1)分離物、捷克斯洛伐克在李子上的得到的GG(AY037788.1)、意大利在巴旦木上得到的AlmIt.cor1(AJ133204.1)分離物在一個進化分支中；但與中國在櫻桃上得到的DJ1-1(JF333586.1)分離進化關(guān)系最近。中國在巴旦木上的到的XJC-12(JQ247429.1)、XJC-47(JQ247432.1)、XJC-35(JQ247430.1)、XJC-39(JQ247431.1)分離物形成另一分支。圖4

表3 PNRSV-SHZ與其它PNRSV分離物核苷酸序列同源性比較

Table 3 Homologous comparison of nucleotide sequences of between PNRSV-SHZ and other PNRSV isolates

分離物Isolates登錄號GenbankAccessionNo．寄主Host國家Nation同源性 Homology(%)核苷酸 Nucleotide氨基酸 AminoDJ1-1JF333586 1RedLampChina99 599 3BeijingDQ300178 1cherryChina99 099 3PlmCl．mrb1EF565260 1MirabolanChile98 597 8Chr-pHQ833191 1cherryChina97 797 1PNRSV-MkEU368738 1PrunusaviumHungary98 598 6PchGCS5KF135196 1peachChina97 297 1AprSX3KF135204 1apricotChina98 298 6GGAY037788 1plumSlovakia97 798 6XJC-12JQ247429 1AlmondChina93 093 5XJC-47JQ247432 1AlmondChina93 291 4XJC-35JQ247430 1AlmondChina92 791 4XJC-39JQ247431 1AlmondChina91 591 4AlmIt．cor1AJ133204 1AlmondItaly98 097 8

圖4 基于PNRSVCP基因核酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

Fig.4 Phylogenetic tree based onCPgene nucleotide sequences of PNRSV

2.2.4 設(shè)施櫻桃病毒PDV-SHZ分離物和CGRMV-SHZ分離物與其他分離物同源性

將PDV-SHZ分離物與基因庫中序列比對，核苷酸序列與已報道的PDV分離物序列核苷酸同源性在90.5%～99.0%。其中與中國分離物HSY4-1(KC965106.1)核苷酸同源性最高為99.0%，與捷克分離物Rannaja 46(KU215404.1)、葡萄牙分離物(AF202117.1)和分離物(AY646848.1)核苷酸同源性最低為90.5%。CGRMV-SHZ分離物與基因庫中序列比對結(jié)果顯示，核苷酸序列與已報道的CGRMV分離物序列核苷酸同源性在91.9%～99.4%，其中與中國分離物ZZ-Ch-13(HQ539657.1)核苷酸同源性最高為99.4%，與中國分離物Pe-wh-42(KR820543)核苷酸同源性最低為91.9%。

2.3 石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃櫻桃病毒病檢出率

通過設(shè)計特異性引物對6個基地采集的122份設(shè)施櫻桃疑似病樣進行RT-PCR檢測，兵團第八師134團、136團、150團、141團、葡萄研究所和第七師129團設(shè)施櫻桃病毒的總檢出率分別為85.0%、76.0%、81.2%、90.9%、77.8%、83.3%。主要有2種病毒，為CVA和PNRSV，這2種病毒的總檢出率分別為67.3%和61.1%，兩種病毒復合侵染檢出率為36.1%。134團設(shè)施櫻桃檢測中PNRSV在4種病毒中檢出率較高，其他采集地CVA檢出率較高;只有129團和葡萄研究所檢測到PDV，檢出率分別為27.8%和23.0%；葡萄研究所檢測出CGRMV，檢出率為46.1%。說明石河子地區(qū)侵染設(shè)施櫻桃的病毒以櫻桃病毒A(CVA)和李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)為主，不同地點病毒檢出率不同并且相同地點的不同病毒檢出率也有差異。表4，表5

表4 各地不同品種病原病毒的檢出率

Table 4 Detection rates of various pathogenic viruses in different regions and varieties

樣品采集地Location樣品數(shù)(份)Numberofsamples各地病毒總檢出Totaldetectionratesofvirusesindifferentregions(%)各病毒檢出率Detectionrateofvariousviruses(%)CVAPNRSVPDVCGRMV134團 134Tuan4085 050 075 000136團 136Tuan2576 032 044 000150團 150Tuan1668 462 556 200129團 129Tuan1877 861 138 927 80葡萄研究所GrapeResearchInstitute1383 375 050 023 046 1141團 141Tuan1090 972 854 600總計 Intotal12281 967 361 16 54 9

表5 各病原病毒的復合侵染率

Table 5 Complex infection rates of various pathogenic viruses

樣品采集地Location復合侵染率 Complexinfectionrates(%)PNRSV+PDVPNRSV+CGRMVCVA+PNRSVCVA+PDVCVA+PDV+CGRMVCVA+PNRSV+PDVCVA+PDV+PNRSV+CGRMV134團 134Tuan0032 00000136團 136Tuan0040 00000150團 150Tuan0031 60000129團 129Tuan27 7022 316 6011 10葡萄研究所GrapeResearchInstitute23 046 138 415 430 115 47 6141團 141Tuan0036 30000總計 Intotal6 54 936 14 13 33 20 8

3 討 論

研究針對兵團第八師和第七師6個采集地設(shè)施櫻桃病毒病進行田間調(diào)查，櫻桃葉片多表現(xiàn)皺縮、花葉、褪綠斑駁、細長畸形、黃化等癥狀，與文獻報道基本一致[15]。通過對新疆第134團、136團、150團、141團、葡萄研究所和第七師129團122份設(shè)施櫻桃疑似病樣進行了RT-PCR分子檢測，可能由于采集樣品范圍較小，研究主要檢測出CVA、PNRSV、PDV、CGRMV4種病毒，兵團第八師134團、136團、150團、141團、葡萄研究所和第七師129團采集樣本的帶毒率分別為85.0%、76.0%、81.2%、90.9%、77.8%、83.3%，根據(jù)結(jié)果初步判定侵染并危害石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃的病毒有CVA、PNRSV、PDV、CGRMV，其中多以復合侵染，CVA和PNRSV兩種病毒的復合侵染率為36.1%，隨著病毒種類增多，復合侵染率降低。因此，新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病的發(fā)生將成為影響該地區(qū)櫻桃品質(zhì)和產(chǎn)量的一個潛在因素。由于采集地范圍所限，除此4種病毒外，是否還存在其他未知櫻桃病毒，有待進一步深入的研究。

通過對4個分離物序列分析，CVA-SHZ分離物核苷酸序列與中國山東泰安的分離物ChTA12(KT310083.1)和ChTA11(KT285841.1)同源性高達99.5%。PDV-SHZ分離物核苷酸序列與中國分離物HSY4-1(KC965106.1)氨基酸同源性最高為99.0%，CGRMV-SHZ分離物核苷酸序列與中國分離物ZZ-Ch-13(HQ539657.1)核苷酸同源性最高為99.4%。石河子分離物PNRSV-SHZ CP基因核苷酸序列與中國山東櫻桃上PNRSV分離物DJ1-1(JF333586.1)的同源性最高為99.5%，而與新疆果樹巴旦木上四個分離物XJC-12(JQ247429.1)、XJC-47(JQ247432.1)、XJC-35(JQ247430.1)和XJC-39(JQ247431.1)序列同源性最低為93.0%、93.2%、92.7%和91.5%，從系統(tǒng)進化樹分析也與山東DJ1-1關(guān)系最近而與新疆分離物關(guān)系最遠。石河子地區(qū)櫻桃種苗主要來自源于山東和遼寧[21]。推測新疆石河子地區(qū)櫻桃上的PNRSV病原并非該地區(qū)其他帶毒果樹上感染的病原，可能與石河子地區(qū)櫻桃引種來源有關(guān)。CVA和PNRSV都屬于檢疫性病毒，具有一定的檢疫重要性[22]，因此，加強對苗木引種和調(diào)運病毒檢疫檢驗工作，是控制該地區(qū)櫻桃病毒病發(fā)生的主要途徑。

4 結(jié) 論

通過對新疆石河子設(shè)施櫻桃病毒病害進行調(diào)查以及利用特異性引物對122個設(shè)施櫻桃疑似病毒病樣品進行RT-PCR檢測及序列同源性分析。石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病田間癥狀主要表現(xiàn)有花葉、卷葉、褪綠黃化、畸形、皺縮等，通過RT-PCR檢測出的病毒有CVA、PNRSV、PDV和CGRMV；其中分離物CVA-SHZ、PNRSV-SHZ、PDV-SHZ和CGRMV-SHZ序列分析與GenBank中注冊的相應病毒核苷酸序列同源性最高均高于99%。其檢出率依次為67.3%、61.1%、6.5%、4.9%，兩種及兩種以上病毒復合侵染檢出率56.5%。說明新疆石河子地區(qū)設(shè)施櫻桃病毒病原以CVA和PNRSV為主，且兩種病毒復合侵染較為普遍。

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Investigation and Pathogen Detection of Cherry Virus Disease in Greenhouses in Shihezi of Xinjiang

ZHOU Deng-pan, HAO Xiao-jun, XIANG Ben-chun

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 In order to investigate the situation and identify the virus types of cherry virus diseases in greenhouse cultivation cherry in Shihezi of Xijiang. 【Method】Virus diseases were investigated in greenhouse cultivation cherry in Shihezi, eight pairs of specific primers were utilized to detect the 122 symptomatic samples by RT-PCR. 【Result】The results show that symptoms mainly included mosaic and green mottle, roll leaf, yellow, deformity, crinkle, etc. RT-PCR amplification showed that Cherry virus (CVA),Prunusnecroticringspotvirus(PNRSV),Prunedwarfvirus(PDV),Cherrygreenringmottlevirus(CGRMV) were found in the samples; The similarity analysis of the nucleotide sequences showed that isolates of CVA-SHZ, PNRSV-SHZ, PDV-SHZ and CGRMV-SHZ were reported in GenBank isolates ChTA12(KT310083.1), DJ1-1(JF333586.1), HSY4-1(HQ539657.1), ZZ-Ch-13(KC965106.1). And their nucleotide homologies were 99.5%, 99.5%, 99.0% and 99.4%，respectively. The average rates of infection with CVA, PNRSV, PDV and CGRMV were 67.3% , 66.1%, 6.5% and 4.9%, respectively. The average rates of infection with more than two viruses were 56.5% samples. 【Conclusion】CVA and PNRSV are the main viruses in greenhouse cherry in Shihezi of Xijiang, and the mixed infection of the two are common. This is the first report on the detection of CVA, PNRSV, PDV and CGRMV in cherry in Xinjiang.

greenhouse cherry; virus disease; molecular detection; mixed infection

XIANG Ben-chun(1958-), male, Yibin in sichuan province，professor，Doctoral tutor，The research direction for plant viruses and diseases. (E-mail)Xiang@shzu.edu.cn

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.04.017

2017-01-16

兵團農(nóng)作物病害安全防控創(chuàng)新團隊(0205-KC0017)

周登攀(1990- )，男，河南商丘人，碩士研究生，研究方向為植物病毒及其病害，(E-mail)593345795@qq.com

向本春(1958-)，男，四川宜漢人，教授，博士生導師，研究方向為植物病毒及其病害，(E-mail)XBC@shzu.edu.cn

S436.629

A

1001-4330(2017)04-0715-10

Supported by: Supported by Crop Disease Prevention and Control Innovation Team Program of XPCC (0205-KC0017)