于 湛, 何 妍, 戚涵姝, 谷笑雨, 劉麗艷, 蘇桂田, 辛士剛

(1. 沈陽師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心, 沈陽 110034; 3. 沈陽師范大學(xué) 復(fù)雜體系分離與分析遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽 110034)

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橙皮素同2種血清蛋白相互作用的光譜研究

于 湛1,3, 何 妍1, 戚涵姝1, 谷笑雨1, 劉麗艷1, 蘇桂田1, 辛士剛2

(1. 沈陽師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心, 沈陽 110034; 3. 沈陽師范大學(xué) 復(fù)雜體系分離與分析遼寧省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 沈陽 110034)

利用熒光光譜法以及分子對(duì)接計(jì)算研究了橙皮素同人血清白蛋白(HSA)間的相互作用,并將結(jié)果同牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,橙皮素均可以通過靜態(tài)猝滅的方式有效地猝滅這2種蛋白質(zhì),且猝滅常數(shù)相近,猝滅效率差別很小。橙皮素與HSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與BSA相同,但是結(jié)合常數(shù)小于BSA,并且同步熒光光譜數(shù)據(jù)顯示橙皮素與BSA和HSA的相互作用使得這2種血清蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化,從而導(dǎo)致熒光猝滅。分子對(duì)接計(jì)算表明,橙皮素同BSA及HSA的作用方式相似,都是在疏水及氫鍵作用驅(qū)動(dòng)下結(jié)合在BSA或HSA部分氨基酸殘基形成的疏水性口袋中。

橙皮素; 人血清白蛋白; 牛血清白蛋白; 相互作用; 熒光光譜法; 同步熒光法; 分子對(duì)接

0 引 言

圖1 橙皮素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of hp

橙皮素(hesperetin,hp)為二氫黃酮類化合物,是柑橘類植物果實(shí)的主要藥效成分及代謝產(chǎn)物。橙皮素具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗血小板凝聚、舒張血管、抗動(dòng)脈粥樣硬化及抗炎等作用[1],可抑制脂肪分解,促進(jìn)DNA生物合成,此外還具有健胃、祛痰、鎮(zhèn)咳等多種功效[1]。血清蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的載體蛋白,許多化學(xué)物質(zhì)通過與血清蛋白結(jié)合,載運(yùn)至靶位置從而完成各種生命活動(dòng)[2]。因此研究活性小分子同血清蛋白的相互作用,對(duì)于了解生命過程、研究藥物作用機(jī)制及設(shè)計(jì)藥物分子具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[3]。人血清白蛋白(HSA)與牛血清白蛋白(BSA)是最常見的2種血清蛋白,由于BSA同HSA相比具有序列相似度高、成本低廉,因此改變順序被廣泛采用[4]。本文采用熒光光譜法并輔以分子對(duì)接模擬計(jì)算,研究了橙皮素同BSA、HSA間的相互作用,并獲得了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等參數(shù),并依此推測(cè)了復(fù)合物結(jié)構(gòu),為研究橙皮素的潛在藥物應(yīng)用以及藥品功能開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

橙皮素(上海如吉生物科技有限公司)、HSA(美國(guó)Sigma公司)、BSA、三羥甲基氨基甲烷(Tris,美國(guó)Amersco公司)、HCl、NaOH(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、二次去離子水。

Cary Eclipse熒光光譜儀(美國(guó)Varian 公司)、Lambda 25紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Perkin Elmer公司)、FE20K 型pH計(jì)(上海梅特勒托利多公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

hp使用無水乙醇為溶劑,配制為1.0×10-4mol/L儲(chǔ)液備用;HSA與BSA 配制為1.0×10-4mol/L溶液備用;將適量Tris溶解于水后用0.1 mol/L HCl與0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH值為5.4、6.4與7.4,其中Tris濃度為0.1 mol/L,為保證離子強(qiáng)度,此緩沖溶液還含有0.1 mol/L NaCl。在5 mL離心管中依次準(zhǔn)確加入200 μL BSA(或HSA)溶液、1 mL Tris緩沖溶液以及一定量的hp儲(chǔ)液,用去離子水定容至4 mL,隨后恒溫水浴一定時(shí)間后立即進(jìn)行熒光測(cè)試。

熒光光譜儀參數(shù)如下:激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5 nm;λex設(shè)為280 nm;掃描范圍為285～500 nm;固定波長(zhǎng)同步熒光掃描中波長(zhǎng)差Δλ分別為15 nm和60 nm。

BSA與HSA結(jié)構(gòu)均來自于RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào):4F5S與1AO6),hp結(jié)構(gòu)來自pubchem網(wǎng)站,并通過MMFF94分子力場(chǎng)[5]進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)處理。分子對(duì)接使用Autodock 4.2程序[6]完成。格子選擇選長(zhǎng)寬高均為126?的立方體,格子間隔為0.375?。橙皮素分子中可旋轉(zhuǎn)的單鍵、非極性氫原子及相關(guān)聯(lián)的碳原子性質(zhì)按照AutoDock Tools選取的默認(rèn)值。分子對(duì)接中關(guān)于遺傳算法(GA)幾個(gè)重要的參數(shù)設(shè)置如下:種群數(shù)為150,能量評(píng)估最大值為2.5×106,運(yùn)算循環(huán)數(shù)為100,其余參數(shù)均采用默認(rèn)值。分子對(duì)接結(jié)果使用LigPlot+[7]程序分析。

1.3 熒光強(qiáng)度測(cè)定

本文給出的熒光發(fā)射強(qiáng)度均是實(shí)驗(yàn)直接獲得的熒光發(fā)射強(qiáng)度經(jīng)式(1)進(jìn)行內(nèi)濾效應(yīng)校正[8]后得到。

(1)

式中:Fcorr與Fobs分別為經(jīng)過與未經(jīng)校正的熒光發(fā)射強(qiáng)度;Aex和Aem是分別是猝滅劑hp在樣品溶液條件下,在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)下的紫外-可見吸光度。校正數(shù)據(jù)見表1。

表1 BSA/HSA在不同濃度hp存在下的內(nèi)濾效應(yīng)校正系數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液條件對(duì)于hp猝滅BSA、HSA的影響

溶液pH對(duì)于蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定影響,可能會(huì)引起B(yǎng)SA、HSA等載體蛋白對(duì)藥物小分子載運(yùn)能力的改變。因此,本文選擇pH為5.4、6.4以及7.4的Tris緩沖溶液,考察了溶液pH對(duì)血清蛋白熒光猝滅的影響。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)pH對(duì)于hp猝滅BSA的影響不明顯,其中pH=7.4條件下hp對(duì)于BSA的猝滅效果最強(qiáng)。這可能是由于pH=7.4最接近BSA的生理?xiàng)l件,此時(shí)BSA的結(jié)構(gòu)最為舒展,hp與BSA的結(jié)合也最強(qiáng)。

此外本文還考察了水浴時(shí)間、水浴溫度對(duì)于猝滅的影響,發(fā)現(xiàn)水浴溫度對(duì)于猝滅影響較大,溫度越低猝滅越明顯,當(dāng)水浴時(shí)間超過30 min,猝滅比較穩(wěn)定。

2.2 hp猝滅BSA、HSA的機(jī)理分析

圖2為含有濃度為2.5×10-6mol/L BSA及濃度分別為0、1、2、3、4、5、6×10-6mol/L hp的混合溶液于37 ℃下水浴30 min后的熒光發(fā)射光譜圖(由于hp猝滅HSA情況與此相似,光譜圖省略)。由圖可見,hp對(duì)于BSA具有較強(qiáng)的猝滅作用。

對(duì)于熒光猝滅,可根據(jù)Stern-Volmer方程進(jìn)行分析。Stern-Volmer方程如下所示:

(2)

其中:F0/F為未加入與加入猝滅劑后體系熒光強(qiáng)度之比;[Q]為猝滅劑濃度;Kq為雙分子碰撞猝滅常數(shù);生物大分子的平均熒光壽命τ0為10-8s[9];Ksv為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)。

圖3為上述溶液分別置于17、27及37 ℃下水浴30 min后,于347 nm處所得F0/F與[Q]關(guān)系。由圖可見,在相同[Q]條件下,較低溫度下的F0/F值要高于較高溫度下F0/F值,而所有溫度下F0/F值與[Q]均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,說明BSA及HSA與hp所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性與溫度成反比,這與文獻(xiàn)所報(bào)道的靜態(tài)猝滅規(guī)律一致[10],由此可初步判斷hp猝滅BSA(或HSA)熒光可能是由于兩者之間形成了非共價(jià)復(fù)合物。

圖2 hp猝滅BSA的熒光光譜圖

圖3 hp猝滅BSA與HSA的Stern-Volmer曲線

根據(jù)Stern-Volmer方程對(duì)圖2中數(shù)據(jù)計(jì)算,所得Kq與Ksv等數(shù)據(jù)列于表2。Kq均大于小分子與生物大分子相互作用的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol- 1·s- 1,由此可推測(cè)hp對(duì)BSA和HSA都是靜態(tài)猝滅。

表2 不同溫度下hp對(duì)BSA與HSA猝滅常數(shù)

圖4 不同溫度下hp猝滅BSA與HSA雙倒數(shù)曲線Fig.4 Scatchard plots for the interaction between hp and BSA/HSA under different temperatures

當(dāng)發(fā)生靜態(tài)猝滅,可根據(jù)雙對(duì)數(shù)方程(3)計(jì)算猝滅劑對(duì)蛋白的猝滅,獲知二者之間的結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。

(3)

圖4為不同溫度下hp猝滅BSA與HSA的雙倒數(shù)圖。由圖可見,在相同溫度下,hp同HSA的結(jié)合弱于同BSA的結(jié)合,而對(duì)于同一蛋白而言,升高溫度可提高結(jié)合常數(shù),并且hp與這2種血清白蛋白均形成1∶1型復(fù)合物。

小分子同蛋白質(zhì)所形成的復(fù)合物中兩者之間作用力主要包括疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等[11]。根據(jù)熱力學(xué)公式lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R對(duì)表3中Ka與T進(jìn)行線性擬合,可以獲得hp與BSA及HSA結(jié)合的ΔH、ΔS及ΔG,所得結(jié)果列于表4中。

表3 hp與BSA/HSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

表4 hp與BSA及HSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

根據(jù)Ross等人[12]所總結(jié)出的小分子與生物大分子的經(jīng)驗(yàn)規(guī)律對(duì)表4數(shù)據(jù)分析可知,hp同BSA及HSA結(jié)合的ΔH與ΔS都大于零,說明這種復(fù)合物是基于疏水作用力結(jié)合的,而反應(yīng)的ΔG均小于零,說明復(fù)合反應(yīng)均為自發(fā)進(jìn)行的吸熱反應(yīng)。

2.3 hp猝滅BSA、HSA的同步熒光分析

同步熒光光譜是研究研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種有力手段,近年來廣泛應(yīng)用在小分子和生物大分子的相互作用的研究領(lǐng)域中。為研究復(fù)合物中hp對(duì)兩種血清蛋白構(gòu)象的影響,本文分別選用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步熒光光譜法研究Tyr與Trp殘基發(fā)光的變化。這兩種氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處的微環(huán)境的極性有關(guān),若其所處環(huán)境的疏水性逐漸增加,則最大發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生藍(lán)移,反之,則發(fā)生紅移。因此,根據(jù)最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[13]。由圖5的hp猝滅HSA同步熒光光譜圖可以看出,隨著hp濃度的增加,HSA的熒光發(fā)射出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象,這說明hp可以改變HSA的構(gòu)象,使Trp和Tyr所處環(huán)境的疏水性減弱。此外,還可以看出hp對(duì)于Trp發(fā)光的猝滅程度大于Tyr,因此可推測(cè)hp在HSA上的結(jié)合位置可能在Trp殘基附近。hp猝滅BSA的同步熒光光譜圖與HSA的情況相似,本文不再重復(fù)給出。

2.4 分子對(duì)接結(jié)果分析

本文利用AutoDock軟件對(duì)hp與BSA及HSA所形成的1:1型非共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行分子對(duì)接研究,分析hp同2種血清蛋白之間的結(jié)合模型,并通過LigPlot+程序[14-15]分析復(fù)合物中hp與BSA和HSA之間的氫鍵及疏水作用。

由圖5a可以看出,疏水與氫鍵作用在hp與BSA之間的主要作用力,也是hp與BSA結(jié)合形成復(fù)合物的主要驅(qū)動(dòng)力[16-17]。BSA的Leu24、Lys20、Phe36、Val40、Lys132、Lys131、Trp134、Gly21、Glu17、Asn44等殘基形成一個(gè)疏水性口袋,hp結(jié)合在其中。復(fù)合物中,hp與Glu17及Asn44之間均存在<3?的氫鍵作用。我們推測(cè),在hp進(jìn)入這個(gè)疏水口袋后,Trp134附近的微環(huán)境受到一定程度的改變,從而促使BSA的熒光發(fā)射發(fā)生猝滅。HSA的情況(詳見圖5b)與此類似,不再贅述。

(a) Δλ=15 nm; (b) Δλ=60 nm

圖6 A、B分別為hp與BSA和HSA的分子對(duì)接結(jié)果(虛線以及數(shù)字代表客體分子與氨基酸殘基之間的氫鍵作用,放射狀半圓表示客體分子與氨基酸殘基之間的疏水作用)

3 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)利用熒光光譜結(jié)合分子模擬技術(shù)研究了hp對(duì)BSA與HSA的猝滅作用,通過實(shí)驗(yàn)得到:在水浴溫度為37 ℃、水浴時(shí)間30 min、pH為7.4的條件下,hp對(duì)BSA及HSA的猝滅最為明顯。本文根據(jù)Stem-Volmer方程求得hp猝滅BSA及HSA的類型為靜態(tài)猝滅,主客體之間形成了復(fù)合物,并根據(jù)雙對(duì)數(shù)方程計(jì)算了這些復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。同步熒光光譜法還揭示了hp在2種血清蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)均在Trp殘基附近。分子對(duì)接計(jì)算結(jié)果表明hp結(jié)合在BSA與HSA中部分氨基酸形成的疏水口袋中,主客體之間存在較強(qiáng)的疏水作用及氫鍵作用。

[ 1 ]尚永輝. 熒光光譜法研究橙皮素與牛血清白蛋白的相互作用[J]. 化學(xué)工程師, 2011,25(1):12-13.

[ 2 ]吳承燕. 茜素黃R與牛血清白蛋白光譜學(xué)及分子對(duì)接研究[J]. 福建師大福清分校學(xué)報(bào), 2014(2):49-51.

[ 3 ]張曦,寇自農(nóng),石羽佳,等. 同步熒光光譜法研究丹參素一牛血清白蛋白體系的熒光增強(qiáng)效應(yīng)[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2011,30(4):443-447.

[ 4 ]楊榮榮,朱靖博,寇自農(nóng),等. 光譜法與分子對(duì)接研究槲皮素與牛血清白蛋白的結(jié)合特性[J]. 食品科技, 2014,39(7):93-98.

[ 5 ]HANWELL M,CURTIS D,LONIE D,et al. Avogadro: an advanced semantic chemical editor,visualization,and analysis platform[J]. Journal of Cheminformatics, 2012,4(1):17.

[ 6 ]MORRIS G M,HUEY R,LINDSTROM W,et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility[J]. Journal of Computational Chemistry, 2009,30(16):2785-2791.

[ 7 ]LASKOWSKI R A,SWINDELLS M B. LigPlot+: Multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery[J]. Journal of Chemical Information and Modeling, 2011,51(10):2778-2786.

[ 8 ]LIIU X,SU M,CHEN P,et al. INTERACTIO OF CEFMINOX WITH BOVINE SERUM ALBUMIN[J]. 2014.

[ 9 ]張璐穎,郭明,陳建議,等. 熊果酸與血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)機(jī)制研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2010,30(3):41-48.

[11]林玉龍,王靜,楊彩琴,等. 齊墩果酸與牛血清白蛋白相互作用的光譜研究[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2011(4):483-486.

[12]ROSS P D,SUBRAMANIAN S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981,20(11):3096-3102.

[13]林銳,李悅,裘蘭蘭,等. 光譜法與分子對(duì)接法研究山柰酚對(duì)牛血清白蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2014,26(6):797-803.

[14]吳雨杭,蘭雪玲,陳楠,等. 同步熒光光譜法結(jié)合分子對(duì)接研究染料木素與牛血清白蛋白之間的相互作用[J]. 分析試驗(yàn)室, 2014,33(12):1365-1369.

[15]馬嘉澤,何妍,劉麗艷,等. 光譜法結(jié)合分子對(duì)接研究血清蛋白對(duì)吳茱萸次堿的識(shí)別作用[J]. 分析試驗(yàn)室, 2016,35(12):1365-1369.

[16]陳雅萱. 野黃芩苷及其苷元與人血清白蛋白的相互作用[J]. 武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2010(1):205-207.

[17]延輝. 七葉苷與牛血清白蛋白相互作用的分子對(duì)接研究[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014,27(4):54-57.

The spectroscopic study of intermolecular interactions between hesperetin and two serum albumins

YU Zhan1,3, HE Yan1, QI Hanshu1, GU Xiaoyu1, LIU Liyan1, SU Guitian1, XIN Shigang2

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. Experimental Center, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 3. Provincial Key Laboratory for Separation and Analysis of Complex Systems in Liaoning Universities, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

The interaction between hesperetin and human serum albumin(HSA) was investigated in this work, contrasted with the interaction between hesperetin and bovine serum albumin(BSA), by the method of fluorescence spectroscopy and molecular docking simulation. Experimental results show that the fluorescence of both BSA and HSA can be effectively quenched by the addition of hesperetin due to the static quenching mechanism. The quenching constants for the two proteins are similar and quenching efficiency are also alike. The numbers of binding sites of hesperetin to BSA and HSA are same but the binding constant of hesperetin and HSA are smaller than that of BSA. Synchronous fluorescence study indicates that the presence of hesperetin leads to slightly structural changes of proteins which causes fluorescence quenching of BSA and HSA. Molecular docking simulation shows that hydrophobic interactions and hydrogen bonding drive BSA and HSA to include hesperetin in their hydrophobic pockets formed by some amino acid residues of theirs.

hesperetin; human serum albumin; bovine serum albumin; interaction; fluorescence spectroscopy; synchronous fluorescence spectroscopy; molecular docking

1673-5862(2017)02-0208-06

2016-03-12。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21205080); 教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(教外司留[2012]1707); 遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(LJQ2015105)。

于 湛(1978-),男,遼寧沈陽人,沈陽師范大學(xué)副教授,博士。

TQ460.1

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.02.017