鄭建永，李天一，張 偉，汪 釗

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014)

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聚乙烯亞胺/戊二醛交聯(lián)法固定化重組酯酶大腸桿菌細(xì)胞

鄭建永，李天一，張 偉，汪 釗

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310014)

利用聚乙烯亞胺/戊二醛交聯(lián)法對(duì)重組酯酶大腸桿菌E.coliBL21細(xì)胞進(jìn)行固定化研究，并對(duì)交聯(lián)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)量濃度200 g/L、硅藻土質(zhì)量濃度2 g/L、聚乙烯亞胺(PEI)體積分?jǐn)?shù)3%、交聯(lián)時(shí)間1.5 h、戊二醛(GA)體積分?jǐn)?shù)0.5%以及交聯(lián)時(shí)間0.5 h時(shí)，固定化細(xì)胞的酯酶活力最高。固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度和pH分別為45 ℃和8.0，且溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均高于游離細(xì)胞。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L時(shí)，固定化細(xì)胞重復(fù)使用15批次后，其相對(duì)酶活仍能保留在80%以上。因此，該固定化細(xì)胞具有良好的操作穩(wěn)定性。

聚乙烯亞胺；戊二醛；固定化；交聯(lián)；酯酶

細(xì)胞的固定化，就是利用化學(xué)或物理的方法將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其不溶于水且能保持生物活性，而且可反復(fù)利用的手段[1]。常見(jiàn)的細(xì)胞固定化方法有吸附法、包埋法、共價(jià)法和交聯(lián)法四大類(lèi)[2]。交聯(lián)法又稱(chēng)為無(wú)載體固定法，是通過(guò)微生物與具有兩個(gè)或兩個(gè)以上官能團(tuán)的試劑反應(yīng)，使微生物菌體相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而達(dá)到固定化的目的[3]。常見(jiàn)的交聯(lián)劑是戊二醛。該技術(shù)具有以下特點(diǎn)：對(duì)酶純度要求不高，不需要結(jié)晶等復(fù)雜步驟；獲得的固定化酶穩(wěn)定性好，活性高；成本低廉，設(shè)備簡(jiǎn)單；無(wú)需其他載體，且單位體積活性大，空間效率高。

酯酶(esterase，EC3.1.1.X)是一類(lèi)催化酯鍵(羧酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵等)水解和合成的酶的總稱(chēng)，在動(dòng)植物和微生物中普遍存在，動(dòng)物胰臟酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要來(lái)源[4]。利用酯酶在有機(jī)相中的酯交換或酯化功能對(duì)制備精細(xì)化學(xué)品、手性化合物和生物柴油有重要意義[5-7]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選獲得蠟樣芽胞桿菌BacilluscereusWZZ001(CCTCCM2012403)來(lái)源的酯酶[8]，此酶具有高立體選擇性水解手性藥物左乙拉西坦中間體(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的催化特性(圖1)。該酯酶編碼基因(GenBank登錄號(hào)KP975533)全長(zhǎng)1 458 bp，編碼485個(gè)氨基酸，已構(gòu)建以大腸桿菌E.coliBL21(DE3)為宿主，高效表達(dá)該酯酶基因的重組工程菌株E.coliBL21/pEASY-E1-est[8]。左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)，商品名為開(kāi)浦蘭，是由比利時(shí)UCB公司研制的一種新型第二代抗癲癇藥物[9]，(R)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸是合成左乙拉西坦藥物的重要中間體。

圖1 蠟樣芽胞桿菌酯酶催化拆分(R,S)-α-乙基-2- 氧代-1-吡咯烷乙酸甲酯Fig.1 Resolution of rac-α-ethyl-2-oxo-pyrrolidineacetic acid methyl ester catalyzed by B. cereus esterase

筆者前期研究利用重組工程菌E.coliBL21/pEASY-E1-est全細(xì)胞催化拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯反應(yīng)，但是由于游離工程菌細(xì)胞的操作穩(wěn)定性較差，此工藝達(dá)不到工業(yè)化的要求。本文中，筆者擬采用聚乙烯亞胺(PEI)和戊二醛(GA)交聯(lián)法對(duì)重組E.coliBL21全細(xì)胞進(jìn)行固定化研究，考察最佳細(xì)胞固定化的工藝條件以及固定化細(xì)胞催化拆分(R,S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸甲酯的操作穩(wěn)定性，以期為規(guī)?；a(chǎn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

基因工程菌株E.coliBL21/pEASY-E1-est由筆者所在實(shí)驗(yàn)室成員自主構(gòu)建，其中酯酶基因來(lái)源于篩選的菌株B.cereusWZ001(保藏于武漢大學(xué)菌種保藏中心，CCTCCM2012403)。

1.2 培養(yǎng)基

LB/Amp培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L。溶于蒸餾水中，并調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，在121 ℃滅菌20 min后向滅菌后的培養(yǎng)基中添加過(guò)濾除菌后初始質(zhì)量濃度100 mg/mL的氨芐青霉素(Amp)至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.3 試劑與儀器

50%聚乙烯亞胺(PEI，分子量為70 000)，上海晶純生化科技股份有限公司；25%戊二醛(GA)，天津阿法埃莎化學(xué)有限公司；硅藻土，溫州化學(xué)材料廠(chǎng)；其他試劑均為市售分析純。

RCT B S25型磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；HWY-2112型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床，上海百典儀器設(shè)備有限公司；Agilent 6890型氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；BGB-175氣相色譜柱，瑞士BGB公司。

1.4 聚乙烯亞胺/戊二醛交聯(lián)固定化細(xì)胞方法

2 g重組大腸桿菌濕菌體加到20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中(pH 8.0，0.2 mol/L)，制備得到菌懸液，并置于磁力攪拌器上，向其中加入0.2 g硅藻土。將50%PEI按質(zhì)量比稀釋10倍后，向菌懸液中加入稀釋后的PEI，交聯(lián)60 min，再加入體積分?jǐn)?shù)1%GA，交聯(lián)60 min。通過(guò)真空抽濾進(jìn)行固液分離，分離過(guò)程中用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，最后所得固體即為固定化細(xì)胞。

1.5 酶活力的測(cè)定條件

取1 g固定化細(xì)胞于30 mL離心管中，加入10 mL磷酸鹽緩沖液(pH 8.0，0.2 mol/L)和200 μL底物α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸酯，在30 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)30 min后，取反應(yīng)液0.5 mL加入1 mL乙酸乙酯萃取，無(wú)水Na2SO4除水后，以氣相色譜檢測(cè)剩余底物濃度，并計(jì)算對(duì)映體過(guò)量值e.e.s和轉(zhuǎn)化率。酶活定義：上述反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol的(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯轉(zhuǎn)化成(R)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸所需的酶量。

氣相色譜分析條件：采用美國(guó)Agilent公司的6890N氣相色譜儀和瑞士BGB公司的BGB-175氣相色譜柱進(jìn)行分析。載體為N2(70 kPa)，進(jìn)樣口溫度220 ℃，空氣流量300 mL/min，尾吹氣流量30 mL/min，分流比30∶ 1，進(jìn)樣量1 μL；柱箱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?15 ℃保持3 min，2 ℃/min升溫至170 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乙烯亞胺濃度及交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞的影響

在細(xì)胞固定化體系中加入了PEI和GA，通過(guò)兩者的交聯(lián)作用能在細(xì)胞顆粒表面形成一層紅色的聚合物膜，提高細(xì)胞的力學(xué)強(qiáng)度，其固定化效果比單獨(dú)使用PEI或GA好[10]。PEI具有一定的蛋白質(zhì)保護(hù)作用，可降低交聯(lián)作用使酶失活。分別考察不同體積分?jǐn)?shù)PEI對(duì)固定化細(xì)胞的活性的影響，固定化體系中的其他因素不變，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活隨著PEI的濃度的增加而升高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%以上時(shí)趨向穩(wěn)定，隨后有一定的下降，這可能是GA雖然能和細(xì)胞交聯(lián)，但是交聯(lián)結(jié)構(gòu)不夠緊密，細(xì)胞容易從交聯(lián)結(jié)構(gòu)中脫落，使酶的回收率下降。綜合考慮，選擇體積分?jǐn)?shù)為3%PEI進(jìn)行交聯(lián)化固定。

考察不同PEI交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響，固定化體系中的其他因素不變，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活隨著PEI交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到最大，隨后開(kāi)始急劇下降，這可能是因?yàn)镻EI和GA的交聯(lián)結(jié)構(gòu)會(huì)隨著交聯(lián)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)越來(lái)越緊密，使得固定化細(xì)胞的傳質(zhì)阻力加大，降低了固定化細(xì)胞的活性，造成酶相對(duì)活力的下降。綜合考慮，固定化體系選擇PEI交聯(lián)時(shí)間90 min為最佳。

圖3 PEI交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞相對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of PEI crosslinking time on the relative activity of immobilized cell

2.2 戊二醛濃度及交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞的影響

考察不同體積分?jǐn)?shù)GA對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響，固定化體系中的其他因素不變，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活隨著GA用量的增加而升高，當(dāng)GA體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到最高，隨后又大幅度下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的GA會(huì)導(dǎo)致蛋白變性，從而降低固定化細(xì)胞的活性，造成活力的下降。綜合考慮，固定化體系選擇體積分?jǐn)?shù)1%的GA最佳。

圖4 GA體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化細(xì)胞相對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of GA concentration on the relative activity of immobilized cell

考察不同GA交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響，固定化體系中的其他因素不變，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活隨著GA交聯(lián)時(shí)間的增加而升高，交聯(lián)時(shí)間為30 min時(shí)趨向穩(wěn)定。隨后變化幅度不大，這可能是因?yàn)镚A是小分子物質(zhì)，與PEI的交聯(lián)能在短時(shí)間內(nèi)迅速完成，隨著交聯(lián)時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)變化不大。綜合考慮，固定化體系選擇GA交聯(lián)時(shí)間30 min為最佳。

圖5 GA交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化細(xì)胞相對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of GA crosslinking time on the relative activity of immobilized cell

2.3 細(xì)胞添加量對(duì)固定化細(xì)胞的影響

分別考察不同梯度(30、70、100、150、200和250 g/L)的細(xì)胞添加量對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響，固定化體系中的其他因素不變，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知：固定化細(xì)胞的相對(duì)酶活隨著細(xì)胞添加量的增加而升高，這是因?yàn)榈图?xì)胞添加量可以形成較小顆粒從而加速傳質(zhì)，但是不利于交聯(lián)。而高細(xì)胞添加量更有利于交聯(lián)，但是形成顆粒較大影響傳質(zhì)，使固定化細(xì)胞活性下降。綜合考慮，固定化體系選擇細(xì)胞添加量為200 g/L。

圖6 細(xì)胞添加量對(duì)固定化細(xì)胞相對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of cell addition on the relative activity of immobilized cell

2.4 硅藻土濃度對(duì)固定化細(xì)胞的影響

硅藻土粉末不僅具有吸附和抗溶脹效果，還有塑形、助濾和改善固定化顆粒傳質(zhì)特性的作用，并且價(jià)格比SiO2及活性炭要低[11]。分別考察不同梯度(2、6、10、14、18和22 g/L)的硅藻土對(duì)固定化細(xì)胞活性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，加入硅藻土后相對(duì)未添加之前固定化細(xì)胞的酶活性有明顯提高。但是當(dāng)硅藻土濃度過(guò)高時(shí)，其相對(duì)酶活開(kāi)始呈下降趨勢(shì)。綜合考慮，選擇2 g/L硅藻土為最適質(zhì)量濃度。在上述最佳固定化條件下獲得的固定化細(xì)胞的比酶活為152.6 U/g，其回收率達(dá)到77.8%。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞酶的底物選擇性基本不變，當(dāng)轉(zhuǎn)化率為50%時(shí)，e.e.s達(dá)到99.5%。

圖7 硅藻土濃度對(duì)固定化細(xì)胞相對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of diatomaceous earth on the relative activity of immobilized cell

2.5 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的pH溫度及pH穩(wěn)定性

取制備好的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞各1 g置于30 mL離心管中，分別加入不同pH的緩沖液和底物，在45 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)30 min，氣相檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出：固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞均在pH 8.0時(shí)活力最大，而且在最適pH附近，固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞相比，其活性下降趨勢(shì)明顯更緩，這是因?yàn)楣潭ɑ?xì)胞周?chē)奈h(huán)境為細(xì)胞提供了一定的緩沖作用，從而使細(xì)胞處在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中，使它的酶活保持穩(wěn)定。

圖8 pH對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effects of pH on the activity of immobilized and free cell

在考察固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的pH穩(wěn)定性時(shí)，以固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞在不同pH時(shí)的初始活性為100%，考察固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞在不同pH下保存6 h后的催化活力，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：在不同pH條件下，固定化細(xì)胞的催化活力均優(yōu)于游離細(xì)胞，這充分說(shuō)明了PEI/GA交聯(lián)固定化后的細(xì)胞比游離細(xì)胞的pH穩(wěn)定性有顯著的提高，這是因?yàn)榻宦?lián)體系能在細(xì)胞表面形成一層緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[12]，能較好地保護(hù)細(xì)胞，以減緩?fù)饨鏿H對(duì)其的傷害。

圖9 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的pH穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of immobilized and free cell

2.6 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

取制備好的固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞各1 g置于30 mL離心管中，加入pH 8.0的磷酸鹽緩沖液10 mL和底物，200 r/min和不同溫度下反應(yīng)30 min，氣相檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：游離細(xì)胞在35 ℃時(shí)活力最高，而固定化細(xì)胞在40～50 ℃均擁有很高的活力，且在45 ℃時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明固定化細(xì)胞的溫度使用范圍比游離細(xì)胞更寬。

圖10 溫度對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞活力的影響Fig.10 Effects of temperature on the activity of immobilized and free cell

熱穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)生物催化劑能否工業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。在考察固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的pH穩(wěn)定性時(shí)，以固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞在不同溫度下的初始活力為100%，考察固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞在不同溫度下保存3 h后的催化活力，結(jié)果如圖11所示。由圖11可知：在40 ℃以下時(shí)，溫度對(duì)固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的影響較小，而當(dāng)溫度在40 ℃以上時(shí)，游離細(xì)胞的活力開(kāi)始大幅度下降，且在50 ℃時(shí)其活力只有初始活力的62.7%，而固定化細(xì)胞仍能保持其初始活力的87.5%，說(shuō)明固定化細(xì)胞相比較于游離細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性更好。

圖11 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的溫度穩(wěn)定性Fig.11 Temperature stability of immobilized and free cell

2.7 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞的操作穩(wěn)定性

對(duì)商業(yè)化應(yīng)用的生物固定化催化劑，最理想的性能就是其優(yōu)良的操作穩(wěn)定性和重復(fù)使用能力[14]?？疾旃潭ɑ?xì)胞和游離細(xì)胞的操作穩(wěn)定性，結(jié)果如圖12所示。由圖12可知：細(xì)胞經(jīng)PEI/GA交聯(lián)后結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，在15個(gè)批次后依然能保持其初始酶活的85%以上，而游離細(xì)胞的酶活下降非?？欤诘?批的時(shí)候，其相對(duì)酶活只有初始酶活的5%，這說(shuō)明PEI/GA的交聯(lián)固定化體系能夠很好地保護(hù)細(xì)胞和酶結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出了良好的操作穩(wěn)定性。

圖12 固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性Fig.12 Batches stability of immobilized and free cell

3 結(jié)論

對(duì)聚乙烯亞胺和戊二醛無(wú)載體交聯(lián)法固定化全細(xì)胞的工藝進(jìn)行考察，得到交聯(lián)固定體系最優(yōu)條件：交聯(lián)細(xì)胞質(zhì)量濃度200 g/L，硅藻土質(zhì)量濃度為2 g/L，聚乙烯亞胺(PEI)體積分?jǐn)?shù)為3%、交聯(lián)時(shí)間1.5 h，戊二醛(GA)體積分?jǐn)?shù)為1%、交聯(lián)時(shí)間0.5 h。與游離細(xì)胞相比，固定化后的細(xì)胞酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生了部分改變，最適溫度從35 ℃提高至45 ℃。固定化酶的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均有一定的提高，因此該固定化工藝具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Immobilization of recombinant esteraseEscherichiacolicellsby cross-linking with polyethyleneimine-glutaradehyde

ZHENG Jianyong,Li Tianyi,ZHANG Wei,WANG Zhao

(Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province,College of Biotechnology and Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

We studied the immobilization of whole cells ofE.coliBL21,and optimized the cross-linked system by using polyethyleneimine and glutaraldehyde as carriers. The optimal immobilization conditions were 200 g/L cells and 2 g/L diatomite,which was subsequently cross-linked in 3% of the polyethyleneimine (PEI) and 0.5% of glutaraldehyde (GA) for 1.5 h and 0.5 h,respectively. The optimal reaction temperature and pH of the immobilized cells were 45 ℃ and 8.0. Moreover,data showed that the temperature stability and pH stability of the immobilized cells were higher than those of free cells. The relative activity of the immobilized cells remained 80% after 15 batches when the substrate concentration was 300 mmol/L,indicating that the immobilized cells had a good operational stability.

polyethyleneimine; glutaraldehyde; immobilization; cross-link; esterase

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.002

2017-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31600639)

鄭建永(1982—)，男，浙江永嘉人，高級(jí)工程師，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化；汪 釗(聯(lián)系人)，教授，E-mail:hzwangzhao@163.com

Q819

A

1672-3678(2017)03-0007-05