姜 霞，米小芳，鄭繪霞，梁建芳，肖 虹(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,太原 0000;運(yùn)城市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科;山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科；通訊作者，E-mail：xiaohonghong9999@6.com)

RACK1、PI3K、Akt蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

姜 霞1,2，米小芳3，鄭繪霞3，梁建芳3，肖 虹3*
(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,太原 030001;2運(yùn)城市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科;3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科；*通訊作者，E-mail：xiaohonghong9999@163.com)

目的 研究RACK1、PI3K及Akt蛋白在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)EnVision法檢測127例非小細(xì)胞肺癌組織(包括癌旁組織45例及非小細(xì)胞肺癌組織82例)中RACK1、PI3K及Akt的表達(dá)情況。 結(jié)果 RACK1、PI3K及Akt在肺腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05);RACK1及Akt蛋白在肺腺癌中表達(dá)在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在不同性別與腫瘤分化程度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);PI3K蛋白表達(dá)在不同腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在不同性別間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,在肺腺癌中,RACK1表達(dá)與PI3K和Akt之間比較均呈正相關(guān)性(P<0.05)。 結(jié)論 RACK1、PI3K及Akt在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá),尤其在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了一定的作用,其機(jī)制可能與RACK1、PI3K及Akt相互作用促進(jìn)細(xì)胞的增殖有關(guān)。

RACK1； PI3K； Akt； 非小細(xì)胞肺癌

在中國,肺癌仍然是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到所有肺癌類型的80%,大約30%的患者最后都會發(fā)展為晚期。對于晚期患者來說,治療的目的是提高患者的生存率和生存質(zhì)量。然而,不同組織學(xué)類型的患者預(yù)后不同[1]。有研究結(jié)果表明RACK1通過調(diào)控PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化[2]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)法檢測RACK1、PI3K、Akt蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況來探討RACK1與PI3K/Akt信號通路在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2004-02～2016-08原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除組織標(biāo)本及活檢標(biāo)本共82例(其中包括鱗癌32例,腺癌50例,標(biāo)本離體后立即投入4%福爾馬林液中固定,另取遠(yuǎn)離腫瘤部位組織45例同法固定),年齡35-73歲。病理類型:鱗癌32例,腺癌50例。肺腺癌患者中男性32例,女性18例;臨床分期:Ⅰ-Ⅱ期15例,Ⅲ-Ⅳ期35例;分化程度:中-高分化35例,低分化15例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。選取45例癌旁組織作為對照組,所有患者術(shù)前均無放化療史及治療史。

1.2 試劑

兔抗人RACK1單克隆抗體與兔抗人PI3K、兔抗人Akt多克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechnology。

1.3 免疫組織化學(xué)

所有石蠟標(biāo)本,切片厚度4 μm。采用EnVision法檢測RACK1、PI3K及Akt的表達(dá)情況。加入兔抗人RACK1單克隆抗體(濃度1 ∶300),兔抗人PI3K(濃度1 ∶100)、兔抗人Akt多克隆抗體(濃度1 ∶50)。4 ℃冰箱過夜后滴加50 μl的辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗,DAB顯色。

結(jié)果判定:RACK1、PI3K、Akt以胞質(zhì)染成黃棕色或黃褐色均勻顆粒狀為陽性。高倍顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野,每個視野計數(shù)100個細(xì)胞計算百分比,陽性細(xì)胞1%-25%為1分,26%-50%為2分,51%-75%為3分,76%-100%為4分。陽性強(qiáng)度:無色為0分,淡黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。二者相乘>3分為陽性,≤3分為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理,組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RACK1在肺癌組織中的表達(dá)情況

RACK1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(肺癌組織的陽性表達(dá)率為51%,癌旁組織為4%),差異異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);RACK1在肺癌組織中的表達(dá)與病理分型有關(guān),在肺腺癌中的陽性表達(dá)率高于肺鱗癌(見圖1),差異差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),RACK1在肺腺癌中的表達(dá)在不同性別、分化程度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及不同TNM分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1,2)。

2.2 PI3K在肺癌組織中的表達(dá)情況

PI3K在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(肺癌組織的陽性表達(dá)率為61%,癌旁組織為7%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PI3K在肺癌組織中的表達(dá)與病理分型有關(guān),在肺腺癌中的陽性表達(dá)率高于肺鱗癌(見圖2),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PI3K在肺腺癌中的表達(dá)在不同性別間無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),在不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1,2)。

A.腺癌 B.鱗癌圖1 RACK1蛋白免疫組化法在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) (EnVision,×100)Figure 1 Expression of RACK1 in non-small cell lung cancer (EnVision,×100)

表1 RACK1、PI3K及Akt在組織中的表達(dá)情況

Table 1 The expression of RACK1,PI3K and Akt in NSCLC tissues

組織類型nRACK1+-χ2PPI3K+-χ2PAkt+-χ2P癌旁組織4524328 0760 00134235 2420 00163930 7410 001肺癌組織82424031 4900 00150326 5440 01153294 9170 027 鱗癌3242814181616 腺癌50381236143713

2.3 Akt在肺癌組織中的表達(dá)情況

Akt在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(肺癌組織的陽性表達(dá)率為65%,癌旁組織為13%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);Akt在肺癌組織中的表達(dá)與病理分型有關(guān),在肺腺癌中的陽性表達(dá)率高于肺鱗癌(見圖3),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Akt在肺腺癌中的表達(dá)在不同性別、分化程度間無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1,2)。

A.腺癌 B.鱗癌圖2 PI3K蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) (EnVision,×100)Figure 2 Expression of VEGF in non-small cell lung cancer (EnVision,×100)

表2 RACK1、PI3K及Akt在腺癌組織中與臨床參數(shù)的比較

Table 2 Relationships between the expression of RACK1,PI3K and Akt and clinicopathologic parameters in adenocarcinoma tissues

臨床病理特征nRACK1+-χ2PPI3K+-χ2PAkt+-χ2P性別 0 0150 9010 3030 5820 0150 904男 32257257239女 18135117144分化程度0 4230 5156 4670 0112 8510 091中/高352872114235低 15105150141TNM分期4 3910 03625 1750 00115 5230 001Ⅰ?Ⅱ期1587312510Ⅲ?Ⅳ期35305332323 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10 9650 0019 9210 00212 5780 001有 25241232241無 25141113121312

2.4 RACK1與PI3K及Akt在肺腺癌中的相關(guān)性

由表3相關(guān)性分析顯示,在肺腺癌中RACK1與PI3K存在正相關(guān)性(r=4.445,P=0.035),在肺腺癌中RACK1與Akt之間同樣存在正相關(guān)性(r=3.912,P=0.048)。

A.腺癌 B.鱗癌圖3 Akt蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá) (EnVision,×100)Figure 3 Expression of Akt in non-small cell lung cancer (EnVision,×100)

表3 RACK1與PI3K及Akt在肺腺癌中的相關(guān)性比較

Table 3 The correlation of RACK1 with PI3K and Akt in lung adenocarcinoma

RACK1PI3K+-rPAkt+-rP+24144 4450 03525133 9120 048-120120

3 討論

活化的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1,RACK1)[3]是天冬氨酸-色氨酸-40(WD-40)重復(fù)蛋白家族的成員,是一種胞內(nèi)支架蛋白,可以與多種蛋白相互作用,在口腔鱗癌[4]、前列腺癌[5]、乳腺癌[6,7]等多種腫瘤中表達(dá)異常,并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),轉(zhuǎn)移是影響肺癌預(yù)后的重要因素,RACKl在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。這個過程涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,如PI3K/Akt信號通路[8]、Ras/MAPK信號通路[9]和Rho/RAC信號通路[10]等。有研究表明RACK1與Rac1相結(jié)合,直接調(diào)節(jié)Flt1介導(dǎo)的Rac1的激活,Rac1的激活可能迅速刺激微絲在質(zhì)膜重塑,形成膜皺褶,并促進(jìn)細(xì)胞遷移,PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對于Flt1相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移是必要的,RACK1通過PI3K/Akt/Rac1信號通路來調(diào)控VEGF/Flt1介導(dǎo)的細(xì)胞遷移[11]。

PI3K蛋白是一種胞內(nèi)磷脂酰激酶,PI3K活化后可以結(jié)合并激活A(yù)kt,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生。曹汐汐等[12]通過建立pGBKT7-PIK3CA質(zhì)粒,并利用酵母雙雜交系統(tǒng)在人乳腺癌cDNA文庫中篩選出有編碼RACK1蛋白的cDNA片段,證實(shí)PIK3CA與RACK1在酵母中有相互作用;并利用免疫熒光技術(shù)檢測PI3K p110α和RACK1蛋白在哺乳動物中的表達(dá)情況,證實(shí)PI3K p110α和RACK1蛋白在哺乳動物中共定位在細(xì)胞質(zhì)組分,存在相互作用。

本研究表明,RACK1和PI3K蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。在癌組織中的比較發(fā)現(xiàn),RACK1蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)類型有關(guān),并且在肺腺癌中的表達(dá)顯著高于肺鱗癌,RACK1在肺腺癌中的表達(dá)與性別、腫瘤分化程度無關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。在TNM分期Ⅲ-Ⅳ期中表達(dá)陽性率均較高,伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者RACK1陽性表達(dá)達(dá)到96%,并且TNM分期越高,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者RACK1陽性表達(dá)越高。PI3K蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)類型有關(guān),并且在肺腺癌中的表達(dá)顯著高于肺鱗癌,PI3K在肺腺癌中的表達(dá)與性別無關(guān),與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。在分化程度低的組織中PI3K陽性率高達(dá)100%,TNM分期Ⅲ-Ⅳ期陽性率高于Ⅰ-Ⅱ陽性率。研究結(jié)果表明二者高表達(dá)可能與肺腺癌的惡性程度有關(guān)。相關(guān)性分析顯示,RACK1與PI3K蛋白之間存在正相關(guān),說明RACK1與PI3K蛋白在肺腺癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮了一定作用,并且二者高表達(dá)對肺腺癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)作用。

Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心因子。有研究表明Akt的活化與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[13]。本研究中Akt蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。在癌組織中的比較發(fā)現(xiàn),Akt蛋白表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)類型有關(guān),并且在肺腺癌中的表達(dá)顯著高于肺鱗癌,Akt在肺腺癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度、性別無關(guān),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。PI3K、Akt表達(dá)在肺腺癌的Ⅲ-Ⅳ期明顯高于Ⅰ-Ⅱ期,并且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的與沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)之間有顯著性差異。研究結(jié)果表明Akt蛋白高表達(dá)與肺腺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,可能與肺腺癌患者預(yù)后不良有關(guān)。相關(guān)性分析顯示,RACK1與Akt蛋白之間存在正相關(guān),說明RACK1與Akt蛋白對于肺腺癌的發(fā)生發(fā)展也有促進(jìn)作用。

綜上,RACK1高表達(dá)促進(jìn)了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移,并且PI3K/Akt信號通路在其中發(fā)揮了重要作用。然而,對RACK1在腫瘤中的作用尚處于研究階段,作用機(jī)制尚不明確,RACK1是如何通過PI3K/Akt信號通路在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮作用尚不明了,有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)階段,靶向治療成為研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題,RACK1可能成為肺腺癌治療的新靶點(diǎn),從而在肺腺癌治療中發(fā)揮重要作用。

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Expression of RACK1,PI3K and Akt in human non-small cell lung cancer and significance

JIANG Xia1,2,MI Xiaofang3,ZHENG Huixia3,LIANG Jianfang3,XIAO Hong3*
(1DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicine,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2DepartmentofEndocrinology,YunchengCentralHospital;3DepartmentofPathology,FirstClinicalMedicalCollege,ShanxiMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:xiaohonghong9999@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of RACK1,PI3K and Akt in human non-small cell lung cancer and its clinical significance.MethodsExpression of RACK1,PI3K and Akt was detected by immunohistochemistry Envision assay in 127 specimens of lung tissues including 45 cases of cancer adjacent tissues and 82 cases of non-small cell lung cancer tissues.ResultsThe positive expression of RACK1,PI3K and Akt proteins in lung adenocarcinoma tissues was significantly higher than that in cancer adjacent tissues(P<0.05).The expression of RACK1 and Akt in lung adenocarcinoma was significantly different among different lymph node metastasis or TNM stages(P<0.05),but there was no significant difference between different tumor differentiation or sex(P>0.05).PI3K positive expression was significantly associated with different tumor differentiation,lymph node metastasis and TNM stages (P<0.05),but not with sex (P>0.05).The expression of RACK1 was positively correlated with PI3K and Akt expression in lung adenocarcinoma,respectively(P<0.05).ConclusionThe expression of RACK1,PI3K and Akt proteins is significantly high in non-small cell lung cancer tissues,especially in lung adenocarcinoma,which may be related to the synergic promotion effect of RACK1 PI3K and Akt on the cell proliferation.

RACK1； PI3K； Akt； non-small cell lung cancer

姜霞,女,1977-11生,學(xué)士,主治醫(yī)師

2016-12-23

R734.2

A

1007-6611(2017)05-0454-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.011