付西峰,董秀山,高 飛,趙海潮(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西大醫(yī)院普通外科,太原 030032;通訊作者,E-mail:fxfyisheng@163.com)

成纖維生長(zhǎng)因子2在胰腺癌中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制

付西峰*,董秀山,高 飛,趙海潮
(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西大醫(yī)院普通外科,太原 030032;*通訊作者,E-mail:fxfyisheng@163.com)

目的 探討成纖維生長(zhǎng)因子2(FGF2)在胰腺癌中的表達(dá)及對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制。 方法 收集62例患者的胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌(PDAC)組織和癌旁正常胰腺(NP)組織,免疫組化法檢測(cè)癌組織和癌旁正常胰腺組織中FGF2的表達(dá)。將RPMI 1640培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞PANC-1分為4組:對(duì)照組、FGF2組、FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組。Western blot及RT-PCR分別檢測(cè)palladin和Akt的蛋白及mRNA表達(dá)。Transwell小室細(xì)胞侵襲活性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組PANC-1細(xì)胞侵襲和遷移的能力。 結(jié)果 免疫組化顯示,胰腺癌組織中FGF2表達(dá)率81%(50/62)高于癌旁正常組織的10%(2/20,P<0.05),且胰腺癌中FGF2表達(dá)與腫瘤的分化程度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),與患者性別、年齡和腫瘤部位無(wú)關(guān)(P>0.05)。Western blot測(cè)定顯示:FGF2組palladin和p-Akt的蛋白表達(dá)高于其他組(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:FGF2組palladin和p-Akt的mRNA表達(dá)高于其他組(P<0.05)。Transwell小室侵襲活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FGF2組侵襲細(xì)胞數(shù)高于其他組(P<0.05),FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組侵襲細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組和FGF2組(P<0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:FGF2組細(xì)胞遷移率高于其他組(P<0.05),FGFR2+AZD4547組和FGFR2+LY294002組細(xì)胞遷移率低于對(duì)照組和FGF2組(P<0.05)。 結(jié)論 FGF2在胰腺癌組織中高表達(dá),與胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),其機(jī)制可能是FGF2與其受體FGFR2結(jié)合后活化PI3K/Akt信號(hào)通路,激活并提高palladin的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移活動(dòng)。

成纖維生長(zhǎng)因子2； 胰腺癌； 侵襲； 轉(zhuǎn)移

胰腺癌是具有高度侵襲性的惡性腫瘤,由于其早期浸潤(rùn)、快速轉(zhuǎn)移的特征,患者往往預(yù)后不良,臨床治愈率低,總體生存率不到6%[1],探討胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,了解其侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制具有重要意義。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor 2,FGF2)在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已受到廣泛關(guān)注。FGF2與其受體(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)結(jié)合后可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過(guò)程[2],而FGF2在胰腺癌中的表達(dá)及其作用的下游底物尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞支架蛋白palladin高度表達(dá)于胰腺癌組織中,且與胰腺癌組織的分化及侵襲轉(zhuǎn)移等有關(guān)[3]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)通路磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinases,PI3K/Akt)可激活palladin,維持其穩(wěn)定性并促進(jìn)其表達(dá)[4]。作為促細(xì)胞生長(zhǎng)因子的FGF2,FGF2能否通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路激活并誘導(dǎo)palladin表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,有待于深入研究。本研究擬觀察FGF2在胰腺癌組織中的表達(dá)情況,并觀察給予FGF2對(duì)體外培養(yǎng)的PANC-1細(xì)胞侵襲、遷移以及palladin表達(dá)的影響,探討FGF2在促進(jìn)胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,為臨床上胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

收集2008-10～2015-06在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普通外科和山西大醫(yī)院普通外科進(jìn)行胰腺癌手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)的標(biāo)本62例,包括相應(yīng)的20例距腫瘤邊緣2 cm以上的正常胰腺(normal pancreas,NP)組織標(biāo)本。62例PDAC標(biāo)本中,男性38例,女性24例,年齡(53±10)歲,其中胰頭癌39例,胰體/尾癌23例,患者術(shù)前未行任何抗腫瘤治療。按照國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)分類標(biāo)準(zhǔn)分為:低分化24例,中分化20例,高分化18例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。按照TNM分期分為:Ⅰ-Ⅱ期25例,Ⅲ-Ⅳ期37例。所有上述標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定,石蠟包埋。本研究已經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn),并獲得患者及其家屬的知情同意。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞,購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所;重組人FGF2購(gòu)自英國(guó)Peprotech公司;兔抗人FGF2多克隆抗體、兔抗人p-Akt(ser-473)單克隆抗體和兔抗人palladin多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;山羊抗兔IgG、免疫組化SP試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Transwell小室(24孔,0.8 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;FGFR2抑制劑(AZD4547)、PI3K/Akt特異性抑制劑(LY294002)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物科技有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)FGF2表達(dá)及結(jié)果判定

上述標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片,分別行HE染色和免疫組化染色,參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定,以細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為FGF2陽(yáng)性表達(dá)。參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[3],每個(gè)光學(xué)高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,根據(jù)染色面積和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:①染色面積:0分,0-10%;1分,11%-25%;2分,26%-50%;3分,大于50%。②染色強(qiáng)度:0分,陰性;1分,偏弱;2分,偏中;3分,偏強(qiáng)。染色面積和染色強(qiáng)度的評(píng)分相加即FGF2染色的分級(jí):≤3分為FGF2低表達(dá);>3分為FGF2高表達(dá)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

將胰腺癌細(xì)胞PANC-1接種于RPMI 1640(每毫升含100 U青霉素和100 U鏈霉素)培養(yǎng)液中,37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔1 d換液1次。細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底80%,用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h,隨后即分為4組:對(duì)照組(C組,細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)液中生長(zhǎng))、FGF2組(于培養(yǎng)液中加入FGF2 75 ng/ml)、AZD4547組(FGFR2+AZD4547組,在加入FGF2 75 ng/ml的基礎(chǔ)上加入3.0 nmol/L的AZD4547)、LY294002組(FGFR2+LY294002組,在加入FGF2 75 ng/ml的基礎(chǔ)上加入10 μmol/L的LY294002)。四組分別進(jìn)行Western blot測(cè)定、RT-PCR檢測(cè)和Transwell小室細(xì)胞侵襲活性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot測(cè)定p-Akt和palladin蛋白表達(dá)

提取PANC-1細(xì)胞總蛋白,BCA定量蛋白質(zhì),各樣本蛋白分別取50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白,采用電泳轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。封閉2 h分別加入一抗兔抗人p-Akt(ser-473)單克隆抗體和兔抗人palladin多克隆抗體孵育過(guò)夜,次日洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育。漂洗后進(jìn)行化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng),洗片后掃描電泳條帶。用Image J軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析,以目的條帶與內(nèi)參β-actin灰度值的比值代表該蛋白的表達(dá)水平。

1.6 RT-PCR檢測(cè)Akt mRNA和palladin mRNA的表達(dá)

按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作，用Trizol試劑盒提取mRNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行palladin和Akt的基因擴(kuò)增。以β-actin作為內(nèi)參照。palladin上游引物5′-GCATCAGAG CTGACCTCAAC-3′，下游引物5′-GGTTGATCACCGAGGCTA AT-3′，片段長(zhǎng)度332 bp；Akt上游引物5′-GCGACAGTGGCTATTGTGA-3′，下游引物5′-AGCTGCTCAAAGATGC CATT-3′，片段長(zhǎng)度232 bp；β-actin上游引物：5′-GTCAGTGCATCACTACT GGCAAT-3′，下游引物：5′-CGATCTGGTAG GGCCTTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度312 bp。PCR反應(yīng)體系50 μl，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，活化Tag酶；94 ℃變性15 s，55 ℃退火及延伸60 s，45個(gè)循環(huán)結(jié)束。采用2-ΔΔct計(jì)算palladin mRNA和Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

將PANC-1細(xì)胞接種于24孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。采用Transwell小室檢測(cè)PANC-1細(xì)胞的侵襲能力,將50 μl的Matrigel溶液鋪于上下室之間的聚碳酸酯微孔膜上,再分別加入100 μl和600 μl的RPMI 1640培養(yǎng)基。各組PANC-1細(xì)胞經(jīng)洗滌、消化后按照104/孔接種于小室上層,24 h觀察膜及孔下的細(xì)胞數(shù),甲醛固定,PBS漂洗,0.5%結(jié)晶紫染液室溫作用10 min。顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù),每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野,取其平均值。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定PANC-1細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞接種于6孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用微量移液器的槍頭在培養(yǎng)基中劃一橫隔。PBS后洗去劃下的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基。0 h和24 h取樣,倒置顯微鏡下拍照。每個(gè)樣品取5個(gè)視野測(cè)量距離。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FGF2在PDAC及NC組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,在癌旁正常胰腺組織中FGF2有微量表達(dá),染色較淺(見(jiàn)圖1A、C)。在胰腺癌組織中FGF2高表達(dá),在胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),主要定位于細(xì)胞質(zhì),表現(xiàn)為深棕色顆粒(見(jiàn)圖1B、D)。依據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),FGF2在20例NP組織中高表達(dá)2例,低表達(dá)18例,FGF2蛋白高表達(dá)率為10%;FGF2在62例PDAC組織中高表達(dá)50例,低表達(dá)12例,FGF2蛋白高表達(dá)率為81%。PDAC組織中FGF2蛋白高表達(dá)率顯著高于NP組織(χ2=32.529,P<0.000 1)。

A，C分別為正常胰腺(NP)組織HE×100、HE×400；B，D分別為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌(PDAC)組織HE×100、HE×400圖1 不同胰腺組織FGF2蛋白的表達(dá)Figure1 TheexpressionofFGF2indifferentpancreatictissues

2.2 PDAC組織中FGF2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

將FGF2免疫組化染色結(jié)果與患者的性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行χ2檢驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。FGF2表達(dá)與患者的性別、年齡和腫瘤部位無(wú)關(guān)(P>0.05),與腫瘤的分化程度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

表1 胰腺癌組織中FGF2蛋白表達(dá)水平與臨床病理因素之間的關(guān)系 例(%)

Table 1 Relationship between the expression of FGF2 in pancreatic adenocarcinoma tissues and clinical pathological factors cases(%)

臨床病理因素nFGF2低表達(dá)高表達(dá)χ2P性別0 1810 468 男38830 女24420年齡0 2230 462 ≤55歲19316 >55歲43934腫瘤部位2 6620 094 胰頭391029 胰體/尾23221分化程度21．300<0．0001 高分化18108 中分化20119 低分化24123TNM分期7 4360 008 Ⅰ/Ⅱ25916 Ⅲ/Ⅳ37334淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7 2760 008 +32230 -301020遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移5 2000 019 +13013 -491237

2.3 Western blot及RT-PCR結(jié)果分析

Western blot測(cè)定結(jié)果顯示,對(duì)照組、AZD4547組和LY294002組,palladin蛋白和p-Akt蛋白僅有微量表達(dá),而FGF2組palladin蛋白和p-Akt蛋白表達(dá)明顯高于其他組,RT-PCR也得到了同樣的變化趨勢(shì)。對(duì)照組、FGF2組、AZD4547組、LY294002組的palladin蛋白表達(dá)水平分別為0.19±0.05,0.97±0.04,0.16±0.04,0.16±0.05(F=741.878,P<0.000 1);p-Akt蛋白表達(dá)水平分別為0.25±0.06,1.22±0.07,0.20±0.03,0.20±0.05(F=862.371,P<0.000 1);對(duì)照組、FGF2組、AZD4547組、LY294002組的palladin mRNA表達(dá)水平分別為0.51±0.08,1.19±0.10,0.54±0.08,0.52±0.07(F=161.040,P<0.000 1),Akt mRNA表達(dá)水平分別為0.38±0.08,1.36±0.07,0.32±0.04,0.34±0.06(F=587.684,P<0.000 1),四組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖2及表2)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中p-Akt及palladin蛋白的表達(dá)Figure 2 The expression of p-Akt and palladin in different groups by Western blot

2.4 腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Transwell小室侵襲活性實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PANC-1細(xì)胞使用FGF2處理后,侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率增加,而分別給予FGFR2抑制劑AZD4547和PI3K/Akt抑制劑LY294002后,細(xì)胞遷移數(shù)量和細(xì)胞遷移率受到明顯的抑制。FGF2組侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率明顯高于其他三組(P<0.05),而AZD4547組和LY294002組侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率較對(duì)照組和FGF2組降低(P<0.05,見(jiàn)圖3、4和表2)。

組別侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))細(xì)胞遷移率(%)Palladin表達(dá)Akt表達(dá)蛋白mRNA蛋白mRNA對(duì)照組71±933±40 19±0 050 51±0 080 25±0 060 38±0 08FGF2組101±9a74±6a0 97±0 04a1 19±0 10a1 22±0 07a1 36±0 07aAZD4547組41±6ab10±2ab0 16±0 04b0 54±0 08b0 20±0 03b0 32±0 04bLY294002組35±5ab13±3ab0 16±0 05b0 52±0 07b0 20±0 05b0 34±0 06b

與對(duì)照組比較,aP<0.05;與FGF2組比較,bP<0.05

A．對(duì)照組B．FGF2組C．AZD4547組D．LY294002組圖3 各組細(xì)胞的Transwell小室侵襲活性實(shí)驗(yàn)(0．5%結(jié)晶紫染色，×200)Figure3 TheinvasioncellnumberinfourgroupsbyTranswellchamberassay(×200)

圖4 各組PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞劃痕圖 (×200)Figure 4 The migration rate of PANC-1 cells in different groupby wound healing assay (×200)

3 討論

早期侵襲和迅速轉(zhuǎn)移是胰腺癌最重要的生物學(xué)特性之一,如何在胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制中找到突破口,尚沒(méi)有明確的答案。近年來(lái),促細(xì)胞生長(zhǎng)因子和腫瘤發(fā)生的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn),促細(xì)胞生長(zhǎng)因子與其特異性受體相結(jié)合后,激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和血管生成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]。作為促生長(zhǎng)因子之一的FGF2,在乳腺癌、胃癌、甲狀腺癌等組織中已被發(fā)現(xiàn)有較高水平的表達(dá)量,且異常的FGF2/FGF2R信號(hào)通路可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,7],而對(duì)于FGF2在胰腺癌組織中的表達(dá)及在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)了FGF2在胰腺癌組織中的表達(dá),結(jié)果表明,FGF2高表達(dá)于PDA對(duì)照組織中,而在癌旁正常組織中僅有微量表達(dá),且FGF2表達(dá)與腫瘤組織的分化程度、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),由此推測(cè)FGF2可能參與了胰腺癌的發(fā)病過(guò)程。FGF2又是通過(guò)具體什么機(jī)制作用于胰腺癌細(xì)胞并對(duì)其發(fā)揮作用呢?

研究發(fā)現(xiàn),多種腫瘤細(xì)胞中存在FGF/FGFR家族介導(dǎo)的信號(hào)通路的異常激活,而這些信號(hào)通路又可以激活下游蛋白,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8,9]。PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)一條經(jīng)典的抗細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其存活的信號(hào)通路,該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路若發(fā)生異常,可引起細(xì)胞異常增殖從而發(fā)生腫瘤,PI3K/Akt已被證實(shí)參與了大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10,11]。而FGF2與具有酪氨酸激酶活性的FGFR2受體結(jié)合后,可引起FGFR2自身磷酸化,然后通過(guò)調(diào)節(jié)亞基與PI3K結(jié)合使PI3K活化,進(jìn)一步引起Akt的磷酸化,而磷酸化后的p-Akt具有龐大的下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[12]。本研究繼續(xù)通過(guò)在細(xì)胞水平上檢測(cè)了FGF2對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的作用,結(jié)果表明,FGF2單獨(dú)作用于PANC-1時(shí),可明顯促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲,分別給予FGF2的受體(FGFR2)抑制劑AZD4547及PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002后,細(xì)胞的侵襲和遷移活動(dòng)較對(duì)照組和FGF2組有了明顯的抑制。由此提示,FGF2可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路而促進(jìn)PANC-1細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

蛋白palladin存在于多種組織細(xì)胞中,參與細(xì)胞的組裝與重構(gòu),在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲遷移中起到關(guān)鍵作用。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)palladin在胰腺癌組織中高表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移活動(dòng)相關(guān)[3],而調(diào)控palladin表達(dá)的上游分子信號(hào)機(jī)制未明確。研究表明,PI3K/Akt可通過(guò)加強(qiáng)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲重構(gòu)而促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),若給予PI3K/Akt抑制劑降低Akt的磷酸化水平,細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力下降[13]。而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)是腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的前提,palladin作為一種肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白,PI3K/Akt可激活palladin并促進(jìn)其表達(dá),進(jìn)而增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲與遷移[4]。本研究結(jié)果表明,Akt和palladin的表達(dá)在單獨(dú)給予FGF2時(shí)較對(duì)照組有明顯升高,但在分別給予FGFR2抑制劑及PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑后,Akt和palladin的表達(dá)與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯變化,但卻比FGF2組明顯降低。由此推測(cè),FGF2可能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)途徑引起Akt磷酸化加強(qiáng),進(jìn)一步激活palladin并提高其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,引起其侵襲和遷移活動(dòng)增強(qiáng)。

綜上所述,FGF2在胰腺癌組織中高表達(dá),且與腫瘤組織的分化、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而FGF2促進(jìn)胰腺癌發(fā)生的機(jī)制,可能是FGF2通過(guò)與其受體FGFR2結(jié)合后活化PI3K/Akt信號(hào)通路,作用于palladin蛋白,促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),進(jìn)而促進(jìn)的腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移活動(dòng)。FGF2有望成為臨床上胰腺癌治療的新靶點(diǎn)。

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Expression of fibroblast growth factor 2 in pancreatic ductal adenocarcinoma tissues and its effects on invasion and metastasis of PANC-1

FU Xifeng*,DONG Xiushan,GAO Fei,ZHAO Haichao
(DepartmentofGeneralSurgery,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Taiyuan030032,China;*Correspondingauthor,E-mail:fxfyisheng@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of fibroblast growth factor 2(FGF2) in pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) tissues and its role in the invasion and metastasis of PANC-1.MethodsImmunohistochemistry assay was performed to detect the expression of FGF2 in 62 cases of PDAC tissues and corresponding adjacent normal pancreas(NP) tissues. The human pancreatic cancer PANC-1 cells were cultured in RPMI 1640 culture medium.The cells were randomly divided into 4 groups:control group,FGF2 group,FGF2+AZD4547 group and FGF2+LY294002 group. Western blot analysis and RT-PCR were performed respectively to detect the expression of palladin and Akt in PANC-1 cells. Transwell chamber assay and wound healing assay were applied to determine the invasive activity and the migration of PANC-1 cells respectively.ResultsImmunohistochemical staining showed that FGF2 was highly expressed in PDAC tissues. The rate of FGF2 expression was 81%(50/62) in PDAC tissues,significantly higher than that of NP tissues (10.0%,2/20) (P<0.05). And FGF2 expression was correlated with the degree of tumor differentiation,clinical TNM classification,lymph node metastasis and distant metastasis in pancreatic tissues(P<0.05),but not related with patient’s sex,age and tumor location(P>0.05). Western blot analysis revealed that the relative expression of FGF2 and p-Akt in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05). RT-PCR results showed that the relative expression of FGF2 mRNA and Akt mRNA in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05). Transwell chamber assay showed that the invasion cells numbers in FGF2 group were higher than that in other groups(P<0.05). The invasion cells numbers in AZD4547 group and LY294002 group were lower than that in control group and FGF2 group(P<0.05). The wound healing assay showed that the migration rate in FGF2 group was higher than that in the other groups(P<0.05).The migration rates in AZD4547 group and LY294002 group were lower than that in control group and FGF2 group(P<0.05).ConclusionFGF2 is highly expressed in PDAC tissues,and is related to invasion and metastasis of PDAC. FGF2 could enhance the invasion and migration of pancreatic tumor cells by binding to its receptor FGFR2 for activating PI3K/Akt signaling pathway and activating and highly expressing palladin.

fibroblast growth factor 2； pancreatic ductal adenocarcinoma； invasion； metastasis

山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015011131)

付西峰,男,1974-07生,碩士,副主任醫(yī)師,E-mail:fxfyisheng@163.com

2017-02-15

R735.9

A

1007-6611(2017)05-0426-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.005