張晶敏，魏青青，馬 琳，呂曉瑞，江金花，王慶端(河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南省肝病藥理重點實驗室，鄭州 45005；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部；通訊作者，E-mail:wangqd@zzu.edu.cn)

鹽酸千金藤堿對HepG2.2.15細(xì)胞HBX/NF-κB通路的影響

張晶敏1,2，魏青青1，馬 琳1，呂曉瑞1，江金花1，王慶端1*
(1河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南省肝病藥理重點實驗室，鄭州 450052；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部；*通訊作者，E-mail:wangqd@zzu.edu.cn)

目的 探討鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride，CH)對HepG2.2.15細(xì)胞HBX/NF-κB信號通路的影響。 方法 選用不同濃度的CH(2.5，5，10 μmol/L)干預(yù)穩(wěn)定表達(dá)野生型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的HepG2.2.15細(xì)胞后，采用RT-PCR和ELISA法分別檢測細(xì)胞內(nèi)X基因 mRNA和X蛋白表達(dá)變化；采用Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測細(xì)胞的凋亡率，Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路成員P65和IκBα蛋白表達(dá)。 結(jié)果 與未經(jīng)CH處理的HepG2.2.15細(xì)胞(對照組)相比，CH各劑量組明顯抑制細(xì)胞內(nèi)X基因mRNA和X蛋白的表達(dá)(P<0.05)。CH干預(yù)細(xì)胞48 h能夠濃度依賴性地誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞凋亡，2.5，5，10 μmol/L CH處理細(xì)胞后，HepG2.2.15細(xì)胞平均凋亡率分別為(11.9±1.21)%，(19.8±2.32)%，(29.3±1.27)%。CH處理組細(xì)胞內(nèi)IκBα蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組，且P65蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P均<0.05)。 結(jié)論 CH能夠抑制HBX/NF-κB信號通路的活性，并具有促進(jìn)HepG2.2.15細(xì)胞凋亡的作用。

鹽酸千金藤堿； 乙型肝炎病毒； HBV X蛋白； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB； HepG2.2.15細(xì)胞

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的慢性乙型肝炎嚴(yán)重威脅人類健康，全球有超過2.4億HBV s 抗原(HBsAg)陽性者[1]。HBV慢性感染與肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2,3]。目前，治療乙肝的抗病毒藥物主要包括干擾素和核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)兩大類。干擾素具有骨髓抑制和肝功能損害等不良反應(yīng)，且不適用于免疫功能不全的患者，HBV e 抗原(HBeAg)血清轉(zhuǎn)換率僅有30%-40%，HBsAg清除率低于10%，臨床應(yīng)用受到很大限制[4]。NAs作用機制基本明確，但不能完全清除體內(nèi)的病毒，只能最大限度地抑制病毒的復(fù)制，需長期用藥。耐藥HBV尤其是多藥耐藥HBV突變體的出現(xiàn)削弱了多種NAs的臨床效果，成為臨床治療乙肝的一大挑戰(zhàn)[5]。因此，研究和發(fā)現(xiàn)新型有效的抗HBV藥物至關(guān)重要[6]。中草藥治療乙肝是我國特有的有效治療手段，從天然藥物中尋找作用機制不同于核苷(酸)類似物的抗HBV有效成分是研究新型抗HBV藥物的有效途徑。

鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH)是從千金藤屬植物塊根中提取、分離、成鹽而得的一種雙芐基異喹啉類生物堿。國內(nèi)外研究證實其具有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、抗人類免疫缺陷病毒、抗急性呼吸道綜合征冠狀病毒等多種生物學(xué)活性[7-12]。CH對多種炎癥及有炎癥反應(yīng)進(jìn)程的相關(guān)疾病如膿毒癥、乳腺炎、急性肺損傷、腎缺血再灌注損傷以及糖尿病腎病等的作用機制主要為抑制炎癥細(xì)胞活性和炎癥因子的釋放，均涉及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路[13-17]。NF-κB受HBV X蛋白(HBx)的反式激活，被活化后，一方面作用于病毒基因調(diào)控區(qū)促進(jìn)病毒自身復(fù)制，另一方面作用于其下游基因或原癌基因κB位點，使原癌基因過表達(dá)。HBx蛋白對啟動和維持感染后病毒復(fù)制必不可少[18]。

研究發(fā)現(xiàn)CH能有效抑制野生型和拉米夫定耐藥性HBV的表達(dá)和復(fù)制[19,20]。本研究利用HepG2.2.15細(xì)胞，觀察CH對HBX/NF-κB通路的影響，為揭示其抗HBV的作用機制和臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2.2.15細(xì)胞株由暨南大學(xué)王一飛教授惠贈，河南省肝病藥理重點實驗室(以下簡稱本實驗室)液氮保存。培養(yǎng)液為含10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，用時加G418(Geneticin,遺傳霉素)至終濃度為200 mg/L。培養(yǎng)條件為37 ℃，飽和濕度及5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，每3-4 d傳代1次。

1.2 主要試劑

CH粉末由本實驗室研制，純度>98.5%；Annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì))；HBXAg抗原診斷試劑盒(美國R&D公司)；細(xì)胞核和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(上海生工公司)；預(yù)染蛋白Marker，(美國Genview公司)；β-actin多克隆抗體(北京中杉金橋公司)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；NF-ΚB p65多克隆抗體、IκBα多克隆抗體、HRP標(biāo)記IgG、BCA蛋白測定試劑盒均為北京博奧森公司產(chǎn)品；引物、RT-PCR試劑盒由大連寶生物合成和提供。

1.3 RT-PCR和ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)X基因mRNA和X蛋白的表達(dá)

收集對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，以2×104個/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，棄去上清。實驗組加入含CH的培養(yǎng)液(終濃度分別為2.5，5，10 μmol/L)?？瞻讓φ战M加入等體積培養(yǎng)液。每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，每3 d更換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)9 d。棄上清，0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，按試劑盒說明分別提取細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)，測定各組樣品純度及濃度。取1 μg 總RNA作為模板，按RT-PCR試劑盒說明操作，引物如下：HBV X基因正向：5′-TCTCAGCAATGTCAACGAC -3′；反向：5′-TTTATGCCTACAGCCTCCT-3′；擴增產(chǎn)物92 bp。β-actin基因正向：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′；反向:5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′；擴增產(chǎn)物268 bp；PCR產(chǎn)物經(jīng)3% 瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。用Quantity One 4.2進(jìn)行光密度測定，以目的基因(X)與內(nèi)參(β-actin)光密度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。蛋白樣品按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行，酶聯(lián)免疫檢測儀測定OD450值，并根據(jù)下公式計算抑制率：

抑制率=(1-實驗孔OD值/對照孔OD值)×100%。

1.4 FCM(AnnexinⅤ/PI雙染法)檢測細(xì)胞凋亡率

收集對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞，以1.5×105個/孔接種于6孔板中。實驗分組同1.3部分，加藥培養(yǎng)48 h消化并收集細(xì)胞，按Annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒說明書操作，加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI，混勻，室溫避光孵育5 min后，立即用流式細(xì)胞儀檢測，用Cell Quest 軟件分析細(xì)胞凋亡和死亡情況。

1.5 Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)IκBα和P65蛋白的表達(dá)

收集對數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞，以1.5×105個/孔接種于6孔板中。實驗分組同1.3部分，加藥培養(yǎng)48 h消化并收集細(xì)胞，按試劑盒操作提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定樣品的濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入抗p65、抗IκBα多克隆抗體(均稀釋300倍)，4 ℃過夜后洗膜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG(稀釋5 000倍)室溫孵育后脫色，ECL顯影成像。每組實驗重復(fù)3次，采用 Quantity one軟件對各組蛋白條帶光密度進(jìn)行測定，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶光密度的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CH對細(xì)胞內(nèi)X基因mRNA和X蛋白表達(dá)的影響

采用RT-PCR檢測了HepG2.2.15細(xì)胞中X 基因 mRNA的表達(dá)，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行分析。由圖1可看出，與對照組相比，CH處理組HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV X mRNA的表達(dá)均明顯下降(P<0.05)。X基因mRNA表達(dá)隨 CH濃度增加而降低，表明CH在轉(zhuǎn)錄水平干擾HBV X 基因mRNA的合成。

1.對照組；2.CH 10 μmol/L；3.CH 5 μmol/L；4.CH 2.5 μmol/LA.X基因及內(nèi)參電泳結(jié)果

經(jīng)ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)X蛋白的表達(dá)，可以看出：與對照組相比，CH 各濃度處理組，細(xì)胞內(nèi)X蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05，見表1)。結(jié)果表明CH在一定程度上抑制HepG2.2.15 細(xì)胞X蛋白的表達(dá)。

組別OD450值抑制率(%)對照組0．621±0．014-10μmol/L組0．253±0．008??59．27±1．82??5μmol/L組0．389±0．010?37．34±1．63?2．5μmol/L組0．425±0．013?31．49±2．60?

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 CH對HepG2.2.15細(xì)胞凋亡的影響

在流式細(xì)胞術(shù)雙參數(shù)散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞(Annexin Ⅴ-/PI-)；右下象限顯示凋亡細(xì)胞(FITC+/PI-)；右上象限為凋亡后期的繼發(fā)性壞死細(xì)胞(FITC+/PI+)。細(xì)胞凋亡率=(凋亡細(xì)胞+繼發(fā)性壞死細(xì)胞)/全部細(xì)胞×100%。 AnnexinⅤ-/PI雙染法結(jié)果顯示，對照組HepG2.2.15細(xì)胞無明顯凋亡，經(jīng)不同濃度CH處理48 h后，細(xì)胞凋亡率明顯增加。2.5，5，10 μmol/L 的CH處理細(xì)胞后，HepG2.2.15細(xì)胞凋亡率分別為(11.9±1.21)%、(19.8±2.32)%、(29.3±1.27)%(見表2、圖2)。

組別早期凋亡細(xì)胞(%)晚期凋亡細(xì)胞(%)凋亡率(%)對照組4．5±0．582．6±0．427．1±0．692．5μmol/L組0．9±1．2311．0±0．7311．9±1．21?5μmol/L組10．6±1．579．2±0．9319．8±2．32??10μmol/L組17．0±1．3312．3±0．8329．3±1．27??

與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 CH對細(xì)胞內(nèi)IκBα和P65蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測CH對HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)IκBα和P65蛋白表達(dá)的影響，結(jié)合Western blot檢測結(jié)果和蛋白表達(dá)灰度值分析可以看出，與對照組相比， 10，5，2.5 μmol/L CH組細(xì)胞胞質(zhì)IκBα蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)，而胞核 P65蛋白表達(dá)均明顯減少(P<0.05,見圖3)，且均呈劑量依賴性。

圖2 CH對HepG2.2.15細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effects of CH on HepG2.2.15 cell apoptosis

1．對照組；2．10μmol/LCH；3．5μmol/LCH；4．2．5μmol/LCHA．Westernblot結(jié)果與對照組比較，?P<0．05，??P<0．01B．蛋白定量分析圖3 CH對HepG2．2．15細(xì)胞內(nèi)IκBα和P65蛋白表達(dá)的影響(n=3)Figure3 EffectsofCHonproteinexpressionofIκBαandP65inHepG2．2．15cells(n=3)

3 討論

HBV是目前已知可感染人類并具有獨立復(fù)制能力的雙鏈DNA病毒中最小的病毒，其基因組僅含3 200 bp，屬于嗜肝DNA病毒科，具有S、C、P和X四個開放閱讀框。HBV X基因是HBV基因組中最小的一個，在不同亞型的HBV中其序列大小有所不同。X基因位于位于C基因的上游，與P基因、pre-C基因相互重疊。HBx是由X基因編碼的一種多功能蛋白，具有多種生物活性，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等，在維持HBV復(fù)制、肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展和機體的免疫調(diào)節(jié)中起到重要的作用[21-23]。在乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌中，X蛋白與共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)相互作用，相互影響，cccDNA可能通過增加HBx的表達(dá)進(jìn)而致癌，HBx通過調(diào)控cccDNA的轉(zhuǎn)錄，使得HBV的復(fù)制處于活躍狀態(tài)[24]。作為病毒與機體感染、致癌之間的交叉點，HBx的作用越來越受到重視。ALnylam制藥公司以HBx開放閱讀框的一個位點為靶點設(shè)計的siRNA偶聯(lián)物ALN-HBV，可介導(dǎo)特異性、強力和持久的HBV轉(zhuǎn)錄沉默和HBsAg表達(dá)沉默[25]。另外由GlobeImmune和Gilead公司合作開發(fā)的治療性疫苗GS-4774，包含來自HBx的60個氨基酸以及整個L型HBsAg和HBcAg。該藥物主要通過聯(lián)合其他抗HBV治療，激發(fā)針對含HBV抗原細(xì)胞的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，提高CHB患者治療的應(yīng)答率[26]。

目前許多中藥制劑已被用作對乙肝的治療或輔助治療。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)CH體外明顯抑制野生型和拉米夫定耐藥性HBV上清中抗原的分泌和DNA的復(fù)制[19,20]。CH良好的抗HBV生物學(xué)活性為其進(jìn)一步開發(fā)為新型抗HBV藥物奠定了良好的基礎(chǔ)。本實驗以穩(wěn)定表達(dá)野生型HBV的HepG2.2.15細(xì)胞為模型，通過檢測發(fā)現(xiàn)CH能夠濃度依賴性地抑制X基因mRNA和蛋白的表達(dá)，提示CH對病毒編碼的X蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯環(huán)節(jié)均有抑制作用。X蛋白參與的細(xì)胞凋亡直接或間接地影響HBV的復(fù)制和病毒顆粒的包裝。FCM實驗顯示CH能誘導(dǎo)HepG2.2.15細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度的增加，凋亡比率逐漸上升，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等生理過程一樣，對維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分重要。凋亡的缺陷會從多方面導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。許多病毒基因組的編碼產(chǎn)物可通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡，延長被感染宿主細(xì)胞生命，從而有利于病毒的復(fù)制、擴散、持續(xù)感染和對免疫應(yīng)答的逃避[27,28]。NF-κB通路被認(rèn)為是HBx蛋白抑制凋亡的潛在機制，同時也被稱為人類免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)劑，在機體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，是真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中關(guān)鍵的調(diào)控因子[29,30]。NF-κB被激活后引起的細(xì)胞凋亡的抑制可能與病毒復(fù)制及病毒顆粒的包裝釋放有關(guān)。

本實驗采用Western blot檢測經(jīng)藥物處理后的HepG2.2.15細(xì)胞中NF-κB的抑制因子IκBα和其二聚體P65蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CH能上調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中IκBα的表達(dá)，減少P65蛋白入核，從而降低了NF-κB活性，提示CH誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用可能與其抑制HBX/NF-κB信號通路相關(guān)。但HBV感染是一個多步驟、多環(huán)節(jié)的慢性過程，從HBX/NF-κB信號通路角度探討CH抗HBV復(fù)制和促細(xì)胞凋亡的作用，只是研究抗HBV藥物機制中的一個點。CH對病毒編碼的X蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯環(huán)節(jié)的抑制作用以及對宿主細(xì)胞NF-κB信號通路下游相關(guān)凋亡因子的影響仍有待于進(jìn)一步研究。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)CH抗HBV的作用可能與其抑制宿主熱應(yīng)激同源蛋白70(heat stress cognate 70,Hsc70)的表達(dá)有關(guān)[20]。研究揭示NF-κB p65蛋白作為一種高度靈活的蛋白，不會固定某一狀態(tài)，但是在NF-κB活化后具有承受動態(tài)變化的能力，而在這個過程中HSP70/HSC70家族發(fā)揮著重要作用，它能夠控制蛋白重排的保真度，因此對HSP70/HSC70的藥理學(xué)抑制能夠影響p65觸發(fā)基因的表達(dá)[31]。另外研究發(fā)現(xiàn)HSC70通過阻斷IκBα的磷酸化減弱脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的NF-κB亞基P65的核易位，以及抑制LPS所致的MAPKs的激活，發(fā)揮其抗炎作用，使機體能夠抵御LPS導(dǎo)致的心肌和肝功能異常等問題[32]。那么在CH抗HBV作用中HSC70與HBX/NF-κB通路的關(guān)系，以及具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及途徑還需要進(jìn)一步的實驗研究。

綜上所述，CH通過抑制HBX/NF-κB信號通路的活化，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，繼而對病毒的復(fù)制及病毒顆粒包裝釋放起到了阻斷作用，可能是其體外抗HBV的重要作用機制。該作用機制的揭示為CH臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)，同時為發(fā)現(xiàn)抗HBV藥物作用靶點和開發(fā)高效低毒的新型藥物提供了一定的基礎(chǔ)。

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Effect of cepharanthine hydrochloride on HBX/NF-κB signal pathway of HepG2.2.15 cells

ZHANG Jingmin1,2，WEI Qingqing1，MA Lin1，Lü Xiaorui1，JIANG Jinhua1，WANG Qingduan1*
(1HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,HenanKeyLaboratoryforPharmacologyofLiverDiseases,Zhengzhou450052,China;2DepartmentofPharmacy,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wangqd@zzu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effect of cepharanthine hydrochloride(CH) on HBX/NF-κB signal pathway of HepG2.2.15 cells stably expressing wide-type HBV.MethodsHepG2.2.15 cells were treated with different concentration of CH(2.5,5,10 μmol/L).Then the expression levels of X gene and X protein of HBV were detected by reverse thanscriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively.Flow cytometry method was used to detect the cell apoptosis rates.The expression levels of IκBα and P65 protein in HepG2.2.15 cells were detected by Western blot.ResultsCompared with HepG2.2.15 cells without CH treament(control group),the expression of X gene mRNA and X protein in HepG2.2.15 cells after treatment with CH(2.5,5,10 μmol/L) were significantly inhibited(P<0.05).The apoptosis retes of HepG2.2.15 cells were (11.9±1.21)%,(19.8±2.32)%,(29.3±1.27)% after treatment with 2.5,5,10 μmol/L CH for 48 h,respectively.CH increased apoptosis rates of HepG2.2.15 cells in a concentration-dependent manner.CH effectively up-regulated the protein expression of IκBα and down-regulated the expression of P65 protein(bothP<0.05).ConclusionCH can inhibit the activity of HBx/NF-κB signal pathway and increase cell apoptosis of HepG2.2.15 cells.

cepharanthine hydrochloride; hepatitis B virus; HBx; NF-κB; HepG2.2.15 cells

張晶敏，女，1986-09生，博士，主管藥師， E-mail:jing2677594@163.com

2016-07-28

R512.6

A

1007-6611(2017)05-0409-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.002