左 軍,吳 霞,湯之銘(陜西省第四人民醫(yī)院內(nèi)科,西安 7004;陜西省西北婦女兒童醫(yī)院內(nèi)科;西安市灞橋區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科;通訊作者,E-mail:070907@qq.com)

高糖誘導(dǎo)H9C2大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能障礙及其機(jī)制

左 軍1,吳 霞2*,湯之銘3
(1陜西省第四人民醫(yī)院內(nèi)科,西安 710043;2陜西省西北婦女兒童醫(yī)院內(nèi)科;3西安市灞橋區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:1070907222@qq.com)

目的 觀察高糖對(duì)H9C2大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響,以探討高糖所致心肌病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。 方法 將H9C2大鼠心肌細(xì)胞分為低濃度組(含5 mmol/L葡萄糖),中濃度組(含15 mmol/L葡萄糖)和高濃度組(含30 mmol/L葡萄糖),實(shí)驗(yàn)干預(yù)12 h。CCK-8檢測(cè)心肌細(xì)胞活力。JC-1檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位。線粒體ROS熒光探針檢測(cè)線粒體ROS水平。Western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C(Cyt C)及cleaved caspase-3表達(dá)水平。 結(jié)果 與低濃度組相比,中濃度組心肌細(xì)胞活力降低14.5%(P<0.05),高濃度組心肌細(xì)胞活力降低26.3%(P<0.01)。低濃度組心肌細(xì)胞維持較高線粒體膜電位水平,中濃度組及高濃度組心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低。與低濃度組相比,中濃度組心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0.05),高濃度組心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平顯著降低(P<0.01)。與低濃度組相比,中濃度組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2、胞質(zhì)內(nèi)Cyt C及cleaved caspase-3表達(dá)明顯升高(P<0.05),高濃度組心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素 C及cleaved caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.01)。 結(jié)論 高糖導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體功能障礙,促進(jìn)了心肌細(xì)胞活力降低,可能是高糖所致心肌病分子機(jī)制之一。

高糖血癥； H9C2； 心肌病； 線粒體功能障礙

高糖血癥是獨(dú)立于高脂血癥、高同型半胱氨酸血癥及高血壓之外,直接影響心臟結(jié)構(gòu)及功能的重要危險(xiǎn)因素[1]。臨床及基礎(chǔ)研究均已證實(shí),高糖能夠直接引起心肌細(xì)胞功能障礙,導(dǎo)致心臟舒張期延長(zhǎng)以及收縮力下降[2,3]。然而,高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷及功能障礙的分子機(jī)制尚不明確。線粒體是維持細(xì)胞存活的重要細(xì)胞器,各種原因?qū)е碌木€粒體功能障礙是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要分子通路[4]。此外,線粒體是ROS產(chǎn)生的重要場(chǎng)所,線粒體功能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,加重氧化應(yīng)激反應(yīng),損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能[5]。高糖是否誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體功能障礙,目前尚不明確。因此,本研究通過(guò)體外給予H9C2大鼠心肌細(xì)胞高糖刺激,觀察其對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響,以探討糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

H9C2細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司,CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司,JC-1試劑盒及線粒體內(nèi)ROS熒光探針購(gòu)自碧云天生物有限公司,兔抗大鼠Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、cleaved caspase-3及 actin抗體購(gòu)自Abcam公司,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.2 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

H9C2心肌細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中,加入6 ml含10% FBS低糖DMEM培養(yǎng)基,于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿皿底80%時(shí),0.25%胰酶消化傳代,接種于6孔板或96孔板,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為低濃度組(含5 mmol/L葡萄糖),中濃度組(含15 mmol/L葡萄糖)和高濃度組(含30 mmol/L葡萄糖),實(shí)驗(yàn)干預(yù)12 h。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 H9C2心肌細(xì)胞活力檢測(cè)

將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,棄培養(yǎng)基,PBS洗3次,每孔加入100 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基,每孔再加入10 μl CCK8試劑,混勻后避光置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min,Bio-Rad酶標(biāo)儀470 nm處檢測(cè)吸收光值。

1.4 H9C2心肌細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

將細(xì)胞接種于10 mm培養(yǎng)皿中,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,棄培養(yǎng)基,冰1×JC-1緩沖液沖洗細(xì)胞3次,按說(shuō)明配制JC-1工作液,每皿加入1 ml JC-1工作液,再加入1 ml DMEM培養(yǎng)基,避光于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育25 min,使用預(yù)冷的1×JC-1緩沖液沖洗細(xì)胞3次。熒光顯微鏡下于紅光及綠光通道處分別觀察同一視野細(xì)胞紅光及綠光熒光強(qiáng)度。紅光強(qiáng)度與綠光強(qiáng)度的比為細(xì)胞線粒體膜電位的變化。

1.5 H9C2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6孔板,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,棄培養(yǎng)基,使用Hank’s液沖液一遍,按1 ∶1 000將ROS探針加入至Hank’s中,混勻后加入6孔板中,每孔1 ml,避光于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min,熒光顯微鏡下于紅光通道處觀察熒光強(qiáng)度。

1.6 H9C2心肌細(xì)胞相關(guān)蛋白Western blot檢測(cè)

取高糖干預(yù)后細(xì)胞，冰PBS沖洗3次，收集細(xì)胞，強(qiáng)裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)冰上裂解細(xì)胞40 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA蛋白定量后加入5×lodding buffer，100 ℃煮5 min。配制12%的SDS-PAGE分離膠，每泳道蛋白上樣量為30 μg，電泳分離蛋白，將PAGE膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，放入稀釋(1 ∶1 000)后的一抗中，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗后將膜放入堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗中，室溫孵育120 min，TBST沖洗后ECL顯影，Image lab軟件分析各條帶吸光值，分析各組蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)H9C2心肌細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)心肌細(xì)胞活力結(jié)果顯示,低濃度組心肌細(xì)胞為98.7%,中濃度組心肌細(xì)胞活力約為84.2%,較低濃度組降低14.5%(P<0.05)。高濃度組心肌細(xì)胞活力約為72.4%,較低濃度組降低26.3%(P<0.01,見(jiàn)圖1)。

與低濃度組比較,*P<0.05,**P<0.01圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞活力Figure 1 The cardiomyocytes viability in different groups

2.2 高糖對(duì)H9C2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體膜電位,紅色熒光越強(qiáng),表明細(xì)胞線粒體膜電位水平越高;綠色熒光增強(qiáng),表明細(xì)胞線粒體膜電位水平越低。結(jié)果顯示,低濃度組心肌細(xì)胞紅色熒光較強(qiáng),綠色熒光較弱。中濃度組心肌細(xì)胞紅色熒光明顯降低,綠色熒光明顯增強(qiáng)。高濃度組含心肌細(xì)胞紅色熒光顯著降低,綠色熒光顯著增強(qiáng)(見(jiàn)圖2)。

紅色熒光檢測(cè)JC-1 聚合物,為較高線粒體膜電位水平；綠色熒光檢測(cè)JC-1單體,為較低線粒體膜電位水平；融合體為紅色與綠色熒光共定位圖2 各組H9C2心肌細(xì)胞線粒體膜電位改變 (×40)Figure 2 The change of mitochondrial membrane potential of H9C2 cardiomyocytes in different groups (×40)

2.3 高糖對(duì)H9C2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平的影響

線粒體ROS熒光探針檢測(cè)線粒體ROS水平,紅色熒光強(qiáng)弱可顯示線粒體ROS水平。結(jié)果顯示,低濃度組紅色熒光強(qiáng)度較弱;與低濃度組相比,中濃度組紅色熒光明顯增強(qiáng)(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組紅色熒光顯著增強(qiáng)(P<0.01,見(jiàn)圖3)。

圖3 各組H9C2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平變化(×40)Figure 3 The mitochondrial ROS level of H9C2 cardiomyocytes in different groups (×40)

2.4 高糖對(duì)H9C2心肌細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot 檢測(cè)心肌細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與低濃度組相比,中濃度組Bcl-2蛋白水平明顯降低,Bax蛋白水平明顯升高,Bax/Bcl-2水平明顯升高(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組Bcl-2蛋白水平顯著降低,Bax蛋白水平顯著升高,Bax/Bcl-2水平顯著升高(P<0.01)。與低濃度組相比,中濃度組胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素 C水平明顯升高(P<0.05),cleaved caspas-3表達(dá)明顯升高(P<0.05);與低濃度組相比,高濃度組組胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素 C水平顯著升高(P<0.01),cleaved caspas-3表達(dá)顯著升高(P<0.01,見(jiàn)圖4)。

與低濃度組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 各組H9C2心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C和cleaved caspase-3表達(dá)水平的變化Figure 4 The expression of Bcl-2,Bax,Cyt C,and cleaved caspase-3 in H9C2 cardiomyocytes in different groups

3 討論

目前,隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年增高,繼發(fā)于糖尿病的心血管并發(fā)癥—糖尿病心肌病已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。Framingham研究表明糖尿病患者心衰的發(fā)生率明顯升高,其中男性患者增加2-3倍,女性患者較正常人增加5.1倍[6]。糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚不明確。以往研究表明,高糖可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng),加重高糖對(duì)細(xì)胞損傷[7]。細(xì)胞內(nèi)ROS主要來(lái)源于線粒體,且ROS是多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路激活的啟動(dòng)因素,比如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥因子激活及自噬等[8,9]。我們的研究表明,隨葡萄糖干預(yù)濃度升高,線粒體內(nèi)ROS水平明顯升高,細(xì)胞活力明顯下降,提示ROS水平的升高可能與細(xì)胞活力下降有關(guān),該結(jié)果可能有助于揭示高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的原因。

線粒體是心肌細(xì)胞維持存活的重要細(xì)胞器。線粒體功能的失衡可直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生。以往研究表明,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高是造成線粒體功能下降的主要原因,可導(dǎo)致線粒體膜通透性改變,細(xì)胞色素C由線粒體釋放至胞質(zhì),激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3,啟動(dòng)caspase依賴(lài)的級(jí)聯(lián)凋亡反應(yīng)[10,11]。本研究表明,隨葡萄糖干預(yù)濃度的升高,線粒體內(nèi)ROS水平升高,線粒體膜電位水平下降。線粒體維持較高的膜電位對(duì)細(xì)胞存活起至關(guān)重要的作用,高糖可導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平明顯降低,是細(xì)胞早期凋亡發(fā)生的標(biāo)志性事件。其次,高糖干預(yù)導(dǎo)致心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)明顯降低,Bax表達(dá)明顯升高,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C水平明顯升高。Bcl-2主要定位于線粒體外膜,調(diào)控線粒體通透性的改變,Bcl-2表達(dá)的降低可導(dǎo)致線粒體膜通透性升高,這是細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)的主要原因。以往研究報(bào)道,細(xì)胞色素C由線粒體釋放至胞質(zhì)可激活caspase-3,caspase-3的激活直接啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡程序[12]。本研究顯示,隨胞質(zhì)細(xì)胞色素C水平升高,cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯升高,提示高糖所致心肌細(xì)胞caspase-3的激活可能直接導(dǎo)致了細(xì)胞死亡事件的發(fā)生。

綜上所述,高糖誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS水平升高,造成線粒體功能受損,細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì),最終激活casapase依賴(lài)的級(jí)聯(lián)凋亡途徑。高糖誘導(dǎo)的線粒體功能失衡可能促進(jìn)了心肌細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生,這可能是高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞受損的分子機(jī)制之一。本研究可能為糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展提供理論依據(jù)。

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High glucose induces mitochondrial dysfunction in H9C2 rat cardiomyocytes

ZUO Jun1,WU Xia2*,TANG Zhiming3
(1DepartmentofInternalMedicine,FourthPeople’sHospitalofShaanxiProvince,Xi’an710043,China;2DepartmentofInternalMedicine,NorthwestWomenandChildrenHospitalofShaanxiProvince;3DepartmentofInternalMedicine,People’sHospitalofBaqiaoDistrictofXi’anCity;*Correspondingauthor,E-mail:1070907222@qq.com)

ObjectiveTo explore the effect of high glucose on mitochondrial dysfunction in H9C2 rat cardiomyocytes and the molecular mechanism of high glucose-related cardiomyopathy.MethodsH9C2 rat cardiomyocytes were divided into low concentration group(5 mmol/L glucose),moderate concentration group(15mmol/L glucose) and high concentration group(30 mmol/L glucose).After treatment with glucose for 12 h,the cell viability was measured by CCK-8,the level of mitochondrial ROS was detected by mitochondrial ROS fluorescence probe,the mitochondrial membrane potential was examined by JC-1,and the related proteins levels in H9C2 rat cardiomyocytes were analyzed by Western blot.ResultsCompared with low concentration group,the cellular viability decreased by 14.5 percentage in moderate concentration group(P<0.05) and 26.3 percentage in high concentration group(P<0.01).Compared with low concentration group,the level of mitochondrial ROS was increased in moderate concentration group(P<0.05) and high concentration group(P<0.01).Mitochondrial membrane potential of H9C2 rat cardiomyocytes maintained a high level in low concentration group,while mitochondrial membrane potential significantly decreased in moderate concentration group and high concentration group.Compared with control group,the expression of Bax/Bcl-2,cytoplasmic Cyt C and cleaved caspase-3 were significantly increased in moderate concentration group(P<0.05) and high concentration group(P<0.01).ConclusionHigh glucose-induced mitochondrial dysfunction may contribute to the decrease of cellular viability,suggesting that the mitochondrial dysfunction induced by high glucose might be responsible for the development of high glucose-related cardiomyopathy.

high glucose； H9C2； cardiomyocytes； mitochondria dysfunction

陜西省科學(xué)技術(shù)攻關(guān)課題資助項(xiàng)目(2010K 18-H1-6)

左軍,男,1976-生,碩士,主治醫(yī)師,E-mail:244059348@qq.com

2016-12-29

R589.1

A

1007-6611(2017)05-0405-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.001