李彥凱，汪禮君，宋曉賀

(皖西南生物多樣性和生態(tài)保護安徽省重點實驗室，安慶師范大學 生命科學學院，安徽安慶246133)

冬青衛(wèi)矛葉部病害調查研究

李彥凱，汪禮君，宋曉賀

(皖西南生物多樣性和生態(tài)保護安徽省重點實驗室，安慶師范大學 生命科學學院，安徽安慶246133)

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)葉部病害在我國普遍發(fā)生且嚴重影響其觀賞價值和綠化效果，發(fā)病嚴重時可導致整株枯死。系統(tǒng)調查了冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生及危害情況，并對冬青衛(wèi)矛主要病害病原菌進行了鑒定。結果表明：冬青衛(wèi)矛葉部病害的癥狀表現(xiàn)主要有4種：Ⅰ型病害侵染時間早，6～7月為發(fā)病盛期；Ⅱ型和Ⅲ型病害常?；旌习l(fā)生，同一葉片可有2種病斑，8～10月為發(fā)病盛期；Ⅳ型病害只能從傷口侵入，該病原菌對營養(yǎng)的要求不嚴格，具有較強的適應能力，且在高溫高濕條件下，易造成病害的迅速流行和爆發(fā)。結合形態(tài)學觀察及ITS序列分子鑒定分析，將Ⅳ型病害病原菌鑒定為Neopestalotiopsisfoedans。

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)；葉部病害；病原菌；分離鑒定

冬青衛(wèi)矛(EuonymusjaponicusThunb.)又名大葉黃楊，原產日本，為衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(EuonymusL.)常綠灌木和小喬木樹種，由于其具有耐貧瘠、耐干旱、抗污染、生長快、管理粗放、耐修剪等特點，是園林綠化、觀賞和環(huán)境保護的重要樹種之一。然而近年來，冬青衛(wèi)矛葉部病害在我國普遍發(fā)生且危害嚴重。輕者病斑累累影響生長，重者葉片枯死、脫落甚至植株成片死亡，嚴重影響其觀賞價值及綠化效果。流行年份造成8～10月間冬青衛(wèi)矛大量落葉，管理粗放的地方發(fā)病尤為嚴重。因此，開展冬青衛(wèi)矛葉部病害系統(tǒng)調查，掌握病害的發(fā)生流行規(guī)律，鑒定其主要病害病原菌，對于挖掘冬青衛(wèi)矛抗病種質資源以及制訂有針對性的綜合防治措施均具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 調查范圍

2015年4月至2016年10月，分別以合肥、安慶、蕪湖、馬鞍山、南京5個城市冬青衛(wèi)矛植株為普查對象，調查地點包括各城市道路、廣場、公園、機關、學校、城區(qū)、住宅小區(qū)以及苗圃等。

1.2 調查方法

對上述5個城區(qū)冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生情況進行普查，觀察典型病害的種類、癥狀、發(fā)病情況。在普查的基礎上，選取6個典型調查點對冬青衛(wèi)矛病害發(fā)生情況進行詳細的調查，每個調查點總株數(shù)為100～150株，詳細記錄調查日期、調查地點、發(fā)病株數(shù)、危害部位、分布情況(單株、簇狀、塊狀和片狀)、自然條件及管理水平(地勢、土質及氣候條件)。對發(fā)病典型的病葉和整株拍照記錄，采樣帶回實驗室進行病原菌鑒定。按照表1中冬青衛(wèi)矛病害的分級標準，統(tǒng)計發(fā)病情況，并按下述公式計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù)/調查總株數(shù))×100%

病情指數(shù)=∑(各級發(fā)病株數(shù)×各級代表值)/調查總株數(shù)×最高級代表值

表1 冬青衛(wèi)矛葉部病害分級標準

1.3 病原菌的鑒定

采用組織分離法對冬青衛(wèi)矛Ⅳ型病害癥狀典型的病葉進行病原菌的分離培養(yǎng)。挑取病葉上的繁殖體和培養(yǎng)基上黑色的分生孢子堆，制成臨時玻片，根據(jù)病原菌形態(tài)特征和癥狀特點初步鑒定病原菌。同時利用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對菌絲體基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產物純化并測序。通過BLAST分析，將測序菌株ITS序列與Genbank中已知種rDNA進行序列比對分析，確定菌株類別。

2 結果與分析

2.1 冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)病率和病情指數(shù)

通過對合肥市杏花公園、合肥市肥西縣四十埠公園、南京市玄武湖公園、南京市莫愁湖公園、安慶市菱湖公園、安慶市黃梅戲學院、安慶師范大學等處冬青衛(wèi)矛病害的發(fā)生情況(表2)調查得知，合肥市杏花公園大門冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為90.3%，病情指數(shù)為38.83；合肥市肥西縣四十埠公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為20.0%，病情指數(shù)為11.25；南京市玄武湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為94.1%，病情指數(shù)為41.18；南京市莫愁湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為66.7%，病情指數(shù)為22.62；安慶師范大學冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為24.1%，病情指數(shù)為24.14；安慶市黃梅戲學院冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為17.4%，病情指數(shù)為9.78；安慶市菱湖公園冬青衛(wèi)矛葉部發(fā)病率為80.6%，病情指數(shù)為34.70。調查結果充分說明冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生普遍且危害嚴重，尤其在發(fā)病嚴重的地區(qū)，發(fā)病率高達90%以上，病情指數(shù)高達42.00。

表2 冬青衛(wèi)矛葉部病害發(fā)生情況調查

2.2 冬青衛(wèi)矛葉部的病害癥狀類型

通過對冬青衛(wèi)矛葉部病害的系統(tǒng)調查，并對采集標本進行癥狀對比和鏡檢鑒定，發(fā)現(xiàn)冬青衛(wèi)矛葉部病害癥狀主要有4種類型，分別按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進行編號。

Ⅰ型病害：病斑較小，初期葉片背面產生水漬狀斑點，逐漸在葉片正面產生許多黃色小突起斑，近圓形，對光看呈現(xiàn)出透明狀。隨著病情的發(fā)展，黃色突起斑中間變褐，背面水漬狀，有黃色暈圈。后期在葉片的正面和背面產生小黑點，中央灰白色，不規(guī)則排列。嚴重時，病斑連成一片，似瘡痂狀，造成葉片提早枯死，脫落(圖1A)。該病害侵染時間早，5月初開始發(fā)病，6～7月份為發(fā)病盛期。因此，防治要提前，約在5月底至6月初進行。

Ⅱ型病害：發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)黃色或淡綠色凸起小斑點，后擴展成近圓形或不規(guī)則的大斑，有時微具同心輪紋。病斑邊緣隆起，褐色，隆起的邊緣外有延伸的黃色暈圈，中心黃褐色或灰褐色，病斑上密生絨毛狀黑色小點，即病原菌的子座組織。背面黑色絨毛狀小點少于正面。嚴重時病斑連成一片，導致葉片枯死、脫落甚至植株成片死亡(圖1B)。8～10月份該病害大量發(fā)生，發(fā)病率高達90%以上，11月以后發(fā)病基本停止。管理粗放、樹勢衰老或有介殼蟲危害時，會加重該病害的發(fā)生。

Ⅲ型病害：葉部病斑多從葉緣開始，呈褐色，近圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有較狹的深褐色隆起，中央灰白色，后期在灰白色處形成較粗的圓形或橢圓形小黑點，即病菌分生孢子盤(圖1C)。排列稀疏，多在葉片正面，有時呈輪紋狀排列。在高溫多濕條件下，產生膠粘狀粉紅色分生孢子堆。該病害常常與Ⅱ型病害混合發(fā)生，同一葉片上可有2種病斑，此病與Ⅱ型病害的區(qū)別之處在于，該病葉片病斑周圍沒有黃色暈圈，其子實體較粗大。

Ⅳ型病害：該病害主要危害葉片和葉柄。病斑圓形或不規(guī)則形，病斑邊緣有黃色暈圈，斑上形成小黑粒點狀的分生孢子盤。多在葉片正面，有時呈輪紋狀排列(圖1D)。常與病害Ⅲ混合發(fā)生。

A：Ⅰ型病害；B：Ⅱ型病害；C：Ⅲ型病害；D：Ⅳ型病害；E：菌落形態(tài)正面；F：菌落形態(tài)背面圖1 冬青衛(wèi)矛葉部病害癥狀類型及Ⅳ型病原菌菌落特征

2.3 Ⅳ型病害病原菌鑒定

PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色絮狀，生長繁茂，呈輪紋擴展，產生濃墨汁液滴狀的分生孢子盤。背面有淺黃色素沉積(圖1E、F)。分生孢子5個細胞，長梭形，中間3個細胞為褐色，頂胞無色，頂端具有附屬絲2～3根，尾胞無色，三角形，具有中生式柄1根。分生孢子萌發(fā)時，第3色胞萌發(fā)，膨大變圓，產生侵入釘侵入寄主細胞。以冬青衛(wèi)矛Ⅳ型病害病原菌菌株DNA作為模板，用通用引物ITS1/ITS4對其核糖體rDNA的ITS區(qū)進行PCR擴增，得到長度約為600bp的擴增片段。在Genbank中搜索同源序列，用BLAST進行比對，該分離菌株與Neopestalotiopsisfoedans(Genbank:KU593530.1)的同源性為100%，結合形態(tài)學和分子鑒定分析，將該病原菌鑒定為污斑多毛孢Neopestalotiopsisfoedans。

3 結論與討論

通過連續(xù)2a的系統(tǒng)調查，發(fā)現(xiàn)冬青衛(wèi)矛葉部病害的發(fā)生日趨嚴重，且分布廣泛。尤其在管理粗放樹勢衰老的植株上，發(fā)病尤為嚴重，造成葉片大量的早落，整個枝條甚至整株枯死，嚴重影響植株的生長，降低了綠化及觀賞效果。共調查到冬青衛(wèi)矛葉部病害有6種，其中有2種葉部病害只有零星分布，其余4種病害在每個調查點均有發(fā)生且嚴重，阻礙了冬青衛(wèi)矛的生長發(fā)育，導致觀賞性降低，造成一定的經濟損失，是冬青衛(wèi)矛葉部的主要病害。

Ⅰ型病害病菌主要以菌絲體或分生孢子盤在病葉中越冬，次年5月份，病菌孢子開始萌發(fā)侵染，其發(fā)病時間要早于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病害，病斑較小，易造成病葉發(fā)黃、脫落。因此防治時間要提前，約在5月底防治為宜。Ⅱ型病害病菌主要以菌絲或子座在病葉中越冬，安慶地區(qū)7月中、下旬開始發(fā)病，8月下旬至9月下旬為發(fā)病盛期，發(fā)病率可達90%以上。Ⅲ型病害往往與Ⅱ型病害混合發(fā)生，一個葉片常有2種不同的病斑，濕度大時，可見膠粘狀粉紅色孢子堆。此病害發(fā)生期較Ⅱ型病害稍遲。Ⅳ型病害病菌只能從傷口侵入，主要危害葉片和葉柄，病葉上密生小黑點狀的分生孢子堆。對該病害病原菌進行分離純化，通過柯赫氏法則證明，結合形態(tài)學觀察及分子鑒定，將該病原菌確定為Neopestalotiopsisfoedans。在致病性測定中發(fā)現(xiàn)，該病原菌無傷接種、針刺1針和針刺10針接種葉片，差異顯著，說明該病害的發(fā)生程度與傷口的大小有關(結果待發(fā)表)。冬青衛(wèi)矛需要定期修剪以保持特定的造型，葉片修剪造成的傷口非常有利于該病菌的侵入，加之該病原菌易分離培養(yǎng)，對營養(yǎng)、溫度、濕度的要求均不嚴格，適應能力強，因此該病害的發(fā)生和流行趨勢很大。

我國冬青衛(wèi)矛病害發(fā)生較為普遍，從南到北均有發(fā)生，說明我國南北各地的氣候和立地環(huán)境均適合病害的發(fā)生，高溫多濕是易發(fā)病的主要因素。調查表明冬青衛(wèi)矛4種主要病害對冬青衛(wèi)矛的健康生長均具有很大的威脅，應引起高度重視，以降低不必要的經濟損失。目前，本課題組均已獲得這4種主要病害的病原菌，下一步將會對這些病原菌進行生物學特性、致病機理及病害綜合防治等方面研究，為新型藥劑的篩選、優(yōu)良抗病品種的選育奠定基礎。

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[編輯] 余文斌

2017-04-17

留學人員科技活動項目(皖人社秘[2015]229號)；安徽省教育廳重點項目(KJ2016A435)。

李彥凱(1983-)，男，碩士，助教，主要從事植物病蟲害綜合防治研究。通信作者：宋曉賀，sxhapril@163.com。

S792.11;S432.4

A

1673-1409(2017)10-0005-04

[引著格式]李彥凱，汪禮君，宋曉賀.冬青衛(wèi)矛葉部病害調查研究[J].長江大學學報(自科版)，2017，14(10)：5～8.