肖 喻(XIAO Yu) , 曹先偉(CAO Xian-wei)

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

(The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006， China)

·綜述·

白假絲酵母菌基因分型方法的研究進展

肖 喻(XIAO Yu) , 曹先偉(CAO Xian-wei)

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

(The First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006， China)

真菌；白假絲酵母菌；基因分型；流行病學(xué)

Advances in genotyping methods ofCandidaalbicans

隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展，各種醫(yī)用材料和侵入性操作技術(shù)在臨床廣泛應(yīng)用，廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑在臨床的大量使用，醫(yī)院內(nèi)真菌感染的比例越來越高，其中白假絲酵母菌在真菌感染中所占比例最高，是臨床中常見的致病菌之一。白假絲酵母菌主要引起皮膚、黏膜的淺表部位感染，侵襲性呼吸系統(tǒng)感染和血流感染等，其中血流感染相對嚴重，如白假絲酵母菌血癥。早在二十世紀八十年代，Pfaller等[1]報道，侵襲性假絲酵母菌感染的發(fā)病率有上升趨勢，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視。近十幾年，假絲酵母菌在美國和歐洲引起醫(yī)院感染的致病菌中分別占第四位和第六位[2]。在亞洲假絲酵母菌引起醫(yī)院感染的發(fā)病率也相對較高[3]。盡管有較多抗真菌藥物可以用來治療侵襲性假絲酵母菌感染，但其病死率仍然在30%左右[2-3]。利用分子生物學(xué)的方法，可以對假絲酵母菌進行同源性分析和查找傳播途徑。從而為制定預(yù)防和控制假絲酵母菌醫(yī)院感染流行、傳播的有效措施提供理論依據(jù)。

二十世紀，白假絲酵母菌的分型方法主要是根據(jù)白假絲酵母菌菌落形態(tài)和藥物敏感性進行分類，如形態(tài)型分型、血清型分型和耐藥性分型[4]。而上述分型方法分辨率低，可重復(fù)性差，而且分型結(jié)果很容易受到外界環(huán)境的影響，因此不能作為白假絲酵母菌分型的標準方法。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，以DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)在白假絲酵母菌的分型、診斷及流行病學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。白假絲酵母菌流行病學(xué)研究中常用的基因分型方法主要有多位點酶電泳(multilocus enzyme electrophoresis， MLEE)、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、限制片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphim，RFLP)、脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis， PFGE)、微衛(wèi)星長度多態(tài)性(microsatellite length polymorphic，MLP)和多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)。本文將對此7種基因分型方法進行綜述。

1 MLEE分型

MLEE是從“一酶一基因”的學(xué)說發(fā)展起來的，早在二十世紀六十年代就已經(jīng)提出，1985年Selander對MLEE改進后用于病原微生物的分型研究。MLEE主要通過檢測病原微生物的水溶性代謝酶，從而對菌株進行分型。MLEE 是檢測酶蛋白的多態(tài)性來反映基因位點的多態(tài)性。酶蛋白的泳動度主要是由蛋白的分子結(jié)構(gòu)及其所帶電荷決定，而編碼酶蛋白DNA序列中的任意一個堿基發(fā)生變化(主要為堿基的替換、插入、刪除)均可能導(dǎo)致酶蛋白的泳動度發(fā)生變化。當兩株菌的酶蛋白泳動度不同時，可認為其DNA序列不同，從而對菌株進行基因分型[5]。

MLEE是最早用于白假絲酵母菌流行病學(xué)研究的基因分型方法。Pujol等[6]首次用MLEE方法對白假絲酵母菌的菌群分布進行了研究，此后，MLEE逐漸被用于其他假絲酵母菌的流行病學(xué)研究，如熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、都柏林假絲酵母菌等[7]。MLEE是一種分辨率一般但重復(fù)性較好的基因分型方法，重復(fù)性甚至優(yōu)于以DNA為基礎(chǔ)的其他基因分型方法[5，8]。但是，MLEE不能直接分析白假絲酵母菌的全基因組，且操作耗時較長。另外，MLEE不能檢測基因的全部序列，特別是堿基發(fā)生變化時未引起氨基酸和蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的基因序列。單一的酶切使得MLEE在檢測白假絲酵母菌時并不敏感，但聯(lián)合多個酶切位點可提高MLEE的敏感性。Boriollo等[5]聯(lián)合11個酶切位點對白假絲酵母菌進行基因分型，結(jié)果顯示多個酶切位點聯(lián)合方法可明顯提高MLEE的敏感性，可準確地對白假絲酵母菌進行基因分型。因此，MLEE至今仍然是白假絲酵母菌分子流行病學(xué)研究中的重要分型方法。

2 RAPD分型

RAPD是由Williams等提出的一種以隨機排列的寡核苷酸單鏈(通常不超過10 bp)為引物擴增基因組DNA的基因分型方法。該技術(shù)以PCR方法為基礎(chǔ)，由一系列人工隨機合成的寡聚核苷酸單鏈為引物，對堿基組進行單引物擴增。擴增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，然后通過EB染色或放射自顯影檢測，從而觀察待測DNA的多態(tài)性。這些擴增片段DNA的多態(tài)性主要由瓊脂糖凝膠上條帶的數(shù)量和位置決定。因此，當不相關(guān)菌株的基因差異較大時，RAPD將呈現(xiàn)出較復(fù)雜的結(jié)果。目前，RAPD已經(jīng)在假絲酵母菌屬和其他真菌的分型中得到廣泛運用，如白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、煙曲霉等[9-10]。RAPD廣泛用于菌株分型的原因主要是操作簡便、耗時少、成本低、引物可以隨意設(shè)計，而且不需要知道待測DNA的堿基序列[9]。但是，RAPD的分辨率一般，研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，RAPD和MLEE的結(jié)果有很高的相似性。若研究者要得到分辨率較高的結(jié)果，需設(shè)計多對引物進行擴增[5]。RAPD可對不相關(guān)的、集群相關(guān)的、相同或相關(guān)的白假絲酵母菌進行基因分型，即RAPD適合所有白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究[9]。

盡管RAPD在白假絲酵母菌流行病學(xué)研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但是仍然存在2個不足之處，即重復(fù)性和實驗結(jié)果可比性差。由于該方法對實驗室技術(shù)和設(shè)備要求不高[9]，仍廣泛應(yīng)用于假絲酵母菌屬的基因分型研究。 Biernasiuk等[11]用RAPD方法對100例非小細胞肺癌患者上呼吸道分泌物中分離的白假絲酵母菌進行分型， 52株白假絲酵母菌可分為34個基因型，其中28株白假絲酵母菌有10個基因型，且相似度高達80%以上，其余的24株白假絲酵母菌有24個基因型。該研究顯示RAPD可對癌癥患者上呼吸道分離的白假絲酵母菌進行基因分型，因此，RAPD仍被廣泛用于白假絲酵母菌的診斷及流行病學(xué)的研究。

3 AFLP分型

AFLP是二十世紀九十年代由Zabean等發(fā)展起來的一種新的分子標記技術(shù)。該方法主要是通過使用2種不同的限制性內(nèi)切酶對整個基因組DNA進行酶切，然后將人工合成的特異雙鏈接頭連接在這些片段的兩端，形成一個帶接頭的特異片段，用這些特異片段作為PCR擴增反應(yīng)的模板，通過接頭序列與引物3’一端的熒光標記識別，然后對特異性片段進行選擇性擴增。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠進行電泳，然后對電泳的條帶進行分析，進而得到待測標本的基因型。

AFLP是一種具有多位點標記和高分辨率的基因分型方法。該方法不需要了解待測標本的基因序列。AFLP基因分型方法需要熒光標記的引物，并且實驗條件也較嚴格[12]，因此AFLP的重復(fù)性比RAPD好。

盡管AFLP是一種分辨率高且重復(fù)性好的基因分型方法，但是因為該方法操作較繁瑣，成本高，而且對實驗者的操作技術(shù)要求較為嚴格[12-13]。因此，在白假絲酵母菌的流行病學(xué)研究中使用較少。

4 RFLP分型

RFLP是由Kan等在1978年提出的一種方法，用不同的限制性核酸內(nèi)切酶對檢測的DNA進行酶切，根據(jù)酶切后DNA片段的分子量和長度推斷DNA酶切位點數(shù)目和位置的差異，進而對菌株進行基因分型。目前，白假絲酵母菌進行RFLP分型常用的兩個限制性核酸內(nèi)切酶為EcoR Ⅰ 和Msp Ⅰ。 EcoR Ⅰ酶切和Msp Ⅰ酶切后均可以產(chǎn)生6個基因型，兩者聯(lián)合酶切后可以產(chǎn)生17個基因型。RFLP分型方法分辨力低但重復(fù)性好，容易操作，耗時少；但不能單獨用來分析白假絲酵母菌菌種間的基因型關(guān)系。Ge等[12]用RFLP方法對42株白假絲酵母菌進行基因分型，共分為1個基因型，該研究顯示單獨應(yīng)用RFLP不能較好地分析白假絲酵母菌基因型。有學(xué)者應(yīng)用RFLP聯(lián)合其他方法對白假絲酵母菌進行基因分型，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合后可以提高RFLP對白假絲酵母菌的分型能力，因此，此種RFLP聯(lián)合方法在白假絲酵母菌的基因分型中可推廣應(yīng)用[12,14]。

5 PFGE分型

PFGE是1984年由Schwartz等報道的一種以DNA為基礎(chǔ)的基因分型方法，并用該方法首次成功分析了釀酒酵母菌的全基因組。PFGE是通過改變脈沖電場的方向、時間和電流，使不同大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠上不斷改變移動方向。隨著電場方向變化，小的 DNA 分子比大的變化快,從而根據(jù)分子量的大小區(qū)分不同DNA片段，最后根據(jù)電泳帶型對菌株進行基因分型。PFGE分型首先是用低熔點瓊脂糖包埋細菌染色體DNA，在整個包埋過程中低熔點瓊脂糖需阻止機械力對DNA的剪切作用，然后將蛋白酶和洗滌劑加入樣品中進行水解，再根據(jù)待測DNA分子量的差異，使其在瓊脂糖凝膠不同位置上出現(xiàn)條帶，再對這些條帶進行綜合分析，根據(jù)條帶類型確定菌株的基因型。PFGE是一種容易操作，且重復(fù)性較好的基因分型方法。但由于該方法的實驗成本高，耗時較長，且需要專門的儀器設(shè)備，臨床研究中使用相對較少[5,7]。白假絲酵母菌染色體DNA分子量大小為1～4 Mb，PFGE對此范圍的DNA片段相對敏感。1987年Magee用PFGE方法對白假絲酵母菌進行基因分型，此后越來越多的學(xué)者用PFGE方法研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)，但該方法分辨力一般[5,15]。有學(xué)者運用PFGE聯(lián)合其他基因分型方法對白假絲酵母菌進行分型，可以明顯提高基因分型的分辨率。Boriollo聯(lián)合運用MLEE、PFGE和MLP三種分型方法對75株白假絲酵母菌進行基因分型，MLEE基因分型方法的同工酶包括以下11種：adh、sdh、mip、mdh、idh、gdh、g6pdh、asd、cat、po和lap；PFGE用CHEF系統(tǒng)對白假絲酵母菌進行基因分型；MLP用3個多態(tài)性位點(EF3、CDC3和HIS3)對白假絲酵母進行基因分型，3種基因型分型方法的分辨力均高達95%，可較好的分辨DNA片段差異性，聯(lián)合運用此3種基因分型方法可明顯提高分辨力[5]。因此，PFGE常與其他基因分型方法聯(lián)合用于假絲酵母菌的流行病學(xué)研究。

6 MLP分型

MLP又被稱為短串聯(lián)序列。MLP是一種根據(jù)少數(shù)幾個脫氧寡核苷酸(多數(shù)為2～6個)為單位進行多次DNA序列串聯(lián)重復(fù)的微生物分型方法[16]。MLP的檢測主要利用PCR方法，微衛(wèi)星的標記物主要由側(cè)翼序列和標記引物共同構(gòu)成。人工合成微衛(wèi)星標記引物的引物序列，然后通過引物序列對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙酰胺凝膠進行電泳，染色后對電泳結(jié)果進行分析。微衛(wèi)星的標記引物主要由熒光和同位素組成，通過電泳成像后可以觀察PCR擴增之后的目的片段大小，從而分析目的片段的多態(tài)性。若是無熒光標記的引物可通過銀染顯色觀察結(jié)果[17]。隨著二代測序的推廣，目的片段可監(jiān)測其片段重復(fù)數(shù)。對于二倍體生物，如白假絲酵母菌，當重復(fù)數(shù)較單一時，表示該生物為純合子；相反，如果重復(fù)數(shù)較復(fù)雜時，顯示該生物為雜合子[16]。Sampaio等[17]在2005年首次用此技術(shù)對白假絲酵母菌進行基因分型研究。

MLP在白假絲酵母菌的分型研究中有較高的分辨率[17]。但是，該方法分辨率的高低與微衛(wèi)星標記物的選擇有關(guān)。目前，已有文獻[4]報道白假絲酵母菌的微衛(wèi)星標記物主要有EF3、CDC3、HIS3、ERK1、2NF1、CCN2、CPH2、EFG1、CAI、CAIII和CAVIII。上述微衛(wèi)星標記物的分辨率在0.57～0.97(CAI)之間[16-17]。微衛(wèi)星標記物的選取主要依據(jù)標記物的分型性能、突變率和分辨率三個方面。兩種或三種微衛(wèi)星標記物聯(lián)合可以明顯提高分辨率。Botterel等[18]聯(lián)合使用EF3、CDC3和HIS3三種微衛(wèi)星標記物對白假絲酵母菌進行分型，聯(lián)合后的分辨率高達0.97。目前，已報道的文獻中分辨率最高的組合是Sampaio等[17]聯(lián)合使用的CAI、CAIII和CAVI組合，其分辨率高達0.998。有學(xué)者利用高分辨率的熔解曲線技術(shù)和MLP對白假絲酵母菌進行基因分型，可明顯提高MLP的分辨率[15,19]。

MLP分型與其他的基因分型方法相比，更適合多樣本分析[17-18]。該方法重復(fù)性好，但由于實驗室之間的設(shè)備存在較大差異，數(shù)據(jù)交流不方便[19]。

MLP廣泛應(yīng)用于白假絲酵母菌、煙曲霉菌和隱球菌的流行病學(xué)研究，但其實驗設(shè)備的費用較高[19-20]。為盡量降低實驗室檢測費用，我國學(xué)者采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性和微衛(wèi)星標記物CAI聯(lián)合對白假絲酵母菌進行基因分型，分辨率高達0.993[20]，實驗成本低，易推廣應(yīng)用。

7 MLST分型

MLST是由Maiden在1998年提出的通過分析6～10個管家基因(400～500 bp)核苷酸序列的多態(tài)性，對致病微生物進行基因分型的一種方法。MLST選擇的管家基因均相對保守，受環(huán)境因素影響較小，其次可以得到多個等位基因分型。在每個管家基因中，不同的堿基序列可認為是不同的等位基因。MLST主要是通過設(shè)計管家基因引物，運用PCR方法對DNA進行擴增，得到待測菌株的管家基因片段。每個管家基因片段對應(yīng)一個等位基因，每株菌的多位點序列分型是由多個等位基因共同得到的一個序列型(ST)。由于白假絲酵母菌為二倍體生物，在MLST的核苷酸分型時可出現(xiàn)同一位點的雜合性(同一位點出現(xiàn)2個堿基)，因此Bougnoux等[21]將白假絲酵母菌的MLST分型結(jié)果定義為二倍體序列型(DSTs)。

二十世紀，MLST首次用于白假絲酵母菌的基因分型，隨著白假絲酵母菌MLST方法的不斷改進，2003年Bougnoux提出了白假絲酵母菌MLST的標準實驗方案，且創(chuàng)建了白假絲酵母菌的MLST數(shù)據(jù)庫(http://calbicans.mlst.net/.)。該數(shù)據(jù)庫為全球公用數(shù)據(jù)庫，可隨時對數(shù)據(jù)庫中白假絲酵母菌MLST信息進行更新[21]，不僅有利于全球白假絲酵母菌的信息交流，而且有利于研究全球白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進化關(guān)系[22]。已有學(xué)者利用白假絲酵母菌MLST數(shù)據(jù)庫進行了大樣本的流行病學(xué)研究[22-23]。為了解某教學(xué)醫(yī)院白假絲酵母菌基因多態(tài)性，中國學(xué)者收集40例白假絲酵母菌感染患者分離的62株白假絲酵母菌，經(jīng)過7個管家基因擴增后，共獲到50個二倍體序列型，其中有41個為新發(fā)現(xiàn)的二倍體序列型[23]。

在白假絲酵母菌的MLST分型研究中，通過分析7個管家基因?qū)攴中停?個管家基因的分子量相對白假絲酵母菌全基因組則非常小，管家基因主要集中在第3、5和7號染色體上，因此MLST基因分型方法不夠準確[4]。但是，與其他分型方法相比，該方法省時，便于操作，且分辨率和重復(fù)性都較好[17，22-23]，實驗室之間的數(shù)據(jù)交流方便。因此，越來越多的學(xué)者用MLST方法研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進化關(guān)系。

7種基因分型方法各有優(yōu)點和缺點，見表1。

表1 7種白假絲酵母菌基因分型方法優(yōu)缺點

8 結(jié)論與展望

綜上所述，7種白假絲酵母菌基因分型方法均可有效地、準確地研究白假絲酵母菌的流行病學(xué)和微進化關(guān)系，可為臨床疾病的防治提供實驗室依據(jù)。隨著基因測序的飛速發(fā)展，白假絲酵母菌的基因分型方法將逐漸完善，更加精準。

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(本文編輯：孟秀娟)

2016-07-25

肖喻(1990-)，男(漢族)，湖北省荊州市人，碩士研究生，主要從事真菌感染相關(guān)的研究。

曹先偉 E-mail：ndyfyygk@163.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2017.05.021

R379.4

A

1671-9638(2017)05-0482-05