喬鈺惠 朱寶玲 李子健

100191 北京大學第三醫(yī)院心內科血管醫(yī)學研究所 衛(wèi)生部心血管分子生物學與調節(jié)肽重點實驗室 分子心血管學教育部重點實驗室 心血管受體研究北京市重點實驗室

·基礎研究·

性別對小鼠急性心肌損傷后心臟結構與功能的影響

喬鈺惠 朱寶玲 李子健

100191 北京大學第三醫(yī)院心內科血管醫(yī)學研究所 衛(wèi)生部心血管分子生物學與調節(jié)肽重點實驗室 分子心血管學教育部重點實驗室 心血管受體研究北京市重點實驗室

目的 研究不同性別的小鼠在異丙基腎上腺素(ISO，非選擇性β-腎上腺素受體激動劑)誘導的急性心肌損傷后心臟結構與功能改變的差異。方法 經皮下注射給予同周齡FVB/N雌雄小鼠大劑量ISO(200mg·kg-1·d-1，3d)，超聲心動圖檢測心臟結構及心功能。檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)活性及心臟組織切片活性氧(ROS)生成。采用舒張末期左心室壁厚度、心體比、心脛比及心肌細胞橫截面積作為心臟肥厚指標。采用天狼星紅染色方法檢測心臟纖維化。結果ISO(200mg·kg-1·d-1，3d)可引起FVB/N小鼠血清LDH活性明顯增高，且雄鼠增高顯著高于雌鼠。短期給予大劑量ISO可導致雄鼠的心臟組織切片ROS生成明顯增加，但并沒有使雌鼠心臟組織切片的ROS顯著增加。另外，短期給予大劑量ISO誘導雄鼠和雌鼠均發(fā)生心臟肥厚，且雄鼠的肥厚程度顯著高于雌鼠。而短期給予大劑量ISO不能誘導雌鼠和雄鼠的心臟發(fā)生纖維化，同時對雌鼠和雄鼠的心功能也無明顯影響。結論 在ISO誘導的急性心肌損傷模型中，雄鼠的心臟肥厚程度顯著高于雌鼠，其中的機制之一可能是通過ROS介導。而在此模型中雌雄鼠的心功能并無明顯差異。

性別； 異丙腎上腺素； 急性心肌損傷； 心臟結構與功能

Fund program：National Basic Research Program of China (973) Program (2014CBA02000)；National Natural Science Foundation of China (81471893，81270157，81070078，91539123)

心血管疾病是導致人類死亡的首要病因，且患病率仍在持續(xù)增加。已有很多研究顯示，性別因素在很多心血管疾病如心肌梗死和心臟重構的進展與預后中具有重要作用[1-4]。異丙基腎上腺素(isoprenaline，ISO)是β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor，β-AR)的非選擇性激動劑，導致心臟處于應激狀態(tài)，常被用于制造各種心血管疾病模型。而大劑量的ISO可引起冠狀動脈的收縮與痙攣，導致心肌的缺血與損傷，故可被用于建立急性心肌損傷模型[5-7]。而性別對急性心肌損傷的具體影響及作用還不清楚，因此本研究采用大劑量ISO制備小鼠急性心肌損傷模型，進一步探究性別因素對ISO引起的急性心肌損傷后心臟結構與心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

同樣周齡(10～12周)、同樣背景的FVB/N 雄鼠和雌鼠購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25 ℃左右，12 h明/暗交替，所有動物實驗遵守北京大學生物醫(yī)學研究倫理要求。ISO(5627-5G)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 FVB/N小鼠急性心肌損傷模型的制備

對實驗小鼠進行完全隨機化分組，將雌鼠和雄鼠各自分為對照組和實驗組，每組8只。經皮下注射途徑給藥：實驗組小鼠皮下注射ISO(200 mg·kg-1·d-1，3 d)；對照組小鼠注射等體積生理鹽水。

1.3 FVB/N小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)及心臟組織切片活性氧(ROS)檢測

在最后1次給予ISO的第2天取材，取血及心臟。經眼球內眥取血，將全血置于冰上1 h后高速離心10 min(4 ℃，5 000 rpm)，取上層血清。用試劑盒Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit(Sigma-MAK066)檢測血清與試劑反應一定時間后450 nm處的吸光度值，按照說明書中的公式計算LDH活性。

將麻醉后的小鼠胸腔剪開，取出心臟，用冷的PBS緩沖液沖洗心臟中的殘留血液。經乳頭肌切面橫切心臟，將心底部分置于4%多聚甲醛中固定，6～8 h后取出，將心臟組織置于20%蔗糖溶液中。之后依次置入50%(2 h)、70%(3 h)、80%(3 h)乙醇溶液中梯度脫水，最后置于90%乙醇+正丁醇(體積比1∶1)溶液中，45 min，2次。正丁醇(30 min)、丁醇(20 min)，浸入石蠟中2 h包埋組織塊，石蠟切片厚度5 μm。利用二甲苯將心臟組織石蠟切片脫蠟以后，給予二氫溴化乙啶(dihydroethidium，DHE；Invitrogen)熒光探針(10 μm)37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察熒光并采集圖像，每張切片隨機采集6～10個視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行熒光強度定量分析。

1.4 FVB/N小鼠心臟肥厚的檢測

于最后1次給予ISO的第2天取材時，稱量小鼠體重及心臟重量。并取小鼠脛骨，測量其長度。計算心臟重量與脛骨長度比值(heart weight/tibia length，HW/TL，單位：mg/mm)及心臟重量與體重比值(heart weight/body weight，HW/BW，單位：mg/mg)作為衡量心臟肥大的指標。

1.5 FVB/N小鼠心臟纖維化的檢測

將心臟石蠟切片進行苦味酸-天狼星紅染色，以檢測膠原分布。應用軟件Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics Inc.，USA)分別測量膠原面積和心臟面積，并計算膠原面積占心臟面積的百分比。

1.6 FVB/N小鼠超聲心動圖的檢測

在最后1次給予ISO的第1天對小鼠進行超聲心電圖檢測。使用高分辨率小動物超聲儀VisualSonics Vevo770及RMV707B高頻線控探頭(加拿大VISUALSONIC公司)采集FVB/N小鼠在1.5%異氟烷麻醉時的超聲心動圖像。將適量超聲耦合劑涂抹于小鼠胸部，采用Vevo770超聲儀，15 Hz探頭探測胸骨旁左心室長軸切面、胸骨旁左心室短軸切面及四腔切面。測量小鼠舒張末期左心室后壁厚度(diastolic left ventricular posterior wall thickness，LVPW；d)、舒張末期左心室后壁厚度(systolic left ventricular posterior wall thickness，LVPW；s)、舒張末期左心室內徑(left ventricular end-diastolic inner-diameter，LVID；d)和收縮末期左心室內徑(left ventricular end-systolic inner-diameter，LVID；s)及二尖瓣血流E峰/二尖瓣環(huán)組織多普勒E′峰(E/E′)等值。并計算左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。每項參數(shù)均取連續(xù)3個心動周期的平均值。

1.7 心肌細胞橫截面積檢測

將心臟切片進行HE染色，高倍鏡下拍照，隨機選取視野6～8個，用Image Pro plus 軟件分析心肌細胞橫截面積。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 性別對ISO誘導的急性心肌損傷的影響

LDH在心肌細胞中的含量遠高于其在血清中的含量，當心肌細胞受損破裂時，LDH釋放入血，血清中的LDH活性增高。故LDH的活性可反映心肌細胞受損的情況。ISO組中LDH的活性明顯高于對照組，且雄性ISO組的LDH活性顯著高于雌性ISO組(圖1 A)。

ROS是氧化應激的重要指標，而氧化應激可進一步加重心肌損傷。因此，心臟ROS的生成也可在一定程度上反映心肌受損的情況。給予FVB/N小鼠大劑量ISO后，雄鼠ISO組心臟組織切片的ROS生成明顯增加，而雌鼠ISO組心臟組織切片的ROS生成無明顯增加(圖1B、C)。

2.2 性別對ISO誘導的急性心肌損傷后心臟肥大的影響

LVPW；d、HW/TL、HW/BW和心肌細胞橫截面積均是衡量心肌肥厚的重要指標。ISO組小鼠的LVPW；d、HW/TL、HW/BW和心肌細胞橫截面積均高于對照組小鼠，且差異有統(tǒng)計學意義。同時，雄性ISO組小鼠的LVPW；d(圖2A、C)、心肌細胞橫截面積(圖2B、F)、HW/TL(圖2D)、HW/BW(圖2E)均明顯高于雌性ISO組小鼠。

A：LDH活性統(tǒng)計圖；B：ROS生成統(tǒng)計圖；C：小鼠心臟組織切片DHE染色代表圖；aP<0.05，bP<0.01圖1 性別對ISO誘導的小鼠急性心肌損傷的影響(n=8)

2.3 性別對ISO誘導的急性心肌損傷后心臟纖維化的影響

給予FVB/N小鼠急性大劑量ISO后，運用苦味酸-天狼星紅染色方法檢測并未發(fā)現(xiàn)明顯的心臟纖維化，性別對心臟纖維化也無影響(圖3)。

2.4 性別對ISO誘導的急性心肌損傷后心功能的影響

LVEF與LVFS是評價心臟收縮功能的重要指標。結果顯示，ISO組小鼠的LVEF與LVFS與對照組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義，雄性ISO組小鼠和雌性ISO組小鼠之間的收縮功能差異亦無統(tǒng)計學意義(圖4A、B)。E/E′常被用來評價心臟舒張功能，實驗結果顯示ISO組小鼠與對照組小鼠的舒張功能差異無統(tǒng)計學意義，雄性ISO組小鼠與雌性ISO組小鼠的心臟舒張功能差異亦無統(tǒng)計學意義(圖4C、D)。因此，本模型中大劑量ISO誘導的急性心肌損傷并未對心功能造成影響，性別對心功能也無明顯影響。

A：胸骨旁短軸M超代表圖；B：心肌細胞橫截面積代表圖；C：LVPW；d統(tǒng)計圖；D：HW/TL統(tǒng)計圖；E：HW/BW統(tǒng)計圖；F：心肌細胞橫截面積統(tǒng)計圖；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001圖2 性別對ISO誘導的小鼠急性心肌損傷后心臟肥大的影響(n=8)

A：天狼猩紅染色代表圖，紅色代表膠原部分；B：心臟纖維化面積統(tǒng)計圖，組間比較差異無統(tǒng)計學意義圖3 性別對ISO誘導的小鼠急性心肌損傷后心臟纖維化的影響(n=8)

A：LVEF統(tǒng)計圖；B：LVFS統(tǒng)計圖；C：E/E′統(tǒng)計圖；D：二尖瓣血流及二尖瓣環(huán)處組織多普勒代表圖；各組間比較差異無統(tǒng)計學意義圖4 性別對ISO誘導的小鼠急性心肌損傷后心功能的影響(n=8)

3 討論

一些臨床研究提示性別是影響心血管疾病預后的因素之一[1-3]，但臨床研究中都是有很多因素同時存在，其中性別因素的具體作用及機制還不清楚，仍需要大量的基礎研究去探索。已有研究報道，給予慢性的ISO刺激誘導心臟重構，雌鼠心臟肥厚及纖維化的程度均低于雄鼠[8]。而不同性別在ISO誘導的急性心肌損傷中是否會有不同表現(xiàn)還尚無研究報道，心臟結構與功能是心臟疾病的重要評價指標，故本實驗選用大劑量ISO誘導小鼠急性心肌損傷模型，進而研究性別對其心臟結構與功能的影響。

不少研究提示給予短期、大劑量ISO可導致心臟急性損傷，導致心肌細胞破裂、心臟肥厚發(fā)生[9-10]。本研究結果提示，在給予短期、大劑量ISO后，雄性小鼠心肌細胞的破裂及心臟肥厚的發(fā)生均比雌性小鼠更嚴重。而氧化應激是導致心臟肥厚發(fā)生的機制之一[11-12]，本研究中，雄鼠ISO組的心臟ROS生成明顯高于雌鼠ISO組，這可以部分解釋本研究結果中雄鼠ISO組的心臟肥厚比雌鼠ISO組嚴重。之前也有研究提示，雌鼠的心肌細胞更耐受氧化應激的損害[13]，這進一步支持了我們的研究結果。

但我們的實驗結果也顯示，性別差異對本模型中的心臟收縮功能與舒張功能沒有影響，值得注意的是，本模型中給予小鼠短期、大劑量ISO后心臟收縮功能與舒張功能都沒有明顯變化。這提示，這個階段心功能仍處于代償期。另外，本模型中給予FVB/N雌雄小鼠短期、大劑量ISO也未引起明顯的纖維化，而一些研究提示較長時程的ISO刺激可以引起纖維化[14-15]，結果的不同可能與給藥的時程、劑量相關，也可能與實驗動物種屬相關[16]。

不少研究已證實，雌激素在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[17-18]，而ISO誘導的急性心肌損傷與β-腎上腺素受體的過度激動密切相關。也有研究提示，β-腎上腺素受體的調控與雌激素相關，長期的雌激素刺激可以減弱β-腎上腺素受體的反應[19]。因此，雌雄小鼠在ISO誘導的急性心肌損傷中的不同表現(xiàn)，可能與雌激素的作用相關。

利益沖突：無

[1] Pelletier R，Choi J，Winters N，et al.Sex Differences in Clinical Outcomes After Premature Acute Coronary Syndrome [J].Can J Cardiol，2016，32(12)：1447-1453.DOI：10.1016/j.cjca.2016.05.018.

[2] Edmund Anstey D，Li S，Thomas L，et al.Race and Sex Differences in Management and Outcomes of Patients After ST-Elevation and Non-ST-Elevation Myocardial Infarct：Results From the NCDR [J].Clin Cardiol，2016，9(10)：585-595.DOI：10.1002/clc.22570.

[3] Thang ND，Karlson BW，Karlsson T，et al.Characteristics of and outcomes for elderly patients with acute myocardial infarction：differences between females and males [J].Clin Interv Aging，2016，21(11)：1309-1316.DOI：10.2147/CIA.S110034.

[4] Dobson LE，F(xiàn)airbairn TA，Plein S，et al.Sex Differences in Aortic Stenosis and Outcome Following Surgical and Transcatheter Aortic Valve Replacement [J].J Womens Health (Larchmt)，2015，24(12)：986-995.DOI：10.1089/jwh.2014.5158.

[5] Nichtova Z，Novotova M，Kralova E，et al.Morphological and functional characteristics of models of experimental myocardial injury induced by isoproterenol [J].Gen Physiol Biophys，2012，31(2)：141-151.DOI：10.4149/gpb_2012_015.

[6] Kuok QY，Yeh CY，Su BC，et al.The triterpenoids of Ganoderma tsugae prevent stress-induced myocardial injury in mice [J].Mol Nutr Food Res，2013，57(10)：1892-1896.DOI：10.1002/mnfr.201200704.

[7] Stanely Mainzen Prince P，Roy AJ.p-Coumaric acid attenuates apoptosis in isoproterenol-induced myocardial infarcted rats by inhibiting oxidative stress [J].Int J Cardiol，2013，168(4)：3259-3266.DOI：10.1016/j.ijcard.2013.04.138.

[8] Zhu B，Liu K，Yang C，et al.Gender-related differences in β-adrenergic receptor-mediated cardiac remodeling [J].Can J Physiol Pharmacol，2016，94(12)：1349-1355.DOI：10.1139/cjpp-2016-0103.

[9] Wallner M，Duran JM，Mohsin S，et al.Acute Catecholamine Exposure Causes Reversible Myocyte Injury Without Cardiac Regeneration [J].Circ Res，2016，119(7)：865-879.DOI：10.1161/CIRCRESAHA.116.308687.

[10] Song F，Li H，Sun J，et al.Protective effects of cinnamic acid and cinnamic aldehyde on isoproterenol-induced acute myocardial ischemia in rats [J].J Ethnopharmacol，2013，150(1)：125-130.DOI：10.1016/j.jep.2013.08.019.

[11] Zhang Y，Xu J，Long Z，et al.Hydrogen (H2) Inhibits Isoproterenol-Induced Cardiac Hypertrophy via Antioxidative Pathways [J].Front Pharmacol，2016，27(7)：392.DOI：10.3389/fphar.2016.00392.

[12] Lucas AM，Caldas FR，da Silva AP，et al.Diazoxide prevents reactive oxygen species and mitochondrial damage，leading to anti-hypertrophic effects [J].Chem Biol Interact，2017，5(261)：50-55.DOI：10.1016/j.cbi.2016.11.012.

[13] Wang F，He Q，Sun Y，et al.Female adult mouse cardiomyocytes are protected against oxidative stress [J].Hypertension，2010，55(5)：1172-1178.DOI：10.1161/HYPERTENSIONAHA.110.150839.

[14] Deshpande M，Mali VR，Pan G，et al.Increased 4-hydroxy-2-nonenal-induced proteasome dysfunction is correlated with cardiac damage in streptozotocin-injected rats with isoproterenol infusion[J].Cell Biochem Funct，2016，34(5)：334-342.DOI：10.1002/cbf.3195.

[15] Grimm M，Ling H，Willeford A，et al.CaMKIIδ mediates β-adrenergic effects on RyR2 phosphorylation and SR Ca(2+) leak and the pathophysiological response to chronic β-adrenergic stimulation [J].J Mol Cell Cardiol，2015，85：282-291.DOI：10.1016/j.yjmcc.2015.06.007.

[16] Yang CZ，Tian AJ，Meng ZH，et al.Establishment of a FVB/N mouse model of cardiac hypertrophy by isoprenaline [J].Beijing Da Xue Xue Bao，2014，46(6)：906-910.

[17] Kyt? V，Sipil? J，Rautava P.Gender-specific and age-specific differences in unstable angina pectoris admissions：a population-based registry study in Finland [J].BMJ Open，2015，5(10)：e009025.DOI：10.1136/bmjopen-2015-009025.

[18] Litwin SE，Katz SE，Litwin CM，et al.Gender differences in postinfarction left ventricular remodeling [J].Cardiology，1999，91(3)：173-183.DOI：6906.

[19] Wagner HR，Crutcher KA，Davis JN.Chronic estrogen treatment decreases beta-adrenergic responses in rat cerebral cortex[J].Brain Res，1979，171(1)：147-151.

(本文編輯：譚瀟)

Effects of gender on cardiac structure and function after acute myocardial injury in mice

QiaoYuhui，ZhuBaoling，LiZijian

InstituteofVascularMedicine，PekingUniversityThirdHospital；KeyLaboratoryofCardiovascularMolecularBiologyandRegulatoryPeptides，MinistryofHealth；KeyLaboratoryofMolecularCardiovascularScience，MinistryofEducation；BeijingKeyLaboratoryofCardiovascularReceptorsResearch，Beijing100191，China

Correspondingauthor：LiZijian，Email：lizijian@bjmu.edu.cn

Objective To investigate the differences of cardiac structure and function between different sexes after isoprenaline(ISO)-induced acute myocardial injury. Methods ISO(200 mg· kg-1·d-1，3 d)was injected subcutaneously to FVB/N female and male mice with the same age.The cardiac structure and function were measured by echocardiography.The activity of serum lactate dehydrogenase(LDH)and reactive oxygen species(ROS)in cardiac tissue were detected.The end-diastolic left ventricular wall thickness(LVPW；d)，the ratio of heart weight to body weight(HW/BW)，the ratio of heart weight to tibial length(HW/TL)and the area of myocardial cells were adopted as cardiac hypertrophy indexes.Cardiac fibrosis was detected by sirius red staining method. Results ISO(200 mg·kg-1·d-1，3 d)could significantly increase the activity of serum LDH and the increase was significantly higher in male mice than in female mice.Short-term administration of high-dose ISO could increase the generation of ROS in cardiac tissue sections of male mice significantly but had little effect on that of female mice.In addition，Short-term administration of high-dose ISO induced cardiac hypertrophy in female and male mice，and the degree of hypertrophy of male mice was significantly higher than that of female mice.While Short-term administration of high-dose ISO could neither induce cardiac fibrosis nor influence cardiac function in both female and male mice. Conclusions In the model of acute myocardial injury induced by ISO，the degree of cardiac hypertrophy in male mice was significantly higher than that in female mice.One reason of which may be related to ROS.There was no significant difference in cardiac function between male and female mice in this model.

Gender； Isoproterenol； Acute myocardial injury； Cardiac structure and function

李子健，電子信箱：lizijian@bjmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1007-5410.2017.02.013

國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(973)計劃(2014CBA02000)；國家自然科學基金項目(81471893，81270157，81070078，91539123)

2017-02-07)